Parkin共調(diào)基因調(diào)控功能與疾病研究進(jìn)展

趙海洲，李 軍，馬延紅，劉文華

(肇慶學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣東 肇慶 526061)

Parkin共調(diào)基因(Parkin co-regulated gene, PACRG)于2003年被克隆、鑒定[1]。Parkin是與帕金森病(Parkinson’s disease, PD)相關(guān)的一個(gè)基因，其基因缺失或突變呈現(xiàn)常染色體隱性遺傳的青少年型帕金森病(autosomal recessive juvenile parkinsonism, ARJP)。研究顯示，Parkin基因編碼的蛋白是一個(gè)E3泛素連接酶，通過(guò)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)來(lái)降解異常折疊蛋白，參與氧化應(yīng)激及線粒體功能調(diào)控等多種途徑，發(fā)揮保護(hù)功能[2]。PACRG蛋白和α、β-tubulin相結(jié)合，促進(jìn)微管成束，穩(wěn)定微管結(jié)構(gòu)[3]；是鞭毛、纖毛和精子尾部軸絲結(jié)構(gòu)的組成部分，在鞭毛、纖毛以及精子的運(yùn)動(dòng)過(guò)程中起重要作用[4]；與減數(shù)分裂表達(dá)基因1蛋白(meiosis expressed gene 1, MEIG1)相互作用，與精子形成密切相關(guān)[5]；與分子伴侶熱休克蛋白90、70(Hsp90、Hsp70)、T-復(fù)合物1(TCP1α、TCP1β、TCP1θ)發(fā)生相互結(jié)合，起到細(xì)胞保護(hù)作用[6]；與Parkin蛋白相互結(jié)合，對(duì)Parkin的底物類內(nèi)皮素受體(Parkin associated endothelin receptor-like, Pael-R)引起的細(xì)胞損傷起保護(hù)作用[6]。

PACRG和Parkin在心、腦、骨骼肌等部位都有較高的表達(dá)，而在肺、肝等Parkin表達(dá)較低的部位，PACRG也有相對(duì)較高的表達(dá)。PACRG基因全長(zhǎng)600 kb，以頭對(duì)頭的方式位于Parkin基因的反義鏈上，兩個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)之間只有204 bp的長(zhǎng)度，且共用1個(gè)雙向啟動(dòng)子。PACRG的開(kāi)放讀碼框編碼257個(gè)氨基酸，其蛋白分子量約33 ku。蛋白序列同源性分析顯示，PACRG基因編碼的蛋白在物種之間具有高保守性，整個(gè)PACRG蛋白序列在人、小鼠和果蠅之間的一致性達(dá)到了29%，而蛋白羧基端的序列一致性更是達(dá)到了80%。通過(guò)蛋白序列比對(duì)和功能分析，暫還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)PACRG蛋白序列上存在功能域結(jié)構(gòu)，但通過(guò)Propsearch分析發(fā)現(xiàn)，PACRG和泛素融合降解蛋白1 (ubiquitin fusion degradation protein 1)存在弱的同源性，后者是參與胞內(nèi)蛋白泛素化降解的一個(gè)蛋白[1]。

近期，通過(guò)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)分析對(duì)PACRG的研究結(jié)果顯示，PACRG基因與癌癥、肺結(jié)核、麻風(fēng)病、傷寒副傷寒等疾病的發(fā)生存在相關(guān)性，但其機(jī)制還不清楚。雖然關(guān)于Parkin相關(guān)的研究已有大量文獻(xiàn)報(bào)道，但有關(guān)PACRG的研究文獻(xiàn)還相對(duì)較少，本文對(duì)其調(diào)控功能與相關(guān)疾病方面的研究進(jìn)行綜述。

1 PACRG是鞭毛、纖毛和精子尾部軸絲結(jié)構(gòu)的組成部分

1.1PACRG與鞭毛、纖毛真核生物的鞭毛、纖毛軸絲微管排列是9+2式，即外圈是9組二聯(lián)微管，中央一對(duì)微管。Dawe等[7]于2005年首先發(fā)現(xiàn)PACRG蛋白是布氏錐蟲(chóng)(Trypanosoma brucei)鞭毛軸絲的組成成分。敲減PACRG表達(dá)后，引起外圈二聯(lián)微管1個(gè)或多個(gè)缺失，從而導(dǎo)致鞭毛不能正常運(yùn)動(dòng)，布氏錐蟲(chóng)生長(zhǎng)減慢[7]。另有研究發(fā)現(xiàn)，PACRG蛋白除了位于軸絲的二聯(lián)微管外，在衣藻的胞體、軸絲三聯(lián)微管、細(xì)胞中心粒均有表達(dá)。中心粒在細(xì)胞間期作為基礎(chǔ)體，使纖毛和鞭毛組合成核，這可能是PACRG影響纖毛和鞭毛裝配的機(jī)制之一[8]。近期的研究還揭示了PACRG調(diào)控鞭毛或纖毛運(yùn)動(dòng)的機(jī)制，PACRG蛋白與軸絲內(nèi)中心裝置、徑向輻條及軸絲動(dòng)力蛋白發(fā)生相互作用，通過(guò)調(diào)節(jié)軸絲動(dòng)力蛋白的動(dòng)力臂和微管之間的滑行，從而控制鞭毛、纖毛的運(yùn)動(dòng)[4]。

1.2PACRG與精子Quaking (Viable) (qkv)小鼠的基因突變是由于17號(hào)染色體發(fā)生了約1 Mb的自發(fā)隱性缺失，突變鼠表現(xiàn)出中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘形成障礙、震顫、雄性不育等病理癥狀。序列研究發(fā)現(xiàn)，qkv突變鼠1 Mb的缺失片段包括了qkI基因部分啟動(dòng)子、Parkin基因全部啟動(dòng)子和外顯子1～5及PACRG整個(gè)基因序列，引起突變鼠的qkI蛋白表達(dá)降低，以及Parkin和PACRG表達(dá)缺失。qkv突變鼠表現(xiàn)出雄性不育，其精子數(shù)量少，且不能正常運(yùn)動(dòng)，但如果將這些精子的細(xì)胞核通過(guò)顯微操作注射到小鼠卵細(xì)胞，受精卵細(xì)胞則能發(fā)育成正常小鼠。Lorenzetti等[9]采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，在qkv突變鼠中導(dǎo)入PACRG編碼序列，產(chǎn)生了qkv/qkvTg(Pacrg)轉(zhuǎn)基因鼠，轉(zhuǎn)基因♂小鼠產(chǎn)生能夠正常運(yùn)動(dòng)的精子，并恢復(fù)了生育能力，這項(xiàng)結(jié)果說(shuō)明PACRG蛋白是精子正常發(fā)育所必需。對(duì)人類男性不育病例的研究顯示，PACRG編碼區(qū)突變與男性不育沒(méi)有相關(guān)性，但PACRG/Parkin基因共享啟動(dòng)子區(qū)域的突變與男性不育具相關(guān)性，推測(cè)可能是啟動(dòng)子突變引起了PACRG轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平的降低[10]。

減數(shù)分裂表達(dá)基因1蛋白對(duì)小鼠的精子發(fā)生起重要作用，MEIG1基因敲除小鼠精子尾部軸絲異常，無(wú)精子頭和精子領(lǐng)形成，這與PACRG基因敲除小鼠(qkv)的表型相似。酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)證明，PACRG蛋白與MEIG1存在相互作用，MEIG1和PACRG蛋白形成復(fù)合物，MEIG1可以穩(wěn)定PACRG的結(jié)構(gòu)[5]。蛋白結(jié)構(gòu)解析和點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)證明了MEIG1關(guān)鍵蛋白位點(diǎn)W50、K57、F66、Y68對(duì)于穩(wěn)定MEIG1/PACRG復(fù)合物起主要作用。MEIG1/PACRG復(fù)合物對(duì)于精子尾部裝配期間將貨物定向到精子領(lǐng)至關(guān)重要，具體表現(xiàn)為PACRG蛋白招募MEIG1到精子領(lǐng)上，形成MEIG1/PACRG復(fù)合體，該復(fù)合體通過(guò)其他配合物或動(dòng)力蛋白與微管相互作用，將貨物(如SPAG16L等)運(yùn)輸至精子領(lǐng)，從而裝配精子尾部[5]。

1.3PACRG與腦積水PACRG蛋白是小鼠室管膜細(xì)胞，以及腦室內(nèi)纖毛的組成部分。qkv小鼠由于缺乏PACRG表達(dá)，會(huì)發(fā)展為獲得性輕度腦積水(hydrocephalus, HC)。qkv小鼠腦室纖毛結(jié)構(gòu)與野生型對(duì)照的一樣，但室管膜纖毛擺動(dòng)頻率降低，纖毛介導(dǎo)的室管膜流的流速下降到野生型小鼠的32%。PACRG的瞬時(shí)表達(dá)可以使qkv突變體中的獲得性輕度HC缺陷表型恢復(fù)正常[11]。

1.4PACRG與胚胎發(fā)育Thumberger等[12]的研究結(jié)果表明，在胚胎發(fā)育早期，PACRG蛋白特異性地定位表達(dá)于能夠產(chǎn)生左向液流的表皮組織，如非洲爪蟾的原腸腔頂板、斑馬魚(yú)的庫(kù)氏囊泡以及哺乳動(dòng)物的后脊索。這些胚胎表皮組織帶有纖毛，能產(chǎn)生胞外左向液流，與動(dòng)物的左右不對(duì)稱發(fā)育有關(guān)。非洲爪蟾敲減PACRG表達(dá)后，引起原腸腔頂板輪廓畸形，頂板表面積擴(kuò)大，纖毛長(zhǎng)度和擺動(dòng)頻率減小，左向液流消失，左右不對(duì)稱發(fā)育的起始信號(hào)分子Pitx2c表達(dá)缺失，從而導(dǎo)致左右不對(duì)稱發(fā)育缺陷[12]。

PACRG蛋白還參與了不依賴于纖毛的一些胚胎發(fā)育過(guò)程，包括原腸胚發(fā)育和神經(jīng)管的閉合。PACRG高劑量敲低會(huì)導(dǎo)致原腸胚胚孔閉合失敗，其機(jī)制可能是胚孔閉合依賴于瓶狀細(xì)胞的頂端部位收縮，該部位收縮需要有穩(wěn)定微管的支持，而PACRG蛋白可以結(jié)合并促進(jìn)微管成束，穩(wěn)定微管[3]。中劑量敲低PACRG可以引起神經(jīng)管閉合缺陷，補(bǔ)回PACRG可以消除該缺陷。神經(jīng)管閉合依賴神經(jīng)板細(xì)胞的頂端部位收縮，該過(guò)程與原腸胚瓶狀細(xì)胞的頂端部位收縮類似，也依賴于PACRG蛋白參與的微管成束和微管穩(wěn)定[12]。

2 PACRG與帕金森病

PACRG和Parkin共用1個(gè)雙向啟動(dòng)子，它們?cè)诠δ苌峡赡艽嬖谙嚓P(guān)性。Imai等[6]研究發(fā)現(xiàn)，PACRG蛋白能夠和Parkin，以及Pael-R共同形成包涵體，并抑制Pael-R誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，提示PACRG蛋白可能通過(guò)促進(jìn)路易體的形成，對(duì)多巴胺能神經(jīng)元起到保護(hù)作用。另外的研究也觀察到PACRG是路易體的組成成分，只有當(dāng)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)受到抑制時(shí)，才能檢測(cè)到內(nèi)源性PACRG的表達(dá)，推測(cè)PACRG蛋白受到了該系統(tǒng)的降解[13]。進(jìn)一步的研究顯示，當(dāng)?shù)鞍酌阁w受到抑制后，PACRG蛋白促進(jìn)蛋白聚集體的形成，增強(qiáng)自噬作用，對(duì)BE(2)M17細(xì)胞具有保護(hù)作用[14]。采用免疫組化方法，在PD和多系統(tǒng)萎縮(multiple system atrophy, MSA)患者的路易體和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞胞內(nèi)包涵體中檢測(cè)到PACRG蛋白，表明PACRG可能在PD的發(fā)生中起作用，但其機(jī)制有待深入研究[6,13]。

PACRG基因突變與早發(fā)性帕金森病(early-onset parkinsonism, EOPD)之間是否存在相關(guān)性，已有兩篇文獻(xiàn)報(bào)道。Deng等[15]研究了112例白種人EOPD患者的PACRG基因序列，發(fā)現(xiàn)了3個(gè)位點(diǎn)的單核苷酸雜合子變體，但這幾個(gè)點(diǎn)突變不影響PACRG的RNA拼接和氨基酸序列，與EOPD之間無(wú)致病相關(guān)性。Taylor等[16]分析了76例臺(tái)灣EOPD患者PACRG基因序列，發(fā)現(xiàn)了內(nèi)含子區(qū)3個(gè)位點(diǎn)的單核苷酸雜合子變體，也不影響PACRG的RNA拼接和氨基酸序列，與EOPD之間不存在致病相關(guān)性。另外，該研究組還發(fā)現(xiàn)了3例EOPD患者出現(xiàn)了外顯子重復(fù)或缺失的雜合子突變，他們認(rèn)為PACRG外顯子重復(fù)或缺失引起的單倍劑量不足可能與EOPD存在相關(guān)性[16]。

3 PACRG與麻風(fēng)病

麻風(fēng)病是由麻風(fēng)分枝桿菌(M.leprae)引起的慢性感染性疾病，每年新增約70萬(wàn)人。帶菌者中約10%會(huì)發(fā)展成麻風(fēng)病，研究發(fā)現(xiàn)，免疫力低下、環(huán)境毒素、遺傳基因等多因素與麻風(fēng)病易感性有關(guān)。正向遺傳學(xué)全基因組篩選發(fā)現(xiàn)，麻風(fēng)病易感基因位點(diǎn)主要包括6p21HLA-DRB1和LTA, 6q25-q26Parkin/PACRG等。Mira等[17]對(duì)越南和巴西麻風(fēng)病的單身家庭進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)Parkin/PACRG共享啟動(dòng)子區(qū)域17個(gè)SNP標(biāo)記與麻風(fēng)病存在明顯關(guān)聯(lián)，特別是SNP標(biāo)記PARK2_e01(-2599)和rs1040079。使用多變量分析，Alter等[18]重申了Mira等關(guān)于越南人群Parkin和PACRG共享啟動(dòng)子區(qū)域的易感基因座的研究結(jié)果。他們還發(fā)現(xiàn)2個(gè)SNP，rs1333955和rs2023004與印度北部人口的麻風(fēng)病易感性相關(guān)。Bakija-Konsuo等[19]對(duì)歐洲克羅地亞兩個(gè)孤立島人群麻風(fēng)病遺傳易感性研究，也發(fā)現(xiàn)Parkin/PACRG啟動(dòng)子區(qū)域SNP與麻風(fēng)病致病呈相關(guān)性。

關(guān)于麻風(fēng)病的致病機(jī)制并不十分清楚，研究表明，泛素-蛋白酶體途徑參與了麻風(fēng)分枝桿菌的感染過(guò)程。Parkin具有抗氧化、抗凋亡等作用，能提高宿主對(duì)麻風(fēng)分枝桿菌的抵抗性。PACRG與Parkin能夠共同對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的細(xì)胞損傷起到保護(hù)作用。而Parkin/PACRG共享啟動(dòng)子區(qū)的突變可能影響到這兩種蛋白的表達(dá)，這些因素可能是該共享啟動(dòng)子區(qū)多態(tài)性位點(diǎn)與麻風(fēng)病致病性具有相關(guān)性的原因。

4 PACRG與癌癥

4.1腎透明細(xì)胞癌通過(guò)qPCR和組織微陣列免疫組化方法，Toma等[20]發(fā)現(xiàn)，腎透明細(xì)胞癌病人中，PACRG和Parkin的mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯下降，mRNA和蛋白表達(dá)水平越低，病人的無(wú)病生存期和總生存期越短。其原因可能是PACRG和Parkin蛋白具有抑癌基因功能，通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑起到細(xì)胞保護(hù)作用，或是通過(guò)微管來(lái)抑制細(xì)胞增殖和細(xì)胞遷移[3, 20]。

4.2白血病Agirre等[21]檢測(cè)分析了195例急性淋巴細(xì)胞性白血病患者和60例慢性粒細(xì)胞性白血病患者的骨髓樣品，結(jié)果顯示，在兩種疾病中，Parkin/PACRG共享啟動(dòng)子區(qū)出現(xiàn)異常高甲基化的比例分別為26%和20%，異常高甲基化導(dǎo)致了Parkin和PACRG mRNA水平下降。文章作者認(rèn)為，高甲基化引起的Parkin和PACRG蛋白表達(dá)水平下降，與血液腫瘤的發(fā)生具有相關(guān)性[21]。

4.3星形或膠質(zhì)細(xì)胞瘤Ichimura等[22]采用覆蓋6號(hào)染色體98.3%序列的tile path芯片技術(shù)，對(duì)104例星形細(xì)胞瘤病人的腫瘤和血液樣品進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)6號(hào)染色體在星形細(xì)胞瘤中發(fā)生高頻率缺失，最頻繁缺失區(qū)域包括PACRG、QKI和ARID1B(AT-rich interactive domain-containing protein 1B)基因。根據(jù)研究結(jié)果，Ichimura等[22]認(rèn)為，缺失區(qū)域內(nèi)的PACRG、QKI、ARID1B等基因可能具有腫瘤抑制基因的功能。

5 PACRG與其他疾病

5.1肺結(jié)核Udina等[23]通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法，對(duì)俄羅斯圖瓦共和國(guó)兩個(gè)地區(qū)的結(jié)核病人Parkin/PACRG共享啟動(dòng)子區(qū)的兩個(gè)SNP位點(diǎn)PARK2-e01(-697)和rs1333955進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，與健康人群相比，結(jié)核病患者的這兩個(gè)SNP位點(diǎn)顯示出較多的雜合子表現(xiàn)型，表明該標(biāo)記對(duì)結(jié)核病的發(fā)病率存在影響。

5.2傷寒副傷寒Ali等[24]對(duì)印度尼西亞雅加達(dá)地區(qū)傷寒和副傷寒患者Parkin/PACRG基因簇內(nèi)PARK_e01(-697)、PARK2_e01(-2599)、rs1333955和rs1040079這4個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其中的PARK2_e01(-2599)位點(diǎn)的多態(tài)性與傷寒副傷寒致病具有相關(guān)性[24]。但該相關(guān)性要比此位點(diǎn)與麻風(fēng)病的相關(guān)性低。

6 PACRG與信號(hào)傳導(dǎo)

Loucks等[25]發(fā)現(xiàn)，PACRG蛋白定位在秀麗隱桿線蟲(chóng)ASE和OLQ神經(jīng)元的非運(yùn)動(dòng)性纖毛，它影響著味覺(jué)可塑性的學(xué)習(xí)行為，即在無(wú)食物狀態(tài)下，長(zhǎng)時(shí)間暴露于化學(xué)引誘劑NaCl溶液之后，線蟲(chóng)會(huì)降低對(duì)NaCl的化學(xué)趨向性甚至回避，功能上與G蛋白信號(hào)傳遞相關(guān)。突變或過(guò)表達(dá)PACRG，會(huì)破壞秀麗隱桿線蟲(chóng)的味覺(jué)可塑性學(xué)習(xí)行為，這與G蛋白偶聯(lián)受體(G-protein-coupled receptor, GPCR)GPC-1(Gγ)對(duì)味覺(jué)可塑性的影響模式相一致。作者通過(guò)雙突變實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PACRG蛋白與GPCR亞基GPC-1(Gγ)、GPA-1(Gα)處在同一信號(hào)通路，影響味覺(jué)可塑性，而與GPCR亞基ODR-3(Gα)、GPA-11(Gα)則處在不同信號(hào)通路上，調(diào)控味覺(jué)可塑性[25]。

線蟲(chóng)類存在纖毛感覺(jué)靈敏度降低，伴隨壽命變長(zhǎng)的現(xiàn)象。對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)的研究發(fā)現(xiàn)，PACRG與線蟲(chóng)的壽命有關(guān)。相比于野生型組，PACRG突變組秀麗隱桿線蟲(chóng)的壽命變短，而對(duì)PACRG突變組回復(fù)表達(dá)PACRG-GFP蛋白，可以延長(zhǎng)線蟲(chóng)壽命，但PACRG此功能不依賴于GPCR。另一纖毛蛋白EFHC1和PACRG蛋白共定位于OLQ神經(jīng)元，它也具有延長(zhǎng)壽命的功能。雙突變實(shí)驗(yàn)證明，EFHC1和PACRG處在同一信號(hào)通路，都處在促進(jìn)長(zhǎng)壽的FOXO轉(zhuǎn)錄因子DAF-16的上游，通過(guò)正向調(diào)控胰島素/IGF信號(hào)途徑來(lái)延長(zhǎng)線蟲(chóng)壽命[25]。

7 總結(jié)與展望

自2003年P(guān)ACRG基因被克隆、鑒定以來(lái)，國(guó)外、國(guó)內(nèi)共有50多篇相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，這些研究主要集中于PACRG對(duì)微管功能的調(diào)節(jié)，與麻風(fēng)病、肺結(jié)核、傷寒副傷寒、癌癥等疾病的相關(guān)性，以及神經(jīng)保護(hù)作用。其中，PACRG對(duì)微管功能的影響，參與鞭毛、纖毛軸絲，以及精子尾部的結(jié)構(gòu)組成，這些方面的研究已較為深入。PACRG缺失后，致使鞭毛、纖毛、以及精子不能正常運(yùn)動(dòng)，從而導(dǎo)致胚胎發(fā)育障礙、腦積水、雄性不育等病癥。PACRG和Parkin共同作用，通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞自噬等途徑，對(duì)Parkin底物引起的細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，但其機(jī)制有待深入研究。SNP分析結(jié)果表明，PACRG與麻風(fēng)病、肺結(jié)核、傷寒副傷寒等疾病具相關(guān)性，但其機(jī)制還不清楚，需要深入研究闡明。PACRG與幾種癌癥的發(fā)病呈相關(guān)性，PACRG基因缺失、啟動(dòng)子甲基化等引起的蛋白表達(dá)異常，可能是其與癌癥發(fā)生相關(guān)的原因，其抑癌機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。國(guó)內(nèi)有關(guān)PACRG的研究較少，Li等SNP研究結(jié)果顯示，其他人種中與麻風(fēng)病相關(guān)的幾個(gè)位點(diǎn)，在中國(guó)人群中顯示出非相關(guān)性。針對(duì)PACRG蛋白表達(dá)不穩(wěn)定，在胞內(nèi)易降解的特點(diǎn)，劉晙玭等運(yùn)用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，在昆蟲(chóng)細(xì)胞系成功表達(dá)了PACRG蛋白。還有其他兩篇文獻(xiàn)報(bào)道了PACRG與精子發(fā)育及與輻射的關(guān)系。PACRG基因被克隆、鑒定以來(lái)，已發(fā)現(xiàn)其與胞內(nèi)一些重要功能密切相關(guān)。但從其蛋白結(jié)構(gòu)上也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明確的功能域結(jié)構(gòu)。因此，對(duì)PACRG展開(kāi)深入研究，揭示其胞內(nèi)調(diào)控作用機(jī)制，具有重要意義。