寨卡病毒動物感染模型研究進展

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1947年，寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)首次分離于烏干達寨卡森林中的獼猴體內(nèi)，隸屬黃病毒科黃病毒屬。1952年尼日利亞出現(xiàn)首例人感染寨卡病毒的報道[1-2]。2007年以前的寨卡病毒感染具有散發(fā)與自限性，發(fā)病通常局限于少數(shù)亞非國家，同其它黃病毒如登革病毒等相似，多數(shù)感染呈一過性，僅少數(shù)ZIKV患者會伴發(fā)發(fā)熱、頭疼、皮疹、關(guān)節(jié)疼痛與結(jié)膜炎等輕微臨診癥狀[2]。2007年西太平洋密克羅尼西亞聯(lián)邦Yap島暴發(fā)寨卡疫情，其中49人確診，59人疑似感染[3]。2015年寨卡病毒“登陸”南美洲，其中巴西疫情最為嚴重，有數(shù)百萬人感染寨卡病毒，并出現(xiàn)死亡病例[4]。2016年2月，我國確診第一例寨卡病毒輸入性感染病例，同期日本與韓國等地也先后報道寨卡感染病例，至此寨卡疫情全球滲透[5]。隨著寨卡疫情的蔓延與寨卡病毒研究的深入，科學家們發(fā)現(xiàn)近年來暴發(fā)的強致病性ZIKV分離株可損傷人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)，誘發(fā)新生兒小頭癥、重癥腦部發(fā)育缺陷、腦膜腦炎、急性脊髓炎、免疫系統(tǒng)相關(guān)的吉蘭巴雷綜合征以及先天性寨卡感染綜合征(Congenital Zika syndrome, CZS)等[6-7]。2015年7月至2016年12月，僅巴西就有2000余例新生嬰兒感染寨卡病毒導致小頭畸形癥[7-8]。ZIKV感染引起的不同以往的腦組織損傷癥狀引發(fā)全球高度關(guān)注，2016年2月1日世界衛(wèi)生組織宣布寨卡疫情為全球緊急公共衛(wèi)生事件[9]。

寨卡病毒屬于蟲媒病毒，其主要的傳播媒介是埃及伊蚊與白紋伊蚊。攜帶寨卡病毒的伊蚊叮咬人類后促成寨卡病毒的傳播，該傳播途徑與伊蚊的季節(jié)性及區(qū)域性分布密切有關(guān)[1]。不同與其它黃病毒的是已有大量研究發(fā)現(xiàn)ZIKV還可以通過血液-胎盤、淚液、性和母嬰等非蚊媒載體途徑進行傳播，這使得防控寨卡病毒傳染的難度更大[10]。目前全球尚無安全有效防治寨卡病毒感染的疫苗和特異性抗ZIKV藥物。ZIKV病原流行病學監(jiān)測、媒介控制以及對患者與易感人員的有效隔離仍然是目前最主要的預(yù)防措施。寨卡病毒為單股正鏈RNA病毒，基因組長度約為11 kb，病毒顆粒呈球形，有包膜?，F(xiàn)有的寨卡病毒至少可分為2個主要的遺傳譜系：非洲譜系和亞洲譜系。ZIKV基因組僅有1個開放閱讀框(ORF)，ORF兩側(cè)的5′UTR與3′UTR內(nèi)高度保守的二級結(jié)構(gòu)區(qū)域?qū)Σ《净蚪M的翻譯與復(fù)制起輔助作用。該閱讀框編碼一個多聚體蛋白，加工成熟后可形成3個結(jié)構(gòu)蛋白(衣殼蛋白C、前體膜蛋白prM與囊膜蛋白E)和7個非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5)。各個蛋白在病毒的吸附、入侵、翻譯、復(fù)制與組裝等感染過程中扮演重要作用[2,10]。

良好的動物模型是研究寨卡病毒感染傳播機制、篩選抗病毒藥物與評估候選疫苗效力的重要一環(huán)，也是寨卡病毒感染生物學研究的熱門領(lǐng)域之一[8]。國內(nèi)外目前已報道的各種ZIKV動物感染模型包括野生小鼠、免疫缺陷小鼠、豚鼠、雞胚與獼猴模型。

1 寨卡病毒小鼠感染模型

小鼠因其具有體型小，易于飼喂，實驗管理條件易于控制，操作相對簡便等特點，一直是多種疾病理想的常見實驗動物模型。ZIKV動物感染模型中以小鼠研究最多[8]。烏干達分離的第一株ZIKV(MR 766)，已于小鼠腦內(nèi)連續(xù)傳代100余次，較大劑量腦內(nèi)接種該毒株可引起哺乳期小鼠神經(jīng)系統(tǒng)疾病，但外周途徑接種時并不會引起成年野生近交或遠交小鼠發(fā)病。反復(fù)傳代蓄積的病毒多位點變異引起的毒株對宿主細胞嗜性的改變，可能直接導致了MR766毒株致病性的降低[8]。因此，學界認為以近年來ZIKV流行區(qū)域分離的寨卡病毒流行株進行小鼠感染模型再評估將更有意義[1, 8]。目前小鼠感染模型主要包括以下幾類：

1.1新生幼鼠感染模型 由于非洲型或亞洲型ZIKV臨床分離株外周途徑接種成年野生鼠(包括C57BL/6、BALB/c與CD-1)后沒有引起典型的臨床表征，臟器中也檢測不到ZIKV粒子或RNA，因此有學者采用新生幼鼠進行寨卡病毒感染試驗[8]。Fernandes等[11]將ZIKV巴西分離株SPH 2015分別腦內(nèi)或皮下接種1日齡新生Swiss小鼠，結(jié)果顯示兩種方式感染的小鼠均出現(xiàn)不同程度的嗜睡、共濟失調(diào)和麻痹等神經(jīng)癥狀，且腦內(nèi)感染小鼠病程更急，癥狀更為兇險；病理組織觀察ZIKV感染的新生幼鼠發(fā)現(xiàn)腦神經(jīng)元細胞變性、凋亡，腦血管周邊白細胞浸潤，急性星型膠質(zhì)細胞增生，神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白大量表達等特征。Manangeeswaran等[12]以ZIKV波多黎各毒株P(guān)RVABC59皮下接種1日齡的野生型C57BL/6小鼠，感染后2周左右發(fā)現(xiàn)小鼠出現(xiàn)震顫、嚴重的共濟失調(diào)與癲癇等神經(jīng)癥狀，免疫病理學分析顯示ZIKV主要聚積于小鼠小腦區(qū)域，相應(yīng)區(qū)域的腦神經(jīng)細胞變性，腦組織CD8+T細胞浸潤，上述結(jié)果為進一步佐證ZIKV感染與腦組織損傷的相關(guān)性提供了試驗依據(jù)。

1.2免疫缺陷小鼠感染模型 Grant A等[13]研究發(fā)現(xiàn)寨卡病毒可通過NS5蛋白降解人I型干擾素受體(IFNAR1)活化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子STAT2以拮抗人I型干擾素的產(chǎn)生與反應(yīng)，但該病毒的NS5蛋白并不結(jié)合或促成小鼠STAT2的降解，這可能是免疫完整的野生小鼠對ZIKV感染和疾病發(fā)生具有抗性的主要原因。已有研究發(fā)現(xiàn)I型干擾素分泌缺陷的轉(zhuǎn)基因小鼠可以作為其它黃病毒感染的動物模型[14]，由此啟發(fā)眾多學者采用干擾素受體先天缺陷的轉(zhuǎn)基因小鼠進行ZIKV感染模型的評估。

Dowall等[15]模擬蚊蟲叮咬方式對5～6周齡IFNAR1-/-缺陷小鼠A129后腿皮下接種ZIKV，結(jié)果發(fā)現(xiàn)A129小鼠感染ZIKV后發(fā)病嚴重，6 d內(nèi)死亡率達100%，在血液、腦組織、脾臟、肝臟和卵巢中均可檢測到大量的寨卡病毒RNA，感染ZIKV的A129小鼠腦組織與脾臟細胞出現(xiàn)凋亡壞死，有明顯的炎性細胞浸潤，而接種ZIKV的129Sv/Ev野生型小鼠盡管在血液、脾臟和卵巢中檢測到極小量的病毒RNA，但并未表現(xiàn)出臨床癥狀或觀察到病理學變化。Rossi等[16]對不同生長階段的A129小鼠皮下接種傳代次數(shù)較低的亞洲譜系ZIKV毒株(FSS13025)時發(fā)現(xiàn)A129小鼠對該毒株易感，且A129小鼠致死率與其感染年齡有關(guān)，其中3周齡小鼠感染后死亡率達100%，5周齡達50%，11周齡的A129小鼠感染后不死亡(0%)，但伴隨嚴重的病毒血癥與體重減輕等臨床癥狀。先天缺陷I型和II型干擾素受體的AG129小鼠對ZIKV更為易感，臨床癥狀更為明顯，如：Aliota等[14]報道接種亞洲株ZIKV(H/PF/2013)的AG129小鼠在8 d內(nèi)全部死亡，其中幼齡AG129小鼠病程更短更急，內(nèi)臟器官與腦組織中可檢出高滴度的ZIKV，小鼠全身病變明顯，尤以腦組織和肌肉損傷最為嚴重。另有研究組構(gòu)建了3種干擾素轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子(IRF3，IRF5和IRF7)先天缺失的轉(zhuǎn)基因小鼠進行ZIKV感染試驗，結(jié)果與上述研究類似，三重IRF缺失的小鼠對ZIKV感染極為敏感，病情嚴重，ZIKV可誘發(fā)小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染并刺激神經(jīng)祖細胞凋亡[17-18]。

Smith等[19]從免疫學角度采用阻斷小鼠IFNAR1的單克隆抗體處理野生型C57BL/6小鼠后感染ZIKV(Dakar 41519毒株)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗體處理組的小鼠對ZIKV更為易感，皮下接種小鼠出現(xiàn)40%的死亡，腹腔接種時小鼠發(fā)病更為嚴重，死亡率高達100%，且兩種感染途徑均可導致小鼠出現(xiàn)體重減輕，嚴重的病毒血癥和典型的神經(jīng)病理學癥狀。Tripathi等[20]以I型干擾素通路關(guān)鍵活化分子STAT2缺陷的小鼠作為感染模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Stat2-/-小鼠對ZIKV高度敏感，感染后神經(jīng)癥狀明顯，ZIKV在小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)、性腺和其他內(nèi)臟器官中均有分布，利用該模型作者還發(fā)現(xiàn)非洲譜系的ZIKV毒株感染Stat2-/-小鼠病變嚴重，小鼠病程短而急，死亡率高，而亞洲譜系毒株感染的小鼠病程長，神經(jīng)功能障礙較緩，個別Stat2-/-小鼠會出現(xiàn)死亡。這可能與非洲譜系的ZIKV毒株誘導Stat2-/-小鼠腦組織表達更高水平的白細胞浸潤相關(guān)標志物及炎性因子有關(guān)。

1.3孕鼠感染模型 寨卡病毒感染孕婦后導致胎兒流產(chǎn)、胎兒小頭畸形、生長受限甚至死亡等疾病，對嬰幼兒影響極大,建立合適的ZIKV-胎兒感染模型以探索該病毒如何跨越子宮內(nèi)血胎屏障垂直傳播感染胎兒與影響胎兒神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的機制十分重要[1, 8]。Miner等[21]對受孕的IFNAR1-/-缺陷母鼠在胚胎發(fā)育期E6.5或E7.5時模擬叮咬方式皮下接種ZIKV(H/PF/2013)，對應(yīng)E13.5或E15.5期時發(fā)現(xiàn)ZIKV感染后胎兒出現(xiàn)死亡，胎兒體型變小，在胎兒腦部、胎盤及母體內(nèi)均可檢測到高滴度的ZIKV，病理組織學觀察發(fā)現(xiàn)ZIKV可感染胎盤滋養(yǎng)層與內(nèi)皮細胞，誘導胎盤血管損傷與腦神經(jīng)元細胞凋亡等。對IFNAR1抗體處理的野生懷孕母鼠同步進行上述試驗，結(jié)果顯示胎兒未死亡，但ZIKV同樣可以感染和損害胎盤，并導致小頭畸形和生長受限。Cugola等[22]對正常的野生SJL或C57BL/6孕鼠靜脈接種ZIKV巴西株，發(fā)現(xiàn)感染ZIKV的SJL孕鼠可引起胎兒宮內(nèi)生長受限，全身發(fā)育延遲，胎兒腦皮質(zhì)畸形，皮層厚度及神經(jīng)元細胞減少的現(xiàn)象，這與人感染ZIKV小頭癥相關(guān)表型極為相似。Yockey等[23]對野生C57BL/6孕鼠陰道內(nèi)接種ZIKV菌株(FSS13025)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該病毒可在孕鼠陰道黏膜內(nèi)復(fù)制，胎兒腦組織中也可檢出ZIKV，感染可引起小鼠胎兒重量減輕，生長受限及溶解等現(xiàn)象，這為ZIKV可能通過性傳播提供了證據(jù)。Li等[18]直接對野生ICR孕鼠胚胎發(fā)育E13.5期的胎兒進行腦室內(nèi)接種ZIKV(亞洲譜系株SZ01)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ZIKV可通過調(diào)節(jié)機體免疫反應(yīng)，上調(diào)表達病毒入侵識別相關(guān)受體，在胎兒腦組織內(nèi)大量復(fù)制，通過誘導神經(jīng)元祖細胞周期停滯、凋亡和分化障礙等環(huán)節(jié)，最終導致胎兒小頭畸形，該研究為寨卡病毒感染影響腦組織的發(fā)育提供了直接的試驗依據(jù)。

2 寨卡病毒豚鼠感染模型

豚鼠因其生殖生理、發(fā)情周期及胎盤種類與人類相似，是公認的研究先天性感染與性傳播疾病的理想動物模型，因此有希望為研究寨卡病毒母體垂直傳播機制及對嬰兒神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育影響作參考。Kumar等[24]以ZIKV波多黎各毒株P(guān)RVABC59皮下接種野生型豚鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)豚鼠感染病毒后主要表現(xiàn)為發(fā)熱、嗜睡、駝背、皮毛皺褶和運動障礙等臨床癥狀，豚鼠全血、血清、脾臟及腦組織均可檢出ZIKV，以腦組織病毒載量最高，ZIKV感染的豚鼠血清中多種細胞因子、趨化因子和生長因子等急劇表達上調(diào)。Deng等[25]對成年豚鼠皮下接種委內(nèi)瑞拉來源的ZIKV GZ01毒株或柬埔寨FSS13025毒株，發(fā)現(xiàn)ZIKV可在豚鼠體內(nèi)復(fù)制，感染后2天即可在豚鼠血液、唾液及淚液中檢出持續(xù)排毒，組織病理與病原學分析發(fā)現(xiàn)ZIKV可在豚鼠脾臟、腸道與睪丸中檢出，ZIKV可誘導機體產(chǎn)生特異性抗體。研究者還發(fā)現(xiàn)直接密切接觸也可以促進ZIKV傳播，將健康豚鼠與帶毒豚鼠混合同籠飼養(yǎng)，直接暴露于ZIKV傳染源的健康豚鼠也感染成功。

3 寨卡病毒雞胚感染模型

Goodfellow等[26]以不同劑量的ZIKV毒株(MEX1-44)羊膜穿刺接種雞胚，結(jié)果顯示ZIKV可致雞胚死亡，并且表現(xiàn)出ZIKV劑量依賴性，未死亡的雞胚在感染后期出現(xiàn)大腦發(fā)育異常，腦組織生長受限，尤其是大腦皮層區(qū)域腦心室容積增加明顯。該模型為探索寨卡病毒感染引發(fā)胎兒發(fā)育異常的機制提供了較好的替代動物模型。

4 寨卡病毒獼猴感染模型

獼猴作為非人靈長類動物在胎兒妊娠、胎盤屏障、大腦灰/白質(zhì)比例及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育等方面與人類最為相似，相比于其他動物更適合作為寨卡病毒感染研究模型[8]。Dudley等[27]以ZIKV亞洲譜系毒株H/PF/2013分別皮下接種雄性、雌性與懷孕獼猴，結(jié)果顯示3類獼猴均對ZIKV易感，病毒在獼猴體內(nèi)繁殖迅速，接種1 d后即可在血液中檢出，部分獼猴尿液、唾液及腦脊液中也可檢出ZIKV，病毒感染后期可誘導獼猴機體產(chǎn)生病毒特異性T細胞、NK細胞與抗ZIKV中和抗體等，這些免疫保護性反應(yīng)可抵抗10周后ZIKV攻毒再感染。Osuna等[28]同時分析比較了2株不同ZIKV毒株在恒河猴或短尾猴上的感染情況與不同獼猴對ZIKV感染的宿主免疫防御反應(yīng)，結(jié)果顯示不同品種的獼猴對ZIKV易感，ZIKV誘導的機體先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答反應(yīng)可拮抗病毒復(fù)制，促進病毒清除與抵抗二次感染，這與Dudley等的研究結(jié)論一致。獼猴還是ZIKV候選疫苗免疫原性與保護效力評價的動物模型[8, 29]。

5 小 結(jié)

現(xiàn)有的動物感染試驗結(jié)果對于了解寨卡病毒感染機理、誘發(fā)胎兒小腦癥與研發(fā)抗ZIKV的疫苗或藥物起到了至關(guān)重要的作用，但各模型仍有一定的缺陷[1, 8]。如：小鼠模型對ZIKV并不天然易感，往往需要IFN受體缺陷的小鼠或較大劑量的病毒接種才有效，小鼠胎盤結(jié)構(gòu)與免疫系統(tǒng)與人類的又有一定的生理差異，與ZIKV感染相關(guān)的人吉蘭巴雷綜合征癥狀并未在小鼠模型中得到復(fù)現(xiàn)；雞胚模型與人類遺傳關(guān)系較遠，且ZIKV感染雞胚的相關(guān)研究還不夠透徹；靈長類大動物獼猴模型雖然與人類最為相似，試驗數(shù)據(jù)更為可信，但獼猴孕期長、個體差異大、實驗材料不易獲取與成本昂貴等問題突出。目前國際上尚無完全理想的ZIKV感染與疫苗評估可靠的統(tǒng)一動物模型，如何比較分析不同ZIKV毒株的致病性差異與評估不同動物模型間的感染差異，篩選合適的動物感染模型仍然是下一步研究的重點。

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