比利時(shí)杜鵑花花青素合成酶基因（RhANS）克隆及其功能分析

蔣寶鑫 楊國霞 呂思佳 賈永紅 謝曉鴻 吳月燕，

（1浙江萬里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院，浙江 寧波 315100； 2浙江萬里學(xué)院設(shè)計(jì)藝術(shù)與建筑學(xué)院，浙江 寧波 315100）

杜鵑花（Rhododendron simsiiPlanch.）是雙子葉植物綱杜鵑花科杜鵑屬常綠落葉灌木，也是木本觀賞性植物［1］。花色作為觀賞植物的重要觀賞性狀之一，具有很高的園藝學(xué)研究價(jià)值，因此植物花色的研究對(duì)杜鵑花育種具有重要意義［2］。

在植物體內(nèi)花色素多且復(fù)雜，主要分為三大類：類黃酮（flavonoid）、類胡蘿卜素（carotenoid）以及生物堿（alkaloid），其中類黃酮是主要色素［3］?；ㄉ饕蕾囉诨ㄇ嗨睾皖惡}卜素［4］，花青素作為類黃酮衍生物在植物生物學(xué)和人類健康中起著至關(guān)重要的作用［5］，主要存在于花朵、葉子、果實(shí)、種子等組織的細(xì)胞液泡內(nèi)［6］。一些研究發(fā)現(xiàn)，杜鵑花花瓣的色素主要包括花青素和黃酮醇，其中花青素主要成分為矢車菊素、矮牽牛素、天竺葵素、飛燕草素、芍藥花素和錦葵素花青素糖苷化合物。大部分花青素成分是花青素-3-O-糖苷（葡萄糖苷、蘆丁苷、半乳糖苷和二糖苷）化合物［2］。

目前杜鵑花雜交育種改良花色尚不清晰，因此通過研究其花青素形成機(jī)制，對(duì)于利用基因工程技術(shù)進(jìn)行花色改良尤為重要。在花青素的合成途徑中，花青素合成酶（anthocyanidin synthase，ANS）是合成途徑中最后一個(gè)關(guān)鍵酶，在植物體內(nèi)ANS基因表達(dá)量會(huì)影響花青素的積累［7］。植物體內(nèi)的ANS基因可以將無色的原花色素轉(zhuǎn)化為有色的花色苷元，其酶活性影響花色苷的合成［8］。ANS作為一種2-氧戊二酸和Fe（Ⅱ）依賴性加氧酶，與黃烷酮3-羥化酶（F3H）是同一加氧酶家族，能催化相同的底物［9］。首次報(bào)道由Saito［10］從紅色和綠色紫蘇（Perilla frutescens）中分離編碼ANS的CDNA序列。近年來，已經(jīng)對(duì)一些植物中花色化合物及合成機(jī)制進(jìn)行探究，已從紫娟茶（Camellia sinensisvar.assamica）［7］、華麗龍膽（Gentiana sino-ornata）［11］、郁金香（Tulipa gesnerianaL.）［12］、紫薇（Lagerstroemia indica）［13］、花生（Arachis hypogaeaLinn.）［14］、黃芩（Scutellaria baicalensisGeorgi）［15］、鳶尾花（Iris halophilaPall.）［16］及其他植物［17-18］中克隆出花青素合成酶（ANS）基因，發(fā)現(xiàn)ANS基因可以將無色花青素轉(zhuǎn)化為有色花青素，是花青素合成途徑的關(guān)鍵基因。但目前關(guān)于杜鵑花花色的分子機(jī)制的研究報(bào)道較少，杜鵑花花瓣色素沉著的調(diào)節(jié)因素仍有待研究［19］。前人研究表明，洋蔥（Allium cepa）鱗片中ANS基因發(fā)生點(diǎn)突變，使巴西黃洋蔥和美國紅洋蔥鱗片顏色發(fā)生改變［20］。Yan等［21］研究表明，ANS的功能缺陷或缺失會(huì)影響植物顏色的形成，導(dǎo)致無色或白色器官，表明了其在植物顏色形成中的重要性。Nakatsuka等［22］在夏堇（Torenia hybrida）中利用RNAi技術(shù)抑制體內(nèi)ANS基因的表達(dá)，抑制后夏堇產(chǎn)生穩(wěn)定的白花。此外，ANS基因的表達(dá)水平以及基因突變對(duì)于花色苷的積累有著重要的影響，但杜鵑花ANS基因的相關(guān)研究仍鮮有報(bào)道，對(duì)其功能的驗(yàn)證、酶學(xué)性質(zhì)等尚不清晰。Ye等［23］研究表明，桃［Prunus persica（L.） Batsch］中重組PpANS蛋白可以催化無色花青素形成花青素。Pang等［24］在蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）中重組MtANS蛋白可以將無色花青素轉(zhuǎn)化為花青素。基于以上研究，推測(cè)ANS基因可能是比利時(shí)杜鵑花合成花青素含量的關(guān)鍵酶基因。

為了驗(yàn)證上述推測(cè)，本研究以紅色比利時(shí)杜鵑花（Rhododendron hybridumHort.）4個(gè)時(shí)期（花苞期、初開期、盛開期和衰亡期）花瓣和盛開期根、莖、葉為試驗(yàn)材料，測(cè)定4個(gè)時(shí)期花瓣花青素的含量，克隆杜鵑花ANS基因的開放閱讀框（open reading frame，ORF）全長，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析；對(duì)杜鵑花4個(gè)時(shí)期花瓣和盛開期不同器官ANS基因表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定，并探究比利時(shí)杜鵑花不同發(fā)育時(shí)期花瓣ANS基因表達(dá)量與花青素含量的關(guān)系；構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-28-RhANS，制備重組蛋白，利用高效液相色譜儀（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測(cè)RhANS體外酶活性，對(duì)RhANS進(jìn)行功能分析，鑒定重組蛋白的功能，旨在為了解植物觀賞價(jià)值和杜鵑花花色素形成的分子機(jī)理提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料于2022年3月在中國寧波北侖柴橋萬景杜鵑良種園（121°27′40″～122°10′22″E，29°41′44″～29°58′48″N）中采集，選擇生長良好的紅色比利時(shí)杜鵑花花苞期（S1）、初開期（S2）、盛開期（S3）、衰亡期（S4）和盛開期根、莖和葉為試驗(yàn)材料（圖1-A、B）。采后立即置于液氮中，然后放入-80 ℃條件下儲(chǔ)存?zhèn)溆?。每個(gè)樣品均設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)。

圖1 比利時(shí)杜鵑花不同花期花瓣形態(tài)（A）和盛開期器官（B）Fig.1 Petal at different flowering stages （A） and tissues and organs at full opening stages （B） of Rhododendron hybridum Hort.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 花青素含量測(cè)定分析 參考黃玲等［12］和趙偉等［25］的方法進(jìn)行花青素測(cè)定：將4個(gè)發(fā)育時(shí)期的花瓣樣品經(jīng)液氮研磨成粉末，稱取100 mg花瓣粉末加入1.0 mL 1%鹽酸-甲醇中，4 ℃黑暗條件下靜置12 h，期間渦旋3次。12 000 r·min-1離心10 min，吸取上清，使用0.22 μm微孔濾膜過濾樣品，保存于進(jìn)樣瓶中備用。利用UPLC-Qtof超高效液相色譜儀（Waters，美國）對(duì)4個(gè)發(fā)育時(shí)期的花瓣樣品色素提取液進(jìn)行分析。標(biāo)準(zhǔn)品為矢車菊素-3-O-葡萄糖（Cy3G）（上海源葉生物科技有限公司）。

1.2.2 總RNA的提取及cDNA合成 取-80 ℃條件下保存的比利時(shí)杜鵑花樣品，用液氮研磨，使用RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］提取花瓣總RNA。通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳儀（北京六一生物科技有限公司）和SpectraMax 190全波長酶標(biāo)儀（北京龍躍生物科技發(fā)展有限公司）測(cè)定總RNA的質(zhì)量和濃度。按照NovoScript?Plus All-in-one 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix （gDNA Purge）反轉(zhuǎn)錄試劑盒（上海近岸科技有限公司）說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用SMARTer?RACE 5′∕3′ Kit RACE試劑盒［寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司］說明書逆轉(zhuǎn)錄合成3′∕5′cDNA［26］。

1.2.3RhANS基因的克隆 從美國國家生物技術(shù)信息 中 心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫中下載與杜鵑花屬植物親緣關(guān)系較近植物的ANS基因序列。使用Primer 6.0軟件進(jìn)行簡并引物ANS-R1和ANS-F1設(shè)計(jì)（表1）。以杜鵑花cDNA為模板，按照2×EasyTaq?PCR Super Mix酶（北京全式金生物技術(shù)股份有限公司）說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增。保守區(qū)域擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收目的片段產(chǎn)物，將回收產(chǎn)物與pEASY?-BluntCloningKit（北京全式金生物技術(shù)股份有限公司）載體連接并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中。將感受態(tài)細(xì)胞均勻涂布于具有卡那霉素（kanamycin，Kan， 100 mg·mL-1）抗性的LB固體培養(yǎng)基上，將平板倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。挑取培養(yǎng)后的單一菌落，利用M13F和M13R通用引物進(jìn)行菌液PCR，篩選陽性克隆菌，進(jìn)行序列測(cè)定（北京擎科生物科技有限公司），從而獲得目的基因的保守序列。使用Primer 6.0軟件設(shè)計(jì)RACEANS-5′∕3′引物（表1）。按照2×FastPfuMasterMix酶（上海近岸科技有限公司）說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增。后續(xù)試驗(yàn)過程與保守區(qū)域克隆相同，從而獲得ANS-5′和ANS-3′基因的核苷酸序列。使用DNAMAN 8軟件進(jìn)行序列拼接，根據(jù)拼接結(jié)果使用Primer 6.0軟件設(shè)計(jì)全長引物ANS-R2和ANS-F2（表1），在起始密碼子前和終止密碼子后設(shè)計(jì)引物，按照2×FastPfuMasterMix酶說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增。后續(xù)試驗(yàn)過程與保守區(qū)域克隆相同。

表1 本研究所用的引物序列Table 1 Primers sequence used in this study

1.2.4 生物學(xué)信息分析 采用DNAMAN 8.0軟件進(jìn)行同源蛋白質(zhì)序列比對(duì)；采用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn) 化 樹；采 用ProtParam網(wǎng) 站（http：∕∕web.expasy.org∕protparam）對(duì)RhANS蛋白進(jìn)行理化特性分析；采用ProtScale網(wǎng)站（http：∕∕web.expasy.org∕protscale）對(duì)RhANS蛋白進(jìn)行疏水性分析；采用SOPMA 網(wǎng)站（https：∕∕npsaprabi.ibcp.fr∕）對(duì)RhANS蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；采用Swiss Model網(wǎng)站（https：∕∕www.swissmodel.expasy.org∕）對(duì)RhANS蛋白質(zhì)進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；采用CDD網(wǎng)站（https：∕∕www.ncbi.nlm.nih.gov∕cdd∕）對(duì)RhANS蛋白進(jìn)行功能結(jié)構(gòu)域分析；采用NetPhos 網(wǎng)站（http：∕∕www.cbs.dtu.dk∕services∕NetPhos∕）對(duì)RhANS蛋白進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)分析。

1.2.5RhANS實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative realtime PCR，qRT-PCR）分析 參考劉小飛等［27］的方法進(jìn)行qRT-PCR內(nèi)參基因篩選及驗(yàn)證，選擇Actin-R和Actin-F作為內(nèi)參基因。利用Primer 6.0軟件設(shè)計(jì)qRT-PCR引物ANS-R3和ANS-F3（表1）。選擇4個(gè)發(fā)育階段比利時(shí)杜鵑花品種花瓣和不同組織作為試驗(yàn)材料，使用RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）提取總RNA。根據(jù)

NovoScript?Plus All-in-one 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix （gDNA Purge）試劑盒（上海近岸科技有限公司）合成熒光cDNA。使用2×NovoStart?SYBR qPCR SuperMix Plus試劑盒（上海近岸科技有限公司）進(jìn)行qRT-PCR分析。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性1 min；95℃退火20 s，60℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCT法［28］計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6RhANS基因的原核表達(dá) 使用Primer 6.0軟件設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的上下游引物ANS-R5和ANS-F5（表1）。以杜鵑花cDNA為模版，利用2×EasyTaq?PCR Super Mix酶（北京全式金生物技術(shù)股份有限公司）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，后續(xù)試驗(yàn)過程與保守區(qū)域克隆相同，獲得帶有酶切位點(diǎn)的ANS基因全部核苷酸序列。

用EcoRI-HF酶［紐英倫生物技術(shù)（北京）有限公司］將pET-28a質(zhì)粒（武漢淼靈生物科技有限公司）進(jìn)行單酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并進(jìn)行割膠回收純化。使用NovoRec?plus One step PCR Cloning Kit連接酶試劑盒（上海近岸科技有限公司），將純化產(chǎn)物按載體片段和插入片段摩爾比1∶2連接，再將連接后的pET-28a-RhANS載體輕輕混勻加入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。將菌液均勻涂布在含Kan的抗生素平板上，37 ℃倒置過夜培養(yǎng)。挑取重組的單一菌落進(jìn)行菌液PCR鑒定，將質(zhì)粒送至杭州擎科生物有限公司測(cè)序。

1.2.7 RhANS重組蛋白制備與純化 將重組質(zhì)粒pET-28a-RhANS和空載質(zhì)粒pET-28a，加入大腸桿菌BL21（DE3，pLysS chemically competent cell）感受態(tài)細(xì)胞中輕輕混勻。將轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)細(xì)胞加到含Kan抗性的固體培養(yǎng)基中，37 ℃倒置過夜培養(yǎng)。挑取重組的單一菌落進(jìn)行菌液PCR鑒定。將重組質(zhì)粒pET-28a-RhANS和空載質(zhì)粒pET-28a陽性菌落預(yù)培養(yǎng)于10 mL含有Kan抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r·min-1過夜。當(dāng)菌液吸光度A600nm達(dá)到0.5～0.8時(shí)，加入238 μL 0.5 mmol·L-1IPTG溶液，在37 ℃條件下誘導(dǎo)重組蛋白8 h［29］。誘導(dǎo)結(jié)束后于4 ℃、8 000 r·min-1條件離心10 min收菌，用2 mL 0.1%磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）懸浮沉淀，對(duì)沉淀進(jìn)行超聲處理，4 ℃、13 000 r·min-1離 心10 min后 吸 取 上 清 液，用2 mL 0.1% PBS懸浮沉淀。分別收集上清和沉淀，然后取20 μL蛋白樣品加入20 μL二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）混勻，100 ℃水浴加熱5～10 min，使蛋白變性，冷卻至室溫后，進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（10% SDS polyacrylamide gel electrophoresis，10% SDS-PAGE）可溶性重組蛋白驗(yàn)證。使用His60鎳超流樹脂和重力柱［寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司］對(duì)可溶性重組蛋白進(jìn)行純化，收集洗脫液，將洗脫液中進(jìn)行10% SDS-PAGE分析。

1.2.8 RhANS蛋白體外酶活檢測(cè) 將純化的重組蛋白pET-28a-RhANS（100 μL）和pET-28a空載體蛋白（100 μL）溶解于8 mmol·L-1抗壞血酸鈉（C6H7O6Na）、400 mmol·L-1氯化鈉（NaCl）、2 mmol·L-12-氧化戊二酸（C5H6O5）、20 mmol·L-1麥芽糖（C12H22O11·H2O）、10 mmol·L-1二 硫 蘇 糖 醇（DTT）、1 mmol·L-1FeSO4、1 μmol·L-13，4-順式花青素和40 mmol·L-1KPi緩沖液（pH值7.5）體系中，反應(yīng)總體積為500 μL。在30 ℃，孵育1 h后，加入8 μL 18% 鹽酸（HCl）和40 μL甲醇終止反應(yīng)。樣品于12 000 r·min-1離心5 min，將樣品中上清液通過0.22 μm孔徑濾膜過濾。采用Waters超高效液相色譜儀（美國沃特世公司），Acquuity uplc beh C18色譜柱（1.7 μm，2.1×100 μm，美國沃特世公司）對(duì)樣品上清液進(jìn)行分析。在530 nm處檢測(cè)蛋白樣品，采用二元流動(dòng)相方法檢測(cè)，流動(dòng)相A為1% 磷酸，流動(dòng)相B為含50% 甲酸的乙腈，流速為1 mL·min-1。以空載pET-28a的BL21為對(duì)照［9，23］。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利 用Origin 2018、DNAMAN 8.0、Primer 5.0、MEGA 6.0、SPSS 17.0和Excel 2007軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析；所有數(shù)據(jù)均設(shè)3組生物學(xué)重復(fù)，采用單因素方差分析（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 比利時(shí)杜鵑花發(fā)育過程中色素含量分析

利用Waters UPLC-Qtof超高效液相色譜儀對(duì)1% 鹽酸-甲醇稀釋的Cy3G標(biāo)準(zhǔn)品和不同發(fā)育階段花瓣進(jìn)行峰面積測(cè)定，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程（y=36.52x-59.18）和相關(guān)系數(shù)（R2=0.998）。將不同發(fā)育階段花瓣的峰面積帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖2所示。在比利時(shí)杜鵑花不同發(fā)育階段的花瓣中，花青素含量呈逐漸上升的變化趨勢(shì)且存在顯著差異，在S4時(shí)期含量最高，是S1時(shí)期的3.18倍；花青素含量在S1和S2時(shí)期積累量較少，在S3和S4時(shí)期積累量較多。

圖2 比利時(shí)杜鵑花花瓣不同發(fā)育階段花青素苷含量Fig.2 Anthocyanin content of Rhododendron hybridum Hort. petals at different developmental stages

2.2 RhANS基因的克隆及生物學(xué)信息分析

以比利時(shí)杜鵑花cDNA為模板，利用簡并引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得687 bp保守區(qū)序列（圖3-A）；根據(jù)保守區(qū)序列進(jìn)行RACE擴(kuò)增，分別獲得897 bp的5′序列（圖3-B）和693 bp的3′序列（圖3-C）。利用DNAMAN 8.0軟件將保守區(qū)、5′區(qū)和3′區(qū)序列進(jìn)行比對(duì)拼接，得到ANS基因全長為1 350 bp，其中包含1 074 bp的完整ORF序列（圖3-D），編碼357個(gè)氨基酸。

圖3 比利時(shí)杜鵑花ANS基因PCR擴(kuò)增Fig.3 PCR amplification of Rhododendron hybridum Hort. ANS gene

使用DNAMAN 8.0軟件將RhANS氨基酸序列與其他物種的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)（圖4）。結(jié)果顯示，杜鵑花ANS與其他植物ANS氨基酸序列相比較具有較高的同源性，RhANS蛋白是一個(gè)典型的2OG-Fe（Ⅱ）加氧酶結(jié)構(gòu)域，該保守域?yàn)锳NS的特征結(jié)構(gòu)域。RhANS蛋白包含由His236、Asp238和His292組成的鐵離子結(jié)合位點(diǎn)（HxDxnH），以及由Arg302和Ser304構(gòu)成的2-酮戊二酸的結(jié)合位點(diǎn)（RxS）。

圖4 比利時(shí)杜鵑花與其他植物ANS氨基酸序列的多重比較Fig.4 Multiple comparison of amino acid sequences of Rhododendron hybridum Hort. with ANS of other plants

使用MEGA 6.0軟件對(duì)杜鵑花與21種植物ANS氨基酸序列構(gòu)建進(jìn)化樹（圖5）。結(jié)果顯示，杜鵑花ANS氨基酸序列與其他物種ANS蛋白有較高的保守性，其中比利時(shí)杜鵑花ANS蛋白與越橘（AFA53722.1）親緣關(guān)系最近。

圖5 比利時(shí)杜鵑花ANS與其他物種ANS蛋白質(zhì)的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree of ANS of Rhododendron hybridum Hort. with ANS proteins of other species

2.3 RhANS蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析

2.3.1 RhANS蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域分析 采用CDD對(duì)RhANS蛋白進(jìn)行功能結(jié)構(gòu)域分析（圖6）。結(jié)果表明，比利時(shí)杜鵑花ANS蛋白屬于2-氧戊二酸（2OG）和 Fe（Ⅱ）依賴性加氧酶超家族。

圖6 比利時(shí)杜鵑花ANS基因編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域Fig.6 Conservative domains of ANS encoding protein in Rhododendron hybridum Hort

2.3.2 RhANS蛋白質(zhì)理化特性分析 利用ProtParam分析，得到RhANS蛋白的分子式為C1809H2843N483O537S13，相對(duì)分子質(zhì)量為40 367.17 Da、理論等電點(diǎn)為5.83，總負(fù)電荷殘基（Asp＋Glu）為53，總正電荷殘基（Arg + Lys）為43，不穩(wěn)定指數(shù)（Ⅱ）為48.58，脂肪系數(shù)為84.93。比利時(shí)杜鵑ANS蛋白為不穩(wěn)定帶負(fù)電荷的酸性蛋白質(zhì)。

2.3.3 RhANS蛋白疏水性分析 采用ProtScale對(duì)RhANS蛋白進(jìn)行疏水性分析（圖7）。結(jié)果顯示，ANS蛋白質(zhì)存在明顯的疏水區(qū)和親水區(qū)，其中第191位疏水區(qū)最高為2.456；第45和第46位親水區(qū)最低，為-3.000。綜上可知，RhANS蛋白質(zhì)為親水性蛋白質(zhì)。

圖7 比利時(shí)杜鵑花ANS蛋白質(zhì)疏水性/親水性預(yù)測(cè)Fig.7 Prediction of the hydrophobic/hydrophilic of ANS in Rhododendron hybridum Hort.

2.3.4 RhANS蛋白磷酸化位點(diǎn)分析 利用NetPhos 進(jìn)行推測(cè)，結(jié)果顯示比利時(shí)杜鵑花ANS蛋白質(zhì)存在30個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中包含12個(gè)絲氨酸（Ser），12個(gè)蘇氨酸（Thr），6個(gè)酪氨酸（Tyr）（圖8）。

圖8 比利時(shí)杜鵑花ANS蛋白質(zhì)氨基酸翻譯后磷酸化修飾預(yù)測(cè)Fig.8 Prediction of phosphorylation site after amino acid translation of ANS protein in Rhododendron hybridum Hort.

2.3.5 RhANS蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 利用SOPMA 對(duì)RhANS蛋白質(zhì)進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖9所示。有121個(gè)氨基酸參與形成α-螺旋，占總氨基酸的33.89%；有58個(gè)氨基酸參與形成延伸鏈，占總氨基酸的16.25%；有19個(gè)氨基酸參與β-轉(zhuǎn)角，占總氨基酸的5.32%；有159個(gè)氨基酸參與形成無規(guī)則卷曲，占總氨基酸的44.54%。結(jié)果表明，比利時(shí)杜鵑花ANS蛋白主要由不規(guī)則卷曲、α-螺旋和延伸鏈結(jié)構(gòu)組成。

圖9 比利時(shí)杜鵑花ANS蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.9 Predicted secondary structure of ANS protein in Rhododendron hybridum Hort.

采用Swiss Model對(duì)RhANS蛋白質(zhì)進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)（圖10），在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中選擇與ANS蛋白質(zhì)序列一致性最高的蛋白質(zhì)為模板進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，得到杜鵑ANS蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)模型。結(jié)果表明，比利時(shí)杜鵑花ANS蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果相符，主要是由α-螺旋和不規(guī)則卷曲構(gòu)成。

圖10 比利時(shí)杜鵑花ANS蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.10 Prediction of the three level structure of ANS protein in Rhododendron hybridum Hort.

2.4 比利時(shí)杜鵑花不同時(shí)期花瓣以及根、莖和葉中ANS基因的表達(dá)量分析

為探究RhANS對(duì)花青素合成的影響，通過qRTPCR分析RhANS在比利時(shí)杜鵑花花瓣不同發(fā)育階段以及根、莖和葉中的表達(dá)量。如圖11所示，RhANS在比利時(shí)杜鵑花花瓣發(fā)育不同時(shí)期以及根、莖、葉中均有表達(dá)。在4個(gè)花期的花瓣中，隨花瓣的發(fā)育ANS基因的表達(dá)水平呈上升趨勢(shì)，在S4時(shí)期表達(dá)量達(dá)到最高，是S1時(shí)期的6.39倍。RhANS基因在比利時(shí)杜鵑花花瓣中的表達(dá)量均比根、莖和葉組織中表達(dá)量高。在不同組織器官中，ANS在葉中表達(dá)量最高，莖和根中表達(dá)量無顯著差異。隨花瓣的發(fā)育RhANS表達(dá)量與花青素含量均呈上升趨勢(shì)，推測(cè)RhANS基因表達(dá)量影響花青素的合成。

圖11 比利時(shí)杜鵑花不同發(fā)育階段花瓣及不同組織的ANS基因表達(dá)量Fig.11 Expression of ANS genes in petals and tissues at different developmental stages of Rhododendron hybridum Hort.

2.5 RhANS蛋白制備、純化及體外酶活性分析

將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pET-28-RhANS和空載質(zhì)粒pET-28轉(zhuǎn)入大腸桿菌（BL21）中，以不含質(zhì)粒的大腸桿菌和空載質(zhì)粒pET-28轉(zhuǎn)入大腸桿菌作為蛋白陰性對(duì)照。如圖12所示，通過10% SDS-PAGE的可溶性蛋白大小約為40 kDa，與預(yù)期大小相近，說明RhANS蛋白在大腸桿菌中成功表達(dá)。

圖12 重組RhANS蛋白的10% SDS-PAGE分析Fig.12 10% SDS-PAGE analysis of recombinant RhANS protein

使用His60鎳超流樹脂和重力柱對(duì)6加入IPTG誘導(dǎo)劑的pET-28-RhANS重組質(zhì)粒中進(jìn)行蛋白純化，用10% SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果如圖13所示。純化后的RhANS蛋白大小約為40 kDa，與理論值相近。

圖13 重組RhANS蛋白純化后的10% SDS-PAGE分析Fig.13 10% SDS-PAGE analysis of recombinant RhANS protein after purification

在2-氧戊二酸（2OG）和Fe（Ⅱ）的作用下，純化的重組pET-28a-RhANS蛋白催化底物3，4-順式花青素，使用HPLC在530 nm處檢測(cè)純化的RhANS蛋白的活性。純化的重組pET-28a-RhANS蛋白催化底物3，4-順式花青素形成花青素，通過與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間和UV∕Vis光譜進(jìn)行比較，確認(rèn)其為花青素（圖14-A、C）；與空載體對(duì)照顯示，3，4-順式花青素未被催化為花青素（cyanidin）（圖14-B）。結(jié)果表明，純化后重組蛋白pET-28a-RhANS蛋白具有酶活性。

圖14 3，4-順式花青素為底物催化重組RhANS蛋白產(chǎn)物分析Fig.14 Analysis of 3，4-cis-anthocyanidin as substrate catalyzed recombinant RhANS protein product

3 討論

杜鵑花作為重要的觀賞性植物，花色是觀賞性植物最重要的定性特征之一?；ㄇ嗨卦诨ㄉ纬芍衅鹬鲗?dǎo)作用，但花青素的合成通路相關(guān)基因在杜鵑花花色形成過程中報(bào)道較少。為進(jìn)一步探究杜鵑花花色形成的生物學(xué)特性，本研究首次從比利時(shí)杜鵑花中克隆花青素合成酶（ANS）基因，其ORF長度為1 074 bp，編碼357個(gè)氨基酸。RhANS基因保守結(jié)構(gòu)域分析表明，比利時(shí)杜鵑花ANS編碼蛋白屬于2-氧戊二酸（2OG）和Fe（Ⅱ）依賴性加氧酶超家族。李小蘭等［30］預(yù)測(cè)花青素合成酶ANS基因具有Fe2+的2-酮戊二酸［2OG-Fe（Ⅱ）］雙加氧酶家族，與本研究結(jié)果相符。本研究發(fā)現(xiàn)，比利時(shí)杜鵑花ANS蛋白包含由His236、Asp238和His292組成的鐵離子結(jié)合位點(diǎn)（HxDxnH），以及由Arg302和Ser304構(gòu)成的2-酮戊二酸的結(jié)合位點(diǎn)（RxS）。趙榮等［31］預(yù)測(cè)墨法師（Aeonium arboreum）AaANS1蛋白包含由His236、Asp238和His292組成的鐵離子結(jié)合位點(diǎn)（HxDxnH）以及由Arg302和Ser304構(gòu)成2-酮戊二酸的結(jié)合位點(diǎn)（RxS），與本研究預(yù)測(cè)結(jié)果相符。本研究發(fā)現(xiàn)比利時(shí)杜鵑花ANS蛋白為不穩(wěn)定帶負(fù)電荷的酸性親水性蛋白質(zhì)，與陳可欣等［13］預(yù)測(cè)紫薇LiANS蛋白質(zhì)理化特性和蛋白疏水性結(jié)果相符。RhANS蛋白磷酸化位點(diǎn)分析表明，比利時(shí)杜鵑花ANS蛋白存在30個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中含有12個(gè)絲氨酸（Ser），12個(gè)蘇氨酸（Thr），6個(gè)酪氨酸（Tyr），與趙榮等［31］預(yù)測(cè)墨法師AaANS1蛋白磷酸化位點(diǎn)存在酪氨酸（Tyr）、蘇氨酸（Thr）和絲氨酸（Ser）殘基的結(jié)果相似。通過對(duì)RhANS蛋白質(zhì)二三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析可知，比利時(shí)杜鵑花ANS蛋白主要由無規(guī)則卷曲、α-螺旋和延伸鏈組成，與陳可欣等［13］紫薇LiANS蛋白質(zhì)二三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果相似。通過構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，杜鵑花ANS蛋白與越橘ANS蛋白（AFA53722.1）親緣關(guān)系較最近。本研究表明，RhANS基因在花色形成過程中起重要的作用。RhANS表達(dá)量在比利時(shí)杜鵑花花瓣的不同發(fā)育時(shí)期以及根、莖、葉中均表達(dá)，在衰亡期（S4）時(shí)期表達(dá)量最高，在花苞期（S1）時(shí)期表達(dá)量最低。隨著花瓣的發(fā)育，RhANS基因相對(duì)表達(dá)量與花青素含量均呈上升趨勢(shì)，這與黃玲等［12］關(guān)于郁金香ANS基因表達(dá)水平和花青素苷的研究結(jié)果一致。在比利時(shí)杜鵑花不同組織器官中，葉中表達(dá)量最高，莖和根中表達(dá)量較低。衡蒙等［11］發(fā)現(xiàn)，在華麗龍膽中，GsANS基因在根、莖、葉中的表達(dá)量均比花冠低，其中在葉中表達(dá)量最高，莖中最低，推測(cè)比利時(shí)杜鵑花花瓣中花青素的含量與ANS基因表達(dá)量呈高度相關(guān)，ANS基因在比利時(shí)杜鵑花花青素合成中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本研究發(fā)現(xiàn)，比利時(shí)杜鵑花RhANS蛋白純化前可溶性重組蛋白大小約為40 kDa。His60鎳超流樹脂和重力柱純化后的RhANS蛋白大小約為40 kDa，與生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的RhANS蛋白大小相近。體外酶活測(cè)定發(fā)現(xiàn)，目的蛋白具有ANS酶活性，這與Ye等［23］、Pang等［24］和姜翠翠等［29］關(guān)于ANS蛋白大小及體外酶活的研究結(jié)果基本一致。由此推測(cè)比利時(shí)杜鵑花RhANS蛋白具有酶活性，為進(jìn)一步驗(yàn)證RhANS基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

本研究深入研究了比利時(shí)杜鵑花克隆的ANS基因，后續(xù)可以通過關(guān)鍵基因的過表達(dá)［32］、基因沉默［33］、RNAi介導(dǎo)［34］等技術(shù)實(shí)現(xiàn)觀賞性植物花色新種質(zhì)創(chuàng)新，進(jìn)一步提高植物觀賞價(jià)值和品質(zhì)。此外，前人研究發(fā)現(xiàn)在東方百合［35］、煙草［9］中存在ANS基因家族，但在比利時(shí)杜鵑花中是否存在ANS基因家族，還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究首次從比利時(shí)杜鵑花中克隆出花青素合成酶（ANS）基因，全長1 074 bp，編碼357個(gè)氨基酸。比利時(shí)杜鵑花ANS蛋白屬于 2-氧戊二酸（2OG）和Fe（Ⅱ）依賴性加氧酶超家族，包含由His236、Asp238和His292組成的鐵離子結(jié)合位點(diǎn)（HxDxnH）以及由Arg302和Ser304構(gòu)成2-酮戊二酸的結(jié)合位點(diǎn)（RxS）。比利時(shí)杜鵑花ANS蛋白與越橘ANS蛋白（AFA53722.1）親緣關(guān)系較近。比利時(shí)杜鵑花ANS蛋白為不穩(wěn)定帶負(fù)電荷的酸性親水性蛋白。在比利時(shí)杜鵑花中，花青素含量和RhANS表達(dá)量都隨著花瓣的發(fā)育呈上升趨勢(shì)。在比利時(shí)不同組織器官中，葉中RhANS表達(dá)量最高，莖和根中表達(dá)量無顯著差異。通過構(gòu)建pET-28a-RhANS原核表達(dá)載體誘導(dǎo)的蛋白大小約為40 kDa。HPLC檢測(cè)表明，RhANS蛋白具有ANS酶活性。