生長(zhǎng)因子基因治療與干細(xì)胞治療在肌腱損傷愈合中的應(yīng)用進(jìn)展

陸文君 綜述 李昭鑄 審校

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院小兒外科（黑龍江省哈爾濱市 150081）

由于全民健身運(yùn)動(dòng)的普及，運(yùn)動(dòng)、外傷等因素造成的肌腱損傷越來(lái)越多，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量并且?guī)?lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。肌腱愈合的潛力有限以及目前外科治療手段不完善，促使加快發(fā)展可替代的治療方式以促進(jìn)肌腱組織再生。近些年來(lái)提出的組織工程肌腱為肌腱損傷修復(fù)提供了可行的途徑，即通過(guò)聯(lián)合支架材料、種子細(xì)胞、生長(zhǎng)因子形成組織工程肌腱以促進(jìn)肌腱再生[1]。然而生長(zhǎng)因子存在價(jià)格昂貴、半衰期短、生物活性較低、所需劑量高且難以控制、直接注射可能導(dǎo)致靶器官以外的組織腫瘤發(fā)病率升高等缺陷，限制了其在組織工程肌腱中的應(yīng)用。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)將特定生長(zhǎng)因子基因引入合適靶細(xì)胞，表達(dá)特定的治療性蛋白，成為肌腱損傷更具前景的治療方式。近些年來(lái)干細(xì)胞治療也被廣泛應(yīng)用于肌腱損傷的修復(fù)，包括骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone mar?row mesenchymal stem cells，BMSC）、滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞（synovial mesenchymal stem cells，SMSC）、肌腱干細(xì)胞（tendon derived stem cells，TDSC）等作為干細(xì)胞治療的種子細(xì)胞前景廣闊。

1 肌腱損傷愈合特點(diǎn)

肌腱損傷后自然愈合的特點(diǎn)通常是纖維瘢痕愈合和扭曲變形的細(xì)胞外基質(zhì)，即排列紊亂的膠原纖維形成粘連導(dǎo)致肌腱功能喪失。自然愈合的肌腱生物化學(xué)和機(jī)械性能差，容易再損傷甚至斷裂[2]。傳統(tǒng)的手術(shù)治療方式包括使用自體、同種異體、異種移植，肌腱修復(fù)和縫合技術(shù)，是目前治療的“金標(biāo)準(zhǔn)”[3]。然而，在治療中還有很多尚未解決的問(wèn)題，自體移植供體或供區(qū)有限，異體移植存在免疫排斥反應(yīng)、術(shù)后疼痛、肌腱撕裂復(fù)發(fā)等。因此，近些年來(lái)組織工程肌腱、基因治療、干細(xì)胞治療等更具潛力的治療手段不斷受到專家學(xué)者的重視，相關(guān)研究也逐漸深入。

2 基因治療的原理及可行性

基因治療是利用病毒、非病毒載體或分子結(jié)合載體將外源治療基因插入目的細(xì)胞，通過(guò)在靶細(xì)胞合成大量具有治療作用的蛋白質(zhì)來(lái)改善組織修復(fù)，或糾正、補(bǔ)償致病基因造成的缺陷達(dá)到治療疾病的目的[4]。Mao等將血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子基因插入腺病毒載體成功轉(zhuǎn)染64只雞的全部128個(gè)指伸屈肌腱，組織轉(zhuǎn)染效率達(dá)到100%，并在轉(zhuǎn)染后2、4、6、8周檢測(cè)肌腱愈合相關(guān)指標(biāo)，證實(shí)轉(zhuǎn)染的基因可在損傷部位維持較長(zhǎng)時(shí)間表達(dá)，并且可以顯著提高肌腱愈合強(qiáng)度，不會(huì)加重肌腱愈合后的粘連形成[5]。研究認(rèn)為，外源性基因可在肌腱內(nèi)維持長(zhǎng)時(shí)間表達(dá)可能是由于肌腱組織免疫活性低[6]?；蜣D(zhuǎn)染效率高，無(wú)免疫排斥反應(yīng)，與載體結(jié)合后可作用于局部，體內(nèi)可持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間表達(dá)，因此基因治療是肌腱損傷較為理想的治療手段。

3 生長(zhǎng)因子基因治療在肌腱愈合中的應(yīng)用

血小板源性生長(zhǎng)因子（platelet derived growth fac?tor，PDGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（transforming growth factor，TGF-β）、骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）等已被證實(shí)有促進(jìn)肌腱組織損傷愈合的作用，并已被應(yīng)用于基因治療。生長(zhǎng)因子作用時(shí)存在時(shí)間和劑量依賴性問(wèn)題。如果將生長(zhǎng)因子的基因轉(zhuǎn)染到組織或細(xì)胞，維持緩慢持續(xù)的表達(dá)，則可解決這一問(wèn)題。BMP具有成骨誘導(dǎo)活性已經(jīng)成為共識(shí)，大量研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)促進(jìn)肌腱損傷愈合亦起到重要作用。采用BMP-2通過(guò)巨細(xì)胞病毒載體感染大鼠腎細(xì)胞系后與海藻酸鈣凝膠混合植入腱骨界面，可顯著改善腱骨愈合和促進(jìn)血管生成[7]。BMP-14基因治療顯著提高大鼠跟腱撕裂損傷模型肌腱的愈合，轉(zhuǎn)染BMP-14的肌腱拉伸強(qiáng)度明顯高于對(duì)照組[8]。PDGF基因通過(guò)二氧化硅納米粒子（MSN）轉(zhuǎn)染大鼠跟腱，生物力學(xué)性能及組織學(xué)檢查結(jié)果均提示其促肌腱愈合能力優(yōu)于單獨(dú)使用PDGF治療[9]。Uggen等使用PDGF基因轉(zhuǎn)染大鼠肌成纖維細(xì)胞，以聚合物支架為載體，植入大鼠肩袖損傷模型處，發(fā)現(xiàn)損傷部位膠原合成增加炎癥反應(yīng)減輕，并且使撕裂的肌腱組織明顯愈合[10]。Wu等將攜帶TGF-β 1-miRNA的腺病毒直接注射入雞指屈肌腱損傷模型，發(fā)現(xiàn)肌腱周?chē)恼尺B形成減少，但肌腱愈合的強(qiáng)度受到不利影響[11]。然而有研究表明TGF-β早期促進(jìn)肌腱愈合，晚期則是造成過(guò)度纖維瘢痕形成的主要原因[12]，肌腱損傷后粘連形成大大影響肌腱的滑行功能，這是手術(shù)后的主要臨床并發(fā)癥，TGF-β1在肌腱愈合粘連形成過(guò)程中具有關(guān)鍵作用[13]；Cui實(shí)驗(yàn)證明肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocyte growth factor，HGF）能拮抗TGF-β介導(dǎo)的肌成纖維細(xì)胞過(guò)度增殖分化及細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度沉積，促進(jìn)肌腱優(yōu)勢(shì)愈合[14]。VEGF是一種內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂原，通過(guò)激活一氧化氮合酶增加毛細(xì)血管的通透性，促進(jìn)血管生成，導(dǎo)致血管舒張；因肌腱愈合過(guò)程中血管供應(yīng)不足，故VEGF是損傷后肌腱愈合過(guò)程重要的促血管生成因子[15]。Wu等使用腺病毒載體將VEGF基因轉(zhuǎn)染指屈肌肌腱損傷模型，發(fā)現(xiàn)可以顯著提高指屈肌肌腱的強(qiáng)度，而不會(huì)造成肌腱修復(fù)后粘連形成增加[16]。FGF或VEGF通過(guò)腺相關(guān)病毒2型（AAV2）載體基因治療損傷肌腱產(chǎn)生超正常量的bFGF或VEGF，積極糾正肌腱自然愈合能力的不足；這種治療方法使bFGF或VEGF明顯升高顯著改善損傷肌腱中低生長(zhǎng)因子活性的缺陷，此外還能顯著促進(jìn)Ⅰ型膠原和其他細(xì)胞外分子的產(chǎn)生加速細(xì)胞增殖，肌腱強(qiáng)度與對(duì)照組相比也顯著增加，尤其是VEGF轉(zhuǎn)基因治療組[17]。

基因轉(zhuǎn)染分為兩種方式，一是體內(nèi)直接轉(zhuǎn)染，即直接作用于肌腱，生長(zhǎng)因子基因插入載體后，直接注入體內(nèi)，在特定部位表達(dá)從而產(chǎn)生特定生長(zhǎng)因子，但由于在體內(nèi)基因載體難以與肌腱組織中的細(xì)胞結(jié)合，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染率降低；二是體外間接轉(zhuǎn)染，肌腱中的細(xì)胞或干細(xì)胞體外培養(yǎng)作為基因治療載體重新植入肌腱組織，可以提高基因轉(zhuǎn)染率，并可以持續(xù)穩(wěn)定地表達(dá)目的基因產(chǎn)生蛋白。

4 干細(xì)胞治療在肌腱愈合中的應(yīng)用

4.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）最初在骨髓中分離得到，隨后發(fā)現(xiàn)還可以來(lái)源于脂肪組織、臍帶血、牙髓、肌肉組織、神經(jīng)組織、肌腱和滑膜等多種組織；間充質(zhì)干細(xì)胞為非造血基質(zhì)干細(xì)胞，能多向分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等，不僅容易分離和體外培養(yǎng)擴(kuò)增，而且?guī)缀鯚o(wú)免疫原性，還易于外源基因的轉(zhuǎn)染和表達(dá)[18]。外源目的基因通過(guò)病毒或非病毒載體整合至MSC基因組中長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)，移植回體內(nèi)后可定位于特定組織，通過(guò)自我更新可長(zhǎng)期存活，并分化為特定的組織細(xì)胞。因取材方便、來(lái)源廣泛，BMSC被廣泛用于細(xì)胞治療，基因治療及組織工程領(lǐng)域，并且BMSC在臨床前研究中被證實(shí)可促進(jìn)腱-骨愈合[19]。在兔關(guān)節(jié)腱骨愈合模型中將BMSC與纖維蛋白膠結(jié)合植入大拇趾長(zhǎng)肌腱重建術(shù)后的骨隧道；4周后，腱-骨界面表現(xiàn)出更垂直的膠原纖維的形成和BMSC治療組軟骨樣細(xì)胞增殖顯著提高，類似于纖維軟骨附著，促使肌腱-骨界面愈合良好[20]。此外，間充質(zhì)干細(xì)胞通過(guò)旁分泌作用抗細(xì)胞凋亡，促血管形成，抗瘢痕形成從而促進(jìn)肌腱損傷的愈合[21]，還可以通過(guò)免疫調(diào)節(jié)的方式介導(dǎo)巨噬細(xì)胞由促炎表型轉(zhuǎn)變?yōu)榭寡妆硇停瑴p輕愈合部位炎癥反應(yīng)[22]。

4.2 滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞

De Bari等從尸體及膝關(guān)節(jié)置換手術(shù)術(shù)后患者滑膜中消化分離得到SMSC[23]。由于SMSC擁有比MSC更好的增殖分化潛能，被廣泛應(yīng)用于膝關(guān)節(jié)半月板及肌腱組織修復(fù)和再生[24，25]。將1，1'-雙十八烷基-3，3，3'，3'-四甲基吲哚羰花菁高氯酸鹽（DIL）標(biāo)記的SMSCs植入腱-骨界面，植入1周后觀察DIL標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞明顯增加，2周后證實(shí)肌腱與骨之間穿通的膠原纖維顯著增加；在4周后界面消失，植入肌腱直接附著于骨纖維軟骨形成良好的連接[26]。SMSC通過(guò)加速纖維結(jié)構(gòu)的形成有效改善早期腱骨愈合。但是滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞的使用存在取材來(lái)源的問(wèn)題，限制了其作為種子細(xì)胞在肌腱治療中的應(yīng)用。

4.3 肌腱干細(xì)胞

間充質(zhì)干細(xì)胞還可以從人、鼠、兔、馬的肌腱組織中分離得到[27-30]。2007年Bi等人首先在人類和小鼠的肌腱組織中發(fā)現(xiàn)肌腱干細(xì)胞，經(jīng)鑒定證明其具備干細(xì)胞的特性，因來(lái)源于肌腱組織故命名為肌腱干細(xì)胞[27]。與其他干細(xì)胞一樣，肌腱干細(xì)胞具有克隆增殖、自我更新和多向分化能力。研究中也表明，肌腱干細(xì)胞可以分化為肌腱細(xì)胞、非肌腱細(xì)胞（包括：脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞）。TDSC是肌腱組織中的分化細(xì)胞但仍能在體外生長(zhǎng)并維持其細(xì)胞表型和產(chǎn)生Ⅰ型膠原蛋白[31]。此外，TDSC還可以保持其在組織中特定的分化特性，使其成為組織工程理想的種子細(xì)胞。Ni等使用結(jié)締組織生長(zhǎng)因子及維生素C處理過(guò)的肌腱干細(xì)胞構(gòu)造組織工程肌腱置入大鼠髕腱開(kāi)窗損傷模型，并證實(shí)有新生肌腱形成及促進(jìn)肌腱的愈合[32]。然而由于肌腱組織中TDSC含量過(guò)低，很難從有限的取材區(qū)域中提取出大量的TDSC。研究表明肌腱干細(xì)胞為免疫豁免細(xì)胞，如果同種異體的組織可以被用來(lái)提取肌腱干細(xì)胞，那么TDSC可以輕易地從全關(guān)節(jié)置換手術(shù)和前交叉韌帶重建手術(shù)中殘余的肌腱組織分離[33]，這樣可解決取材來(lái)源問(wèn)題，確保TDSC在肌腱組織工程的應(yīng)用。

盡管間充質(zhì)干細(xì)胞組織來(lái)源豐富、易于取材、表達(dá)干細(xì)胞的共同特性，但是干細(xì)胞的性能卻是不一致的，來(lái)源于肌腱組織的肌腱干細(xì)胞用于肌腱損傷的修復(fù)可能更具優(yōu)勢(shì)。細(xì)胞治療時(shí)，理想且熟悉的環(huán)境能促進(jìn)移植細(xì)胞的增殖、分化。此外，研究表明肌腱干細(xì)胞展示出比骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞更高的克隆形成性能，表現(xiàn)在肌腱干細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中吸收更多原始細(xì)胞的能力，TDSC的增殖速度也比BMSC更快，有利于在肌腱組織工程中的應(yīng)用[34]。

5 干細(xì)胞為基礎(chǔ)的基因治療

Wang等證明BMP-12基因轉(zhuǎn)染的間充質(zhì)干細(xì)胞可以被誘導(dǎo)分化成肌腱細(xì)胞[35]。BMP-2基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞包裹的腓腸肌肌腱用于兔前交叉韌帶（ACL）重建，可積極促進(jìn)腱骨愈合，軟骨樣細(xì)胞增殖以及纖維軟骨形成增加，腱骨間垂直的膠原纖維形成增加，腱骨界面最大負(fù)荷能力和剛度也顯著提升[36]。Li等將PDGF-β轉(zhuǎn)染BMSCs治療重建肌腱-骨界面，能有效地增強(qiáng)血管形成和膠原沉積[37]。TGF-β1基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞利于基因有效傳遞至損傷部位，使用TGF-β1基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療受傷跟腱與對(duì)照組相比愈合速度更快，最大負(fù)荷能力及彈力更強(qiáng)，細(xì)胞外基質(zhì)重建更快，膠原合成增加；其中Ⅰ型膠原與肌腱機(jī)械性能的維持密切相關(guān)，約占正常肌腱膠原成分總數(shù)的95%，而TGF-β1基因轉(zhuǎn)染使Ⅰ型膠原在肌腱愈合中生成速度更快[38]。HGF最初是從血漿和血小板中純化獲得并被認(rèn)為是一種刺激肝細(xì)胞增生的有絲分裂原，能刺激多種類型細(xì)胞分化、增殖、再生、運(yùn)動(dòng)、遷移及形態(tài)的發(fā)生，是一種多功能的細(xì)胞因子。HGF不僅對(duì)肝細(xì)胞再生有重要意義，還能促進(jìn)多種重要器官及組織的損傷修復(fù)，如改善腎纖維化、肺纖維化，促進(jìn)胃粘膜上皮細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞的再生修復(fù)。王俊良等研究表明自體MSCs-HGF移植有利于腱骨界面膠原纖維的重塑和血管的形成[39]。與生長(zhǎng)因子的直接應(yīng)用相比基于干細(xì)胞的遺傳干預(yù)是促進(jìn)肌腱愈合更具優(yōu)勢(shì)的替代方式。這些轉(zhuǎn)染的干細(xì)胞可以穩(wěn)定地分泌相關(guān)生長(zhǎng)因子。此外，生長(zhǎng)因子可以增強(qiáng)干細(xì)胞增殖和分化。因此，基于干細(xì)胞的基因治療協(xié)同作用可以使生長(zhǎng)因子發(fā)揮強(qiáng)大、正反饋、持續(xù)和穩(wěn)定的效果。

6 展望

干細(xì)胞為基礎(chǔ)的基因治療在促進(jìn)肌腱組織愈合的應(yīng)用日益引起重視。這種治療方式有助于促進(jìn)肌腱愈合進(jìn)程。然而，這些結(jié)果是在無(wú)臨床資料的有限條件下得出的。此外，基因治療應(yīng)用于臨床之前還有很多問(wèn)題有待解決。其主要局限性在于，轉(zhuǎn)染基因的表達(dá)會(huì)隨著時(shí)間的推移而減少，這可能會(huì)導(dǎo)致所需目的產(chǎn)物的損失。其次，由于突變、惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展和其他可能副作用的出現(xiàn)使基因治療的安全性不能得到保證。在臨床應(yīng)用前，未來(lái)的研究需要解決多個(gè)問(wèn)題，包括應(yīng)用條件、技術(shù)和安全問(wèn)題等。并且細(xì)胞治療剛開(kāi)始用于臨床，缺乏大數(shù)據(jù)、多中心、隨機(jī)對(duì)照臨床試驗(yàn)；在治療用細(xì)胞篩選、大規(guī)模擴(kuò)增、表型穩(wěn)定等方面，在植入細(xì)胞的停泊、生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)化、與受體組織的融合、功能發(fā)揮、神經(jīng)體液調(diào)節(jié)等基礎(chǔ)研究方面還需要深入研究；在技術(shù)層面，對(duì)植入細(xì)胞的數(shù)量、移植時(shí)間、移植部位、移植途徑等也需要進(jìn)一步探索[40]。而且干細(xì)胞治療在體內(nèi)發(fā)生作用的分子機(jī)制目前尚不明確，干細(xì)胞為基礎(chǔ)的基因治療是否能實(shí)現(xiàn)損傷肌腱組織的再生，愈合后肌腱的質(zhì)量及長(zhǎng)期效果觀察，還需進(jìn)一步的研究探討。