腦血管病環(huán)狀RNA的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控及展望*

劉燕芳， 逯 丹， 徐安定

(暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科， 廣東 廣州 510630)

環(huán)狀RNA(circular RNAs，circRNAs)是一類存在于多種生物體內(nèi)通過共價鍵結(jié)合的閉合環(huán)狀非編碼RNA。circRNAs性質(zhì)穩(wěn)定，不易被核酸酶水解，廣泛存在于不同器官組織中并呈現(xiàn)出時空特異性和組織特異性[1]。近年來，隨著現(xiàn)代生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展，circRNAs的生成機制及生物學(xué)特性已為越來越多的學(xué)者所熟知，但其對靶基因表達的調(diào)控作用還不甚明朗。根據(jù)基因來源的不同，circRNAs可以分為3種：外顯子來源的circRNAs，外顯子內(nèi)含子共同來源的circRNAs(exon-intron circRNAs，ElciRNAs)和內(nèi)含子來源的[2]。研究表明，circRNAs廣泛存在于神經(jīng)系統(tǒng)組織中[3]，參與并影響包括炎癥、氧化應(yīng)激、線粒體功能紊亂和細(xì)胞調(diào)亡等多種卒中后病理生理過程[4]，毫無疑問，卒中相關(guān)circRNAs的出現(xiàn)為卒中后發(fā)生發(fā)展機制提供了理論基礎(chǔ)，為腦血管疾病的診斷和治療提供了新的思路。

1 circRNAs在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的調(diào)控作用

1.1海綿吸附微小RNAs(microRNAs，miRNAs)和RNA結(jié)合蛋白(RNA-binding proteins，RBPs)參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控 circRNAs廣泛存在于哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)組織，特別是突觸中含量最高[3]，而突觸活性與神經(jīng)元mRNA的翻譯和神經(jīng)系統(tǒng)疾病等密切相關(guān)[5-7]。Westholm等[8]和Gruner等[9]均證實circRNAs的含量會隨著神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和老化而增多，提示circ-RNAs可能參與了神經(jīng)元的發(fā)育分化，并在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病病理生理過程中扮演了重要角色。

miRNAs是基因轉(zhuǎn)錄的重要調(diào)節(jié)因子，通過與安格蛋白(argonaute，AGO)結(jié)合于mRNA非轉(zhuǎn)錄區(qū)域調(diào)控mRNA表達[10]。circRNAs作為內(nèi)源性RNA可以與其它內(nèi)源性RNA競爭結(jié)合miRNAs從而影響靶基因的表達?，F(xiàn)今研究最為深入的當(dāng)屬ciRS-7(circRNA sponges of miRNA-7)/miRNA-7，Memczak等[11]發(fā)現(xiàn)在海斑魚體內(nèi)過表達ciRS-7與miRNA-7基因敲除作用類似，證實了circRNAs對miRNAs的海綿吸附作用。

Hanse等[10]發(fā)現(xiàn)在小鼠神經(jīng)元和海馬組織中ciRS-7有超過70個miRNA-7結(jié)合位點。泛素蛋白連接酶A(ubiquitin protein ligase A，UBE2A)是一種與自噬吞噬有關(guān)的泛素化連接酶，它可以吞噬阿爾茨海默癥(Alzheimer’s disease，AD)和中樞系統(tǒng)退行性疾病產(chǎn)生的淀粉樣蛋白，阻礙AD患者疾病的進展，Lukiw等[12]發(fā)現(xiàn)在AD病人腦組織中ciRS-7的缺損可以上調(diào)miRNA-7的量，從而抑制了miRNA-7靶標(biāo)UBE2A的生成，影響AD疾病進展。α-突觸核蛋白是介導(dǎo)帕金森病的重要病理生理學(xué)機制，miRNA-7能夠減緩α-突觸核蛋白的毒性蓄積作用[10]，延緩帕金森病進程。miRNA-7還能夠靶向調(diào)節(jié)下游膠質(zhì)瘤相關(guān)Akt通路，抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長[13]。ciRS-7含有多個miRNA海綿吸附位點，不僅可以與miRNA-7結(jié)合，也可與miRNA-671結(jié)合從而調(diào)節(jié)miRNA-7的活性[10]，同時miRNA-671還可以作為lncRpa和circRar1的靶標(biāo)介導(dǎo)鉛引起的神經(jīng)元凋亡[14]，提示ciRS-7可直接或間接影響多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病相應(yīng)病理生理過程。

不僅如此，circRNAs亦能與AGO，RNA聚合酶Ⅱ[15]和MBL(musclebind )[16]等RBPs相互作用，與RBPs底物競爭其結(jié)合位點干擾靶基因的轉(zhuǎn)錄。TAR DNA結(jié)合蛋白(TDP-43)是泛素化的重要組成元件， 肌萎縮側(cè)索硬化的發(fā)生與TDP-43的積累密切相關(guān)，一些ciRNAs可減緩TDP-43蓄積產(chǎn)生的毒性[17]，提示ciRNAs可以通過結(jié)合相關(guān)蛋白干擾基因表達，甚至能夠延緩肌萎縮側(cè)索硬化進展。研究表明，生成circRNAs的環(huán)化過程和經(jīng)典剪接是相互競爭的[16]，circMBL的側(cè)翼內(nèi)含子可以結(jié)合MBL蛋白，MBL蛋白又可以影響mRNA的剪接，最終circRNAs通過結(jié)合MBL蛋白影響經(jīng)典剪接。

circ-Foxo3是由轉(zhuǎn)錄因子Foxo3編碼而來，能夠捕獲細(xì)胞周期蛋白2和周期蛋白依賴性激酶抑制物 p21從而抑制細(xì)胞增殖[18]。此外，Du等[19]發(fā)現(xiàn)circ-Foxo3與抗衰老蛋白ID-1及應(yīng)激相關(guān)蛋白FAK和缺氧誘導(dǎo)因子1α結(jié)合，能夠抑制細(xì)胞衰老，抵抗壓力應(yīng)激，均表明circRNAs與蛋白結(jié)合參與多種重要病理生理過程。

1.2調(diào)控基因表達 研究發(fā)現(xiàn)ElciRNAs多位于細(xì)胞核內(nèi)，可順式調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，如circEIF3J和circPAIP2通過結(jié)合核內(nèi)小核糖核蛋白U1和RNA聚合酶Ⅱ直接影響親本基因的轉(zhuǎn)錄[15]。

circRNAs既能影響親本基因轉(zhuǎn)錄，同時，研究表明它也能編碼蛋白質(zhì)。Abouhaidar等[20]發(fā)現(xiàn)一種220 nt的circRNA上有核糖體插入位點，能夠編碼一種分子量為16 kD的蛋白質(zhì)。circMBL是由基因的第二個外顯子轉(zhuǎn)錄而來；近期，Koch等[21]發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因果蠅內(nèi)，circMBL可編碼10 kD的蛋白質(zhì)，同時，Legnini等[22]發(fā)現(xiàn)成肌差異表達的circ-ZNF609上有開放閱讀框架，能夠影響肌細(xì)胞增殖并能翻譯生成蛋白質(zhì)，均提示circRNAs具有能夠編碼蛋白質(zhì)的功能。

1.3其它潛在功能 circRNAs可以與多種miRNAs結(jié)合干擾下游靶標(biāo)，與AGO，RNA聚合酶Ⅱ，MBL等RBPs結(jié)合，與mRNA，lncRNAs等內(nèi)源性RNA 競爭結(jié)合位點，從而在相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮了重要調(diào)控作用，此類相互作用向我們展示了一個龐大的錯綜復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的診斷和治療提供了全新的思路。

2 circRNAs作為腦血管疾病的潛在治療靶點和分子標(biāo)記物

circRNAs廣泛存在于腦組織中，隨著神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、老化而蓄積，研究表明circRNAs與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病病理生理過程相關(guān)，腦血管疾病作為神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的一大類，已成為中國居民的主要死因和首位致殘原因[23]，腦血管疾病相關(guān)circRNAs的發(fā)現(xiàn)為卒中后腦損傷的發(fā)生發(fā)展提供了理論依據(jù)，的發(fā)現(xiàn)為卒中后腦保護治療提供了潛在的藥物靶點。

近期Mehta等[4]研究通過建立小鼠大腦中動脈閉塞模型，芯片檢測觀察不同復(fù)灌時點發(fā)現(xiàn)circRNAs的表達量發(fā)生顯著改變，并預(yù)測與之相結(jié)合的miRNAs及其下游生物學(xué)過程，提示circRNAs參與卒中后的病理生理過程，包括卒中后炎癥、氧化應(yīng)激、線粒體功能紊亂、凋亡及自噬等。

富含半胱氨酸運動神經(jīng)元蛋白1(cysteinerich motor neuron 1 protein，CRIM1)基因生成的circ-006839在卒中后不同復(fù)灌時點均差異表達，并影響了卒中后多種病理生理過程[4]，CRIM1是一種跨膜蛋白，能與包括轉(zhuǎn)化生長因子β和血管內(nèi)皮生長因子等多種生長因子結(jié)合[24]，并能與β連環(huán)蛋白和鈣黏素形成復(fù)合物，影響細(xì)胞連接和神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育[25]，CRIM1基因缺陷影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、促進內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[26]，提示CRIM1相關(guān)circ-006839與卒中后血管功能紊亂有聯(lián)系。

核受體共激活劑2(nuclear receptor coactivator 2，NcoA2)基因生成的circ-015350與卒中后凋亡，氧化應(yīng)激等多種生物學(xué)過程相關(guān)[4]，NcoA2是一種轉(zhuǎn)錄因子共激活劑，可調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性，同時也能抑制包括缺氧誘導(dǎo)因子1α和芳香烴受體蛋白等的活性，影響小管生成，進而影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖發(fā)育[27]，NcoA2相關(guān)circ-015350調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子活性，為卒中后腦保護治療提供了潛在的藥物靶點。

蛋白激酶A結(jié)合支架分子( protein kinase A-binding scaffolding molecule，AKAP7)基因生成的circ-000741影響卒中后多種轉(zhuǎn)錄因子和凋亡相關(guān)蛋白的表達[4]，AKAP7主要表達于淋巴細(xì)胞中，在卒中后外周血中表達升高，與血腦屏障的完整性密切相關(guān)，AKAP7相關(guān)circ-000741有望成為卒中后提示病情進展的外周血潛在分子標(biāo)記物[28]。

研究表明染色體9p21鄰近基因INK4A-ARF核苷酸多態(tài)性與動脈粥樣硬化相關(guān)[29-30]，circANRIL是INK4A-ARF基因位點上的反義轉(zhuǎn)錄物，核苷酸多態(tài)性可以通過調(diào)節(jié)ANRIL的剪接和circANRIL的生成影響ANRIL的轉(zhuǎn)錄，circANRIL可以與PES1(pescadillo homologue 1)結(jié)合，干擾血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)mRNA前體的加工，同時，Holdt等[31]研究也發(fā)現(xiàn)circANRIL可以影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡和炎癥因子的生成，降低動脈粥樣硬化的風(fēng)險，減少腦血管病發(fā)率。

Boeckel等[32]發(fā)現(xiàn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞低氧處理后通過深度測序，篩選得到目標(biāo)circZNF292，低氧誘導(dǎo)使circZNF292表達量升高，沉默circZNF292可影響球體發(fā)芽和管腔形成，抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，進一步影響低氧狀態(tài)下血管內(nèi)皮細(xì)胞的新生。同時，對高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞行二代測序，篩選得到差異表達的circZNF609，證實circZNF609海綿吸附miR-615-5p，沉默circZNF609促進球體發(fā)芽，小管生成以及視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖[33]， circRNAs可干擾血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖發(fā)育，進而影響血管功能。

Lin等[34]通過對海馬神經(jīng)元細(xì)胞行糖氧剝奪后，深度測序篩選目標(biāo)circRNAs，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)circRNAs能夠通過海綿吸附miRNAs影響凋亡和免疫炎癥相關(guān)過程，提示參與了腦缺血再灌注損傷病理生理過程。細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白PARP存在于細(xì)胞核中，與DNA損傷修復(fù)密切相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)miRNA-7可通過作用下游靶標(biāo)PARP，影響細(xì)胞凋亡，抵抗缺血再灌注損傷[35]，提示ciRS-7/miRNA-7參與血管損傷的分子調(diào)控，這些都為 circRNAs靶向治療腦血管疾病提供了潛在的思路。

3 展望

circRNAs作為非編碼RNA的一種，因其高穩(wěn)定性及組織特異性，已成為近年來研究的熱點，研究表明circRNAs 與多種疾病的病理生理過程相關(guān)，通過調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄影響了多種疾病的發(fā)生發(fā)展。然而，circRNAs 對疾病的具體調(diào)節(jié)方式，及其組織特異性，與細(xì)胞內(nèi)各種分子間的相互作用還有待進一步探索。但circRNAs在神經(jīng)系統(tǒng)組織中含量豐富，其對轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控提示了 circRNAs對神經(jīng)系統(tǒng)疾病潛在的調(diào)控機制，同時，腦血管病相關(guān)circRNAs的研究為卒中后腦保護治療開辟了一個新的視角，為腦血管病的發(fā)生發(fā)展提供了新的理論基礎(chǔ)，有望成為卒中后腦保護的藥物治療靶點和潛在分子標(biāo)記物[36]，circRNAs為腦血管疾病的診治提供了全新的方向。

[參考文獻]

[1] Salzman J, Chen RE, Olsen MN, et al. Cell-type specific features of circular RNA expression[J]. PLoS Genet, 2013, 9(9):e1003777.

[2] Ivanov A, Memczak S, Wyler E, et al. Analysis of intron sequences reveals hallmarks of circular RNA biogenesis in animals[J]. Cell Rep, 2015, 10(2):170-177.

[3] Rybak-Wolf A, Stottmeister C, Glazar P, et al. Circular RNAs in the mammalian brain are highly abundant, conserved, and dynamically expressed[J]. Mol Cell, 2015, 58(5):870-885.

[4] Mehta SL, Pandi G, Vemuganti R. Circular RNA expression profiles alter significantly in mouse brain after transient focal ischemia[J]. Stroke, 2017, 48(9):2541-2548.

[5] Costa-Mattioli M, Sonenberg N, Richter JD. Translational regulatory mechanisms in synaptic plasticity and memory storage[J]. Prog Mol Biol Transl Sci, 2009, 90:293-311.

[6] Richter JD, Klann E. Making synaptic plasticity and memory last: mechanisms of translational regulation[J]. Genes Dev, 2009, 23(1):1-11.

[7] Pasqualetti G, Brooks DJ, Edison P. The role of neuroinflammation in dementias[J]. Curr Neurol Neurosci Rep, 2015, 15(4):17.

[8] Westholm JO, Miura P, Olson S, et al. Genome-wide analysis ofDrosophilacircular RNAs reveals their structu-ral and sequence properties and age-dependent neural accumulation[J]. Cell Rep, 2014, 9(5):1966-1980.

[9] Gruner H, Cortés-López M, Cooper DA, et al. CircRNA accumulation in the aging mouse brain[J]. Sci Rep, 2016, 6:38907.

[10] Hansen TB, Jensen TI, Clausen BH, et al. Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges[J]. Nature, 2013, 495(7441):384-388.

[11] Memczak S, Jens M, Elefsinioti A, et al. Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency[J]. Nature, 2013, 495(7441):333-338.

[12] Lukiw WJ. Circular RNA (circRNA) in Alzheimer’s di-sease (AD)[J]. Front Genet, 2013, 4:307.

[13] Kefas B, Godlewski J, Comeau L, et al. microRNA-7 inhibits the epidermal growth factor receptor and the Akt pathway and is down-regulated in glioblastoma[J]. Cancer Res, 2008, 68(10):3566-3572.

[14] Nan A, Chen L, Zhang N, et al. A novel regulatory network among LncRpa, CircRar1, MiR-671 and apoptotic genes promotes lead-induced neuronal cell apoptosis[J]. Arch Toxicol, 2017, 91(4):1671-1684.

[15] Li Z, Huang C, Bao C, et al. Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus[J]. Nat Struct Mol Biol, 2015, 22(3):256-264.

[16] Ashwal-Fluss R, Meyer M, Pamudurti NR, et al. circRNA biogenesis competes with pre-mRNA splicing[J]. Mol Cell, 2014, 56(1):55-66.

[17] Armakola M, Higgins MJ, Figley MD, et al. Inhibition of RNA lariat debranching enzyme suppresses TDP-43 toxicity in ALS disease models[J]. Nat Genet, 2012, 44(12):1302-1309.

[18] Du WW, Yang W, Liu E, et al. Foxo3 circular RNA retards cell cycle progression via forming ternary complexes with p21 and CDK2[J]. Nucleic Acids Res, 2016, 44(6):2846-2858.

[19] Du WW, Yang W, Chen Y, et al. Foxo3 circular RNA promotes cardiac senescence by modulating multiple factors associated with stress and senescence responses[J]. Eur Heart J, 2017, 38(18)：1402-1412.

[20] Abouhaidar MG, Venkataraman S, Golshani A, et al. Novel coding, translation, and gene expression of a replicating covalently closed circular RNA of 220 nt[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2014, 111(40):14542-14547.

[21] Koch L. RNA: Translated circular RNAs[J]. Nat Rev Genet, 2017, 18(5):272-273.

[22] Legnini I, Di Timoteo G, Rossi F, et al. Circ-ZNF609 is a circular RNA that can be translated and functions in myogenesis[J]. Mol Cell, 2017, 66(1):22-37.e9.

[23] Wang W, Jiang B, Sun H, et al. Prevalence, incidence, and mortality of stroke in China: results from a nationwide population-based survey of 480 687 adults[J]. Circulation, 2017, 135(8):759-771.

[24] Iyer S, Chhabra Y, Harvey TJ, et al. CRIM1 is necessary for coronary vascular endothelial cell development and homeostasis[J]. J Mol Histol, 2017, 48(1):53-61.

[25] Ponferrada VG, Fan J, Vallance JE, et al. CRIM1 complexes with ss-catenin and cadherins, stabilizes cell-cell junctions and is critical for neural morphogenesis[J]. PLoS One, 2012, 7(3): e32635.

[26] Fan J, Ponferrada VG, Sato T, et al. Crim1 maintains retinal vascular stability during development by regulating endothelial cell Vegfa autocrine signaling[J]. Development, 2014, 141(2):448-459.

[27] Tsai CH, Li CH, Liao PL, et al. NcoA2-Dependent inhibition of HIF-1α activation is regulated via AhR[J]. Toxicol Sci, 2015, 148(2): 517-530.

[28] O’Connell GC, Treadway MB, Petrone AB, et al. Peripheral blood AKAP7 expression as an early marker for lymphocyte-mediated post-stroke blood brain barrier disruption[J]. Sci Rep, 2017, 7(1):1172.

[29] Liu Y, Sanoff HK, Cho H, et al. INK4/ARF transcript expression is associated with chromosome 9p21 variants linked to atherosclerosis[J]. PLoS One, 2009, 4(4):e5027.

[30] Burd CE, Jeck WR, Liu Y, et al. Expression of linear and novel circular forms of an INK4/ARF-associated non-coding RNA correlates with atherosclerosis risk[J]. PLoS Genet, 2010, 6(12):e1001233.

[31] Holdt LM, Stahringer A, Sass K, et al. Circular non-co-ding RNA ANRIL modulates ribosomal RNA maturation and atherosclerosis in humans[J]. Nat Commun, 2016, 7:12429.

[32] Boeckel JN, Jae N, Heumuller AW, et al. Identification and characterization of hypoxia-regulated endothelial circular RNA[J]. Circ Res, 2015, 117(10):884-890.

[33] Liu C, Yao MD, Li CP, et al. Silencing of circular RNA-ZNF609 ameliorates vascular endothelial dysfunction[J]. Theranostics, 2017, 7(11):2863-2877.

[34] Lin SP, Ye S, Long Y, et al. Circular RNA expression alterations are involved in OGD/R-induced neuron injury[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2016, 471(1): 52-56.

[35] Li B, Li R, Zhang C, et al. MicroRNA-7a/b protects against cardiac myocyte injury in ischemia/reperfusion by targeting poly(ADP-ribose) polymerase[J]. PLoS One, 2014, 9(3):e90096.

[36] Lu D, Xu AD. Mini review: circular RNAs as potential clinical biomarkers for disorders in the central nervous system[J]. Front Genet, 2016, 7:53.