黏液型銅綠假單胞菌的毒力基因、產(chǎn)金屬酶檢測與耐藥性研究

謝國艷，高志生，李星軍，錢敏健，李小蘭

(1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院崇明分院 檢驗科,上海202150；2.重慶市兩江新區(qū)第一人民醫(yī)院 檢驗科,重慶401121)

銅綠假單胞菌(PAE)是醫(yī)院感染的主要致病菌之一，根據(jù)其菌落形態(tài)及是否產(chǎn)生藻酸鹽形成生物膜分為黏液型和非黏液型。近年來黏液型PAE不斷增多，其易黏附在組織黏膜上并且不易被吞噬，使其逃避機體免疫清除和增強了對抗菌藥物的耐藥性[1]，常出現(xiàn)體外藥敏結(jié)果與臨床治療不一致的現(xiàn)象，而產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶(MBLs)且攜帶毒力基因的黏液型PAE菌株的不斷增多，更給臨床治療帶來更大的難題。PAE致病機制與Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)密切相關(guān)[2]，T3SS主要分泌ExoS、ExoT、ExoY、ExoU 4種毒素，exoU和exoY具有快速而獨特的細胞毒作用，危害最大，exoS和exoT基因感染相對較輕，而ExoT是所有菌株都會產(chǎn)生的，因此本研究擬分析兩種表型PAE的毒力基因exoS、exoU、exoY的攜帶情況、MBLs的流行及耐藥情況，為本地區(qū)臨床診斷治療提供幫助。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株來源 收集自我院2014年6月至2016年11月臨床非重復(fù)分離的200株P(guān)AE(篩選出82株黏液型和118株非黏液型菌株)，菌株經(jīng)ATB細菌鑒定儀進行菌種鑒定，以甘油肉湯-20℃保存?zhèn)溆?。銅綠假單胞菌ATCC 27853、肺炎克雷伯菌ATCC70063購自上海市臨檢中心。

1.1.2儀器及試劑 ATB細菌鑒定儀與ID 32 GN鑒定板(法國梅里埃)、7000型熒光定量PCR擴增儀(美國Applied Biosystems)、凝膠成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD)、MH瓊脂平皿(上?？片敿?、藥敏紙片(英國OXOID)；引物和探針及測序由上海生工公司完成。

1.2方法

1.2.1細菌鑒定及藥敏試驗采用ATB細菌鑒定儀進行菌種鑒定。表型分型則選取生長緩慢(35℃培養(yǎng)48 h后血平板可見濕潤、透明似小水滴樣、黏稠，麥康凱平板上形成無色半透明、嵌入培養(yǎng)基中不易挑起的黏液狀菌落)，進一步氧化酶陽性、挑絲試驗陽性者判定為黏液型PAE[3]。采用紙片擴散法進行藥敏試驗[4]，銅綠假單胞菌ATCC27853作為質(zhì)控菌株。

1.2.2MBLs檢測 改良Hodge試驗(PAE-MHT)法[5]。

1.2.3毒力基因的檢測 根據(jù)參考文獻[6,7]設(shè)計引物(由上海博亞公司合成)。細菌DNA的制備采用煮沸裂解法，取上清液2 μl用于PCR擴增。PCR反應(yīng)體積為50 μl，包括25 mmol/LMgCl24 μl，10×PCR緩沖液5 μl，上、下游引物各0.5 μl，dNTP 1 μl，Taq酶3 μl，模板2 μl，無菌蒸餾水34 μl，石蠟油覆蓋。擴增條件：94℃5 min；續(xù)以94℃30s；exoS、exoY和exoU退火溫度分別為55℃、55℃和59℃，30 s；72℃1 min,35個循環(huán)；72℃延伸5 min。取5 μl PCR產(chǎn)物采用20 g/L瓊脂糖凝膠進行電泳分析。未加模板的無菌蒸餾水作為陰性對照。毒力基因引物序列和目的產(chǎn)物長度見表1。PCR擴增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察分析結(jié)果。選取擴增陽性產(chǎn)物純化后測序，結(jié)果與GeneBank中已知序列對比分析。

表1 引物序列表

1.2.4統(tǒng)計學(xué)分析 用SPSS 13.0軟件進行。組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1兩種表型的菌落對15種抗生素的耐藥情況見表2。

表2 不同表型對13種抗生素的耐藥情況(%)

2.2MBLs檢測PAE-MHT法檢測200株P(guān)AE，其中82株黏液型陽性率為3.7%(3/82)，118株非黏液型陽性率為13.6%(16/118)，非黏液型MBLs陽性率明顯高于黏液型(P<0.05)。

2.3毒力基因檢測PCR擴增82株黏液型的exoS、exoU、exoY，陽性率分別31.6%，12.7%，72.3%；118株非黏液型的exoS、exoU、exoY，陽性率分別23.3%，8.2%，65.1%。黏液型與非黏液型3種毒力基因陽性率均無顯著性差異(P>0.05)。幾個毒力基因電泳圖譜見圖1。

2.4基因型的分布共存在6種基因型，兩種表型菌株的基因型比較見表3。

3 討論

T3SS是PAE致病性的重要毒力系統(tǒng)，其中exoS和exoU的臨床意義尤為重要，Hauser等[8]研究顯示，exoU+為細胞毒型基因，表達蛋白exoU引起細胞壞死、凋亡，危害最大；exoS+為侵襲型基因，是PAE在感染過程中實現(xiàn)增殖和傳播的主要毒力因子，表達蛋白exoS能抑制宿主細胞吞噬作用、破壞肌動蛋白細胞骨架重排、導(dǎo)致細胞凋亡和抑制細胞分裂等，感染相對較輕；exoU+基因型的PAE毒力更強，感染后癥狀更嚴(yán)重，患者病死率更高。本研究共檢測3種毒力基因，獲得6種基因型。3種毒力基因陽性率黏液型均高于非黏液型，但兩者比較無顯著性差異；比較兩種表型的6種基因型，除exoU+/exoS-/exoY-和exoU-/exoS-/exoY-兩種基因型非黏液型明顯高于黏液型外，其余四種基因型的比較無顯著性差異。未發(fā)現(xiàn)三種基因同時存在或exoU、exoS這兩種基因同時存在的菌株，與exoS和exoU具有排它性、不同時存在于同一菌株的結(jié)論[9]相吻合。

注：M為DNA Marker(DL 1000)；3為陰性對照；5為陰性株；1，4為exoY基因陽性分離株；2，7，8為exoU基因陽性分離株；6為exoS基因陽性分離株。

表3 兩種表型菌株的基因型比較(%)

黏液型PAE是其在自然界中存在的一種特殊形式，非黏液型在一定的條件下可轉(zhuǎn)化成黏液型，其表面存在大量以多糖藻酸鹽為主要成分的黏液，從而可形成生物膜[10]。由于黏液型PAE生長緩慢，菌落黏稠，往往全自動儀器檢測藥敏失敗，因此本研究采用K-B法對兩種表型的PAE進行藥敏檢測。從表2看出，兩種表型的PAE對妥布霉素、亞胺培南、美羅培南、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢吡肟的耐藥率較低(<20%)；其次為阿米卡星、慶大霉素、頭孢他啶、頭孢哌酮、左旋氧氟沙星(>20%)；而對氨曲南、哌拉西林的耐藥率較高(>40%)。對兩種表型的PAE耐藥性進行比較，發(fā)現(xiàn)非黏液型對各種抗生素的耐藥率均高于黏液型，其中慶大霉素、氨曲南和左氧氟沙星前者明顯高于后者，同時非黏液型對碳青霉烯類的耐藥率也明顯高于黏液型，這與非黏液型MBLs陽性率明顯高于黏液型相一致，也證實了產(chǎn)MBLs是PAE對碳青霉烯類抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性的重要機制[5]。

筆者還發(fā)現(xiàn)，臨床反饋PAE根據(jù)藥敏譜選擇敏感抗生素后，非黏液型療效較好，而黏液型療效不佳。在對產(chǎn)黏液型的同一病人5天后再次進行耐藥監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)此表型的菌株藥敏譜變化不大，說明在短期內(nèi)無新的耐藥機制產(chǎn)生，推測黏液型PAE體外實驗敏感而體內(nèi)用藥無效的原因是因為生物被膜的形成阻擋抗生素對細菌起作用[11]。由于生物膜的特殊性，黏液型菌株比非黏液型定植更持久，感染更不易清除[12]。因此針對PAE感染，應(yīng)盡早盡快選擇敏感藥物治療，以免非黏液型轉(zhuǎn)化成黏液型后，增加治療難度。

[1]Borlee B R,Goldman A D,Murakami K,et al.Pseudomonas aeruginosa uses a cyclic-di-GMP-regulated adhesion to reinforce the biofilm extracellular matrix[J].Mol Microbiol,2010,75(4):827.

[2]Tran QT,Nawaz MS,Deck J,et al.Detection of type Ⅲ secretion system virulence and mutations in gyrA and parC genes among quinolone-resistant strains of Pseudomonas aeruginosa isolated from imported shrimp[J].Foodbome Pathog Dis,2011,8(3):451.

[3]周庭銀．臨床微生物學(xué)診斷與圖解[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,2012:229-230.

[4]藍 鍇,張偉錚,羅 強,等.不同方法檢測黏液型銅綠假單胞菌藥物敏感性結(jié)果準(zhǔn)確性探討[J].檢驗醫(yī)學(xué),2012,27(7):544.

[5]謝國艷,高志生,許 俊,等.PAE-MHT法檢測銅綠假單胞菌金屬β-內(nèi)酰胺酶的臨床適用性的評估[J].中國實驗診斷學(xué),2014,18(6):982.

[6]吳愛武,黃子然.銅綠假單胞菌exoS、exoU基因的檢測與分析[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2013,23(1):129.

[7]類承斌,晁 艷,孫相紅,等.銅綠假單胞菌毒力基因檢測及臨床意義[J].臨床檢驗雜志,2011,29(4):31.

[8]Hauser AR.The TypeIII secretionsystem of Pseudomonas aeruginosa:infection by injection[J].NatRev Microbiol,2009,7(9):654.

[9]卓 越,王露霞,肖書念,等.銅綠假單胞菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)相關(guān)毒力基因的臨床意義[J].中華燒傷雜志,2010,26(5):354.

[10]高巧營，吳尚為．黏液型銅綠假單胞菌生物膜形成的研究進展[J].中國感染控制雜志,2011,10(2):158.

[11]Yanagihara K,Tomono K,Sawai T,et al.Combination therapy for chronic Pseudomonas aeruginosa respiratory infection associated with biofilm formation[J].J Antimicrob Chemother,2000,46(1):69.

[12]Ciofu O,Lee B,Johannesson M,et al.Investigation of the algT operon sequence in mucoid and non-mucoid Pseudomonas aeruginosa isolates from 115 scandinavian patients with cystic fibrosis and in 88 in vitro non-mucoid revertants[J].Microbiology,2008,154(Pt1):103.