毓麟珠對早發(fā)性卵巢功能不全模型小鼠卵巢形態(tài)、卵泡發(fā)育及mTOR信號通路的影響

董曉英 馮遜遜 鄭秀蕊 崔碩 周文媛 曹婉寧

摘要：目的??觀察毓麟珠對早發(fā)性卵巢功能不全（POI）小鼠卵巢功能、卵泡發(fā)育及mTOR通路的影響，探討其作用機制。方法??以小鼠透明帶3（Zp3）為抗原，皮下多點注射BALB/c雌性小鼠建立免疫性POI模型。實驗分為空白組、模型組、陽性藥組和毓麟珠低、中、高劑量，各給藥組給予相應(yīng)藥物。HE染色觀察小鼠卵巢形態(tài)及卵泡，ELISA檢測小鼠血清激素水平，Western blot檢測卵巢組織AKT、mTOR的蛋白表達(dá)，PCR檢測mTOR下游相關(guān)Rheb、S6k1、4E-BP1的mRNA表達(dá)。結(jié)果??與空白組比較，模型組小鼠卵巢明顯縮小，卵泡數(shù)量明顯減少，血清促卵泡生成素（FSH）、促黃體生成素（LH）明顯升高，抗苗勒氏管激素（AMH）、雌二醇（E₂）明顯下降，Rheb、S6k1、4E-BP1 mRNA和AKT、mTOR蛋白相對表達(dá)量明顯降低（P<0.05，P<0.01）;與模型組比較，各給藥組小鼠卵巢增大，卵泡數(shù)量增加，血清FSH、LH均下降，AMH、E₂均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）;小鼠卵巢mTOR蛋白表達(dá)及其下游相關(guān)Rheb、S6k1、4E-BP1 mRNA表達(dá)均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。結(jié)論 ?毓麟珠治療POI機制可能與調(diào)節(jié)mTOR信號通路相關(guān)因子基因和蛋白表達(dá)水平有關(guān)，通過促進卵泡發(fā)育，改善卵巢功能。

關(guān)鍵詞：毓麟珠;早發(fā)性卵巢功能不全;卵泡發(fā)育;mTOR;小鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.10.012

中圖分類號：R285.5 ???文獻標(biāo)識碼：A ???文章編號：1005-5304（2018）10-0049-05

Effects of Yulin?Pills on?Ovarian Morphology， Follicle Development and mTOR Signaling Pathway of Mice with Primary Ovarian Insufficiency

DONG Xiao-ying¹， FENG Xun-xun²， ZHENG Xiu-rui²， CUI Shuo²， ZHOU Wen-yuan²， CAO Wan-ning²

1. School of Traditional Chinese Medicine， Capital Medical University， Beijing 100069， China; 2. School of Basic Medicine， Capital Medical University， Beijing 100069， China

Abstract： Objective To observe the effects of Yulin Pills on ovarian morphology， follicle development and mTOR signaling pathway of mice with primary ovarian insufficiency （POI）; To discuss its mechanism of action. Methods Using mouse zona pellucida 3 （Zp3） as an antigen， BALB/c female mice were injected subcutaneously to establish immunological POI models. Mice were divided into blank group， model group， positive medicine group， and Yulin Pills low-， medium-， and high-dose groups. Each administration group was given relevant medicine. The ovarian morphology and follicles of mice were observed by HE staining， and serum hormone levels were measured by ELISA. Protein expressions of mTOR and AKT in mice ovarian were detected by Western blot. Expressions of Rheb， S6k1 and 4E-BP1 mRNA in mice ovarian were detected by PCR. Results Compared with the blank group， the ovary was significantly reduced and the number of follicles decreased significantly in the model group; FSH and LH increased significantly; AMH and E₂?decreased significantly; The relative expressions of Rheb， S6k1， 4E-BP1 mRNA and AKT， mTOR protein were significantly reduced （P<0.05， P<0.01）. Compared with the model group， ovaries increased， follicles increased， serum FSH and LH decreased， and AMH and E₂?increased in administration groups， with statistical significance （P<0.05， P<0.01）. The protein expression of mTOR and the expressions of downstream Rheb， S6k1， and 4E-BP1 mRNA in ovary increased， with statistical significance （P<0.05， P<0.01）. Conclusion Yulin Pills has therapeutic effects on POI， and itsmechanism may be related to the regulation of mTOR signaling pathway-related factor genes and protein expression levels， which can improve ovarian function to promote follicular development.

Keywords：?Yulin Pills; primary ovarian insufficiency; follicular; mTOR; mice

早發(fā)性卵巢功能不全（primary ovarian insufficiency，POI）是指卵巢功能不全所導(dǎo)致的40歲之前卵巢活動衰退的臨床綜合征。特點是月經(jīng)紊亂伴隨血促性腺激素濃度升高和雌激素濃度降低，包含卵巢內(nèi)卵泡功能障礙或原始卵泡耗竭兩個過程^[1]。POI屬卵巢早衰（POF）的前期，相對于POF在治療上有更多逆轉(zhuǎn)的空間。近年來，POI因其發(fā)病率逐漸增高引起了廣泛關(guān)注。目前，西醫(yī)治療該病以激素替代為主，但不能有效促進卵泡發(fā)育^[2]，而中藥治療卵巢功能下降在臨床取得了較好的療效^[3]。

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，mTOR通路與卵泡的生長、發(fā)育及增殖有關(guān)^[4]。其中mTORC1通過磷酸化下游靶蛋白激酶，介導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)量控制和蛋白質(zhì)合成。mTORC2通過磷酸化蛋白激酶，進而參與細(xì)胞的存活與增殖，因此，mTOR通路為促存活通路。本實驗建立免疫性POI小鼠動物模型，選擇補腎育卵古方毓麟珠（《景岳全書·婦人規(guī)》），觀察其對免疫性POI模型小鼠卵巢形態(tài)、卵泡發(fā)育及mTOR信號通路的影響，探討其防治小鼠POI作用的分子機制。

1 ?實驗材料

1.1 ?動物

SPF級BABL/c雌性小鼠60只，7～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，北京維通利達(dá)實驗動物中心，動物合格證號SCXK（京）2012-0001。飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)科研樓屏障動物房，自由攝食飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，觀察動情周期。

1.2 ?藥物及制備

毓麟珠（當(dāng)歸12 g，熟地黃12 g，菟絲子12 g人參6 g，麩炒白術(shù)6 g，茯苓6 g，白芍6 g，杜仲6 g，鹿角霜6 g，花椒6 g，川芎3 g，炙甘草3 g），飲片購自北京同仁堂科技股份有限公司，按常規(guī)方法煎煮、濃縮，一次性煎出，按“人和動物體表面積折算的等效劑量比率表”配制低、中、高劑量藥液，分別為每毫升含原藥材0.234、0.468、0.936 g，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。戊酸雌二醇片，拜耳藥業(yè)，批號219A2，按l mg/（人·d），根據(jù)小鼠與人的體表面積進行換算，用三蒸水溶解藥片，制成溶液，調(diào)整濃度，每毫升溶液含戊酸雌二醇0.009 mg。

1.3 ?主要試劑與儀器

小鼠透明帶多肽溶液：根據(jù)小鼠透明帶3（Zp3）的第 330～342個氨基酸序列，合成透明帶多肽，分析純度>90%，杭州多肽生化有限公司;血清促卵泡生成素（FSH）、抗苗勒氏管激素（AMH）、促黃體生成素（LH）及雌二醇（E₂）ELISA試劑盒，北京博奧森生物技術(shù)有限公司;弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑，美國Sigma公司。病理組織切片機（LEICARM2025，德國Leica公司），高分辨顯微鏡（BX43，日本奧林巴斯公司），電子天平 （FAZ104，上海速展計量儀器有限公司），生物組織自動脫水機（TS-12F，湖北省孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器廠），病理組織包埋機和包埋冷凍臺（BMJ-M，常州市中威電子儀器有限公司），自動放免測量儀（FT-613，北京核儀器廠），Thermo酶標(biāo)儀（MK3，上海賽默生物科技發(fā)展有限公司），熒光定量PCR儀、轉(zhuǎn)移電泳槽（VE-186，上海天能公司），電泳儀（PowerpacHC，美國伯樂高公司）。

2 ?實驗方法

2.1 ?造模

雌性小鼠均經(jīng)陰道脫落細(xì)胞涂片篩查，性周期正常。隨機挑選10只作為空白組，其余50只用于造模。稱取6 mg ZP3透明帶多肽粉末，加6 mL雙蒸水配成溶液，與弗氏完全佐劑按1∶1比例配制免疫試劑，與弗氏不完全佐劑按1∶1比例制成免疫強化試劑。按文獻[5]方法小鼠予0.15 mL/只免疫試劑多點注射腹腔皮下，14 d后予免疫強化試劑0.15 mL/只再次多點注射小鼠腹腔皮下加強免疫?？瞻捉M每次造模時予0.15 mL/只生理鹽水注射腹腔皮下。注射完成后，觀察小鼠腹部腫脹情況，判斷造模試劑吸收情況。

2.2 ?分組及給藥

成模后50只小鼠隨機分為模型組、陽性藥組和毓麟珠高、中、低劑量組，每組10只。于造模后15 d開始灌胃給藥，空白組和模型組給予生理鹽水0.3 mL/次，陽性藥組給予戊酸雌二醇片水溶液0.3 mL/次，毓麟珠高、中、低劑量組給予藥混懸液0.3 mL/次。1次/d，連續(xù)6周（每周休息1 d）。

2.3 ?取材

給藥前稱重，之后每周稱重并記錄，第43日標(biāo)本處理取材前再稱重，心臟穿刺取血，處死動物，常規(guī)無菌方法留取卵巢、子宮稱重，將一側(cè)卵巢組織迅速投入液氮中，另一側(cè)放入甲醛固定，待用。

2.4 ?雙側(cè)卵巢相對質(zhì)量測定

常規(guī)無菌方法留取卵巢、子宮，用冰冷生理鹽水清潔，濾紙干燥，然后稱重，計算小鼠器官相對質(zhì)量[器官質(zhì)量（mg）÷體質(zhì)量（g）]

2.5 ?HE染色

將甲醛固定的卵巢組織梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片，脫蠟，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察。

2.6 ?血清促卵泡生成素、抗苗勒氏管激素、促黃體生成素及雌二醇測定

將小鼠血液標(biāo)本靜置，離心，取血清，ELISA檢測FSH、AMH、LH和E₂的含量。嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

2.7 ?Western blot檢測卵巢組織AKT、mTOR蛋白表達(dá)

提取小鼠卵巢組織蛋白，測定蛋白濃度，進行SDS-PAGE，然后轉(zhuǎn)膜。將PVDF膜以3%BSA 37 ℃封閉1 h，再分別用AKT和mTOR兔抗鼠多克隆抗體（1∶200）37 ℃孵育1.5 h，洗膜，加ALP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶500）37 ℃孵育1 h。然后加NBT/BCIP避光顯色。以β-actin作為內(nèi)參照，應(yīng)用IPP6.0軟件分析。

2.8 ?實時熒光定量PCR檢測卵巢組織Rheb、S6k1、4E-BP1 mRNA表達(dá)

按照常規(guī)方法提取小鼠卵巢組織RNA，提取后RNA進行濃度測定，使用2 μg RNA進行反轉(zhuǎn)錄，體系為50?μL。反應(yīng)結(jié)束后，進行RT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，分析Ct值，以GAPDH為內(nèi)參照，采用2^-ΔΔCt法分析。

3 ?統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以x（—）±s表示，數(shù)據(jù)先做正態(tài)分布檢驗。若符合正態(tài)分布，組間差異比較采用方差分析，方差齊用LSD法，方差不齊采用Tamhane'T2法;若不符合正態(tài)分布則采用非參數(shù)統(tǒng)計中多個獨立樣本Kruskal-Wallis H檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 ?結(jié)果

4.1 ?小鼠模型評價

小鼠陰道涂片觀察顯示，空白組小鼠動情周期正常，模型組小鼠動情周期發(fā)生紊亂。肉眼觀察，可見空白組小鼠陰道分泌物黏稠呈拉絲狀，模型組小鼠陰道分泌物較為稀薄。鏡下觀察，可見空白組小鼠動情期細(xì)胞較為均質(zhì)，角化上皮細(xì)胞呈落葉狀堆積;模型組小鼠動情周期紊亂，動情期細(xì)胞不均質(zhì)，有多種細(xì)胞混雜，如角化上皮細(xì)胞、白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等。

4.2 ?毓麟珠對模型小鼠卵巢組織形態(tài)的影響

肉眼觀察發(fā)現(xiàn)，造模后小鼠卵巢體積較空白組明顯縮小，且形態(tài)細(xì)長，模型組可見部分卵巢組織與周圍組織粘連。光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，與空白組比較，模型組小鼠卵巢體積減小，卵泡數(shù)量減少，卵巢間質(zhì)淋巴細(xì)胞浸潤，部分透明帶縮小，顆粒細(xì)胞排列紊亂，卵細(xì)胞形態(tài)畸形，縮小或消失;與模型組比較，各給藥組，卵巢大小有所增加，卵泡數(shù)量增加，卵細(xì)胞形態(tài)改善，毓麟珠高劑量組改善最明顯。見圖1。

4.3 ?毓麟珠對模型小鼠體質(zhì)量及器官相對質(zhì)量的影響

各組小鼠體質(zhì)量變化不顯著。與空白組比較，模型組小鼠卵巢、子宮質(zhì)量均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）;與模型組比較，陽性藥組和毓麟珠高、中、低劑量組小鼠卵巢、子宮質(zhì)量均增加，部分差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，P<0.01），各給藥組小鼠卵巢相對質(zhì)量均增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，P<0.01），各給藥組小鼠子宮質(zhì)量和子宮相對質(zhì)量有不同程度增加，毓麟珠中劑量組增加最明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果見表1。

4.4 ?毓麟珠對模型小鼠血清促卵泡生成素、促黃體生成素、抗苗勒氏管激素和雌二醇水平的影響

與空白組比較，模型組小鼠血清FSH、LH明顯升高，AMH、E₂明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）;與模型組比較，各給藥組小鼠血清FSH、LH均下降，AMH、E₂均升高，部分差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見表2。

4.5 ?毓麟珠對模型小鼠卵巢組織mTOR、AKT 蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組小鼠卵巢組織mTOR、AKT蛋白表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）;與模型組比較，毓麟珠高劑量組和陽性藥組小鼠卵巢組織mTOR、AKT蛋白表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)果見圖2、表3。

4.6 ?毓麟珠對模型小鼠卵巢組織Rheb、S6k1、4E-BP1 mRNA表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組小鼠卵巢組織Rheb、S6k1、4E-BP1 mRNA表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）;與模型組比較，各給藥組小鼠卵巢組織Rheb、S6k1、4E-BP1 mRNA表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見表4。

5 ?討論

研究表明，mTOR通路參與細(xì)胞生長、增殖和分化的調(diào)節(jié)，與卵泡發(fā)育關(guān)系密切^[6]。其上游AKT下調(diào)細(xì)胞凋亡過程，還可促進細(xì)胞進入增殖周期。mTOR的激活與PI3K密切相關(guān)，AKT是PI3K的下游效應(yīng)因子，AKT同時也是mTOR激活的關(guān)鍵因子，雌激素能夠激活PI3K的活性，導(dǎo)致E₂和LH的水平變化，進一步反饋性調(diào)節(jié)FSH、LH的分泌。mTOR主要通過調(diào)節(jié)這2個靶蛋白對蛋白質(zhì)的翻譯進行調(diào)控，加速細(xì)胞G1/S期的轉(zhuǎn)換，促進細(xì)胞生長和增殖，激活mTORC1，增強其下游Rheb、S6k1、4E-BP1的活性來增強卵母細(xì)胞內(nèi)的蛋白轉(zhuǎn)錄，促進卵泡的發(fā)育，說明mTOR信號通路參與調(diào)控哺乳類動物卵巢卵母細(xì)胞的激活過程^[7]。

毓麟珠源自《景岳全書·婦人規(guī)》，為調(diào)經(jīng)種子之方，該方由八珍丸加菟絲子、杜仲、鹿角霜、花椒組成。方中四君益氣，有陽動之性;四物養(yǎng)血活血，有陰靜之能;菟絲子、鹿角霜、杜仲、花椒有溫養(yǎng)之勢，既可助四君溫腎陽益火之源，改善卵巢血流動力，發(fā)揮“形不足者溫之以氣”之功，又可助四物滋腎陰壯水之主，改善卵泡質(zhì)量，發(fā)揮“精不足者補之以味”之效，達(dá)到恢復(fù)卵巢功能的目的。臨床應(yīng)用此方加減治療POF取得很好療效，尤其對于卵巢功能下降所致的不孕效果更佳。前期課題組研究表明，毓麟珠通過上調(diào)卵泡及卵巢間質(zhì) Bcl-2蛋白的表達(dá)，下調(diào)Bax蛋白的表達(dá)，抑制卵泡的過快凋亡，從而改善卵巢功能^[8]。

本研究發(fā)現(xiàn)，免疫性POI小鼠FSH升高，AMH下降，抑制了mTOR信號通路活性，卵巢變小，質(zhì)量下降，卵泡數(shù)量減少。給予毓麟珠6周后，通過溫腎陽益火之源使mTOR信號通路中mTOR、AKT蛋白表達(dá)量增加，提示造模藥物可下調(diào)模型組小鼠卵巢組織蛋白水平，抑制信號通路的活性，而毓麟珠可上調(diào)模型大鼠卵巢組織mTOR、AKT蛋白水平，激活信號通路，促進卵泡發(fā)育。通過滋腎陰壯水之主使其下游Rheb、S6k1、4E-BP1 mRNA表達(dá)量升高，促使E₂分泌恢復(fù)到正常水平，促進AMH恢復(fù)，使FSH逐漸下降，卵泡數(shù)量增加，卵巢功能改善，對POI的防治有促進作用。說明毓麟珠通過補腎育卵之效激活mTOR通路，對改善卵泡微環(huán)境有促進作用，方中諸多藥物如熟地黃、菟絲子、杜仲、人參等通過補腎益氣，增強卵巢分泌功能及機體免疫力，并延緩衰老;當(dāng)歸、川芎養(yǎng)血活血能改善卵巢血流。前期臨床研究顯示，該方調(diào)節(jié)卵巢分泌功能，對于脾腎陽虛型POF卵巢功能改善作用明顯^[9]，本研究結(jié)果也進一步闡釋了其作用機制。

綜上所述，毓麟珠可通過提高mTOR信號通路的相關(guān)蛋白的活性，正常發(fā)揮其促增殖分化的生物學(xué)作用，促進顆粒細(xì)胞增殖，分泌性激素，抑制卵泡過度閉鎖，進而促進卵泡的生長發(fā)育，使受損的卵巢功能得以修復(fù)，成為增加原始卵泡儲備、延長卵巢壽命及治療卵巢相關(guān)疾病的一個重要靶點。結(jié)合離體研究的其他指標(biāo)，為中藥防治POI、改善卵泡發(fā)育的研究提供了依據(jù)，也為進一步分析中藥的作用靶標(biāo)及其分子生物學(xué)機制的深入研究奠定了基礎(chǔ)。

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