CCR6、Th9細(xì)胞、Th17/Treg細(xì)胞失衡在大鼠肺纖維化中的表達(dá)及意義

李樹(shù)民,鮑文華,趙艷景,馬雪梅,楊曉東,梁姍姍

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 佳木斯154002)

肺纖維化(pulmonary fibrosis，PF)是一種病因復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制尚不十分明確的肺部間質(zhì)性疾病，近年來(lái)發(fā)病率、死亡率均逐年增高。其主要病理改變呈現(xiàn)為彌漫性肺泡炎及肺成纖維細(xì)胞灶形成、細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積[1]。前期試驗(yàn)中針對(duì)CCR6-CCL20軸、Th9細(xì)胞相關(guān)因子與肺纖維化發(fā)生機(jī)制的關(guān)系已有所研究[2，3]，而近年來(lái)有關(guān)Th17/Treg失衡的研究備受關(guān)注。相關(guān)文獻(xiàn)[4]指出自身免疫性疾病發(fā)生的重要原因之一為Th17/Treg比例失衡，Th17 與Treg之間保持動(dòng)態(tài)平衡對(duì)于機(jī)體內(nèi)環(huán)境的維持意義重大。本研究擬通過(guò)建立大鼠肺纖維化模型，觀察CCR6、Th9相關(guān)因子及Th17/Treg失衡在大鼠肺纖維化模型的肺組織中變化特點(diǎn)，探究CCR6、Th9相關(guān)因子和Th17/Treg比例失衡與肺纖維化發(fā)病機(jī)制的關(guān)系和意義，為臨床治療肺纖維化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑63只SD大鼠(健康雄性清潔級(jí))，體重約( 220±30) g，購(gòu)買于大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，清潔級(jí)標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)(合格證號(hào):scxle(黑) 2013007)；鹽酸博來(lái)霉素(美國(guó)Invitrogen公司)；地塞米松注射液(購(gòu)置于輝瑞制藥有限公司)；10%水合氯醛、乙醇、蒸餾水等(天津化學(xué)試劑三廠生產(chǎn))；Anti-CCR6 antibody一抗、SP二抗(美國(guó)abcam公司)；IL-9抗體(Abcam公司提供)； PE-Cy5 anti-Rat CD4(大鼠抗小鼠 CD4單克隆流式抗體，美國(guó)BDP harmingen);PE anti-mouse IL-17及同型對(duì)照(大鼠抗小鼠 IL-17單克隆抗體，美國(guó) BDPharmingen )；PE anti-rat Foxp3(大鼠抗小鼠Foxp3 單克隆抗體)及同型對(duì)照(美國(guó)ebioscience)；Cat15596-026(Invitrogen)；Trizol溶液，DNA純化試劑盒:引物(TaKaRa合成)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Cat K1622 購(gòu)自Fermentas公司)；RT-PCR試劑盒、Trizol試劑、SYBR Green熒光定量 PCR試劑盒( Hai Gene);DAB顯色試劑盒(中杉金橋)。

1.2動(dòng)物分組按隨機(jī)數(shù)字表將63只雄性SD大鼠分為三組:生理鹽水對(duì)照組(N組)、肺纖維化模型組(F組)、地塞米松治療組(D組)，每組各21只。

1.3制作模型及標(biāo)本采集以10%水合氯醛溶液(0.30 ml/100 g)腹腔注射麻醉，將大鼠以仰臥姿勢(shì)固定在鼠板上后，頸部備皮消毒，沿正中線剪開(kāi)頸部皮膚，分離組織充分暴露氣管，F(xiàn)、D組快速推入BLM(0.50 mg/100 g)于大鼠氣管分叉處，N組注入同體積等滲生理鹽水。然后將大鼠直立，以及迅速順逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)鼠板，皮膚縫合，清潔級(jí)飼養(yǎng)。從第2 d開(kāi)始，D組大鼠每日給予腹腔內(nèi)注射地塞米松( 0.3 mg/100 g)，N、F組注入同體積生理鹽水。分別在造模后第 7、14及28 d,采用隨機(jī)方式從三組大鼠中各抽取7只，處死后留取肺組織。

1.4肺組織病理改變對(duì)留取的各組肺組織行HE染色，觀察肺組織炎癥程度及纖維化程度變化。

1.5檢測(cè)肺組織CCR6、IL-9表達(dá)水平采用免疫組化法檢測(cè)各組肺組織CCR6、IL-9表達(dá)水平，肺組織胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒提示切片陽(yáng)性結(jié)果；胞質(zhì)中無(wú)棕黃色反應(yīng)物提示陰性結(jié)果(細(xì)胞核染色為藍(lán)色)。據(jù)Hwang I等學(xué)者[5]研究標(biāo)準(zhǔn)，400倍顯微鏡下取景，使用image proplus系統(tǒng)( 細(xì)胞圖像分析) 方法對(duì)陽(yáng)性結(jié)果的平均灰度值行數(shù)值評(píng)分。

1.6檢測(cè)PU.1mRNA離心BALF，留取沉淀,Trizol法提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，熒光PCR法檢測(cè)PU.1mRNA表達(dá)水平，引物序列：PU.1:(上游)5′-TGCTTCCCTTATCCACCCTTG-3′(下游) 5′-TCTTCTTGCTGCCTGTCTCC-3′；GAPDH:(上游)5′-AACTCCCATTCTTCCACCTTT-3 ′(下游)5 ′-CTCTTGCTCTCAGTATCCTTG -3′。

1.7肺組織Th17、Treg細(xì)胞表達(dá)檢測(cè)采用流式細(xì)胞術(shù)方法檢查分析肺組織Th17、Treg細(xì)胞表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1顯微鏡下觀察HE染色肺組織病理改變N 組大鼠呈現(xiàn)正常肺泡及肺間質(zhì)結(jié)構(gòu)，無(wú)炎癥細(xì)胞及纖維蛋白沉積。F組、D組鏡下病理改變基本相似，與N組對(duì)比，B組大鼠第7 d肺組織出現(xiàn)顯著炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，如中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等，肺間質(zhì)充血、水腫，成纖維細(xì)胞計(jì)數(shù)增多；第14 d、第21 d肺組織炎癥逐漸吸收，成纖維細(xì)胞逐漸增多，膠原纖維逐漸增生、沉積，肺泡間隔逐漸增寬，肺泡逐漸萎縮、消失。但無(wú)論是肺組織炎癥浸潤(rùn)程度，還是纖維蛋白沉積程度，同一時(shí)間點(diǎn)，D組較F組肺組織病變嚴(yán)重程度有所減輕。

2.2檢測(cè)各組大鼠肺組織中CCR6、Th9相關(guān)因子、Th17及Treg細(xì)胞表達(dá)水平

與N組相比，F(xiàn)、D組各時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)指標(biāo)CCR6、PU.1mRNA、IL-9蛋白質(zhì)含量、Th17細(xì)胞百分率結(jié)果明顯增高(P<0.05)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。檢測(cè)結(jié)果于第 7 d時(shí)達(dá)到最高值，第14 d、第28 d呈現(xiàn)逐漸降低趨勢(shì)，但總體上仍高于N組。D組、F 組兩組變化趨勢(shì)相似，但D組檢測(cè)結(jié)果低于同時(shí)間點(diǎn)F組值、明顯高于N組值，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。F、D組各時(shí)間點(diǎn)Treg細(xì)胞百分比與N組相比結(jié)果降低(P<0.05)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且結(jié)果呈現(xiàn)逐漸降低。見(jiàn)表1。

表1 不同時(shí)期三組大鼠肺組織各指標(biāo)表達(dá)情況

注：與N組比較，&P<0.05；與F組比較，@P<0.05

2.3CCR6細(xì)胞表達(dá)量與IL-9、Th17、Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)、Th17/Treg比例相關(guān)性的分析CCR6、Th9、PU.1mRNA表達(dá)水平與Th17有顯著正相關(guān)性，與Treg有顯著負(fù)相關(guān)(P均<0.01),見(jiàn)表2。

表2 相關(guān)r值

3 討論

PF好發(fā)人群多為老年人，作為一種慢性呼吸道疾病間質(zhì)性改變，早期以肺部炎癥性改變，晚期以纖維蛋白沉積、肺組織纖維化病理表現(xiàn)為主，患者多以呼吸困難、干咳為主要癥狀，活動(dòng)后加重，晚期嚴(yán)重乏氧，心肺功能降低，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量，被稱為不死的癌癥。目前發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。本研究以Th17/Treg 失衡為切入點(diǎn)，分析前期研究中趨化因子受體CCR6、Th9相關(guān)因子與Th17/Treg 失衡在肺纖維化發(fā)病機(jī)制中的關(guān)系。

2005年,Harrington[6]等人提出Th17(CD4+-IL-17+輔助性T細(xì)胞)細(xì)胞是一種CD4+效應(yīng)性T細(xì)胞亞群在介導(dǎo)炎癥反應(yīng)中起到重要的作用，在炎癥狀態(tài)下CCR6可趨化Thl7細(xì)胞至肺部、皮膚等其他組織[7]；Th17細(xì)胞，由TGF-β和IL-6、IL-23介導(dǎo)下激活STAT3通路誘導(dǎo)高表達(dá)特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγt，從而分泌IL-17,通過(guò)CCR6/CCL20趨化軸，被誘導(dǎo)至病變組織部位，激發(fā)炎癥反應(yīng)[8,9]，本次研究中發(fā)現(xiàn)，與N組相比，F(xiàn)、D兩組各時(shí)期CCR6、Th17指標(biāo)結(jié)果明顯增高，由于第7 d時(shí)大鼠肺纖維化模型炎癥反應(yīng)最明顯，故檢測(cè)結(jié)果在此時(shí)達(dá)到最高值，并且CCR6與Th17呈正相關(guān)，說(shuō)明Th17可能通過(guò)與趨化因子受體CCR6相互作用參與肺纖維化發(fā)病過(guò)程。與鮑文華[10-11、2]等人關(guān)于Th17細(xì)胞對(duì)肺纖維化大鼠模型中的表達(dá)及意義研究一致。

CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)是對(duì)炎癥反應(yīng)起拮抗作用的另一特殊類型T細(xì)胞，在維護(hù)免疫平衡及調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥反應(yīng)中起到重要作用。Sayour EJ等[12,13]學(xué)者認(rèn)為Treg與特發(fā)性肺纖維化以及化學(xué)因素誘導(dǎo)的肺纖維化密切相關(guān)。大量實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)多種疾病例如自身免疫性疾病、腫瘤、炎癥反應(yīng)以及移植排斥等的發(fā)生發(fā)展與Th17、TH1/TH2及Treg細(xì)胞亞群之間相互作用有關(guān)。正常機(jī)體內(nèi)存在著Th17/Treg動(dòng)態(tài)平衡，Th17/Treg失衡可促進(jìn)自身免疫性疾病炎癥反應(yīng)的發(fā)生[14]。而關(guān)于Th17/Treg 失衡與肺纖維化發(fā)病機(jī)制的研究甚少。賴小映，鐘小寧[15]認(rèn)為Th17/Treg失衡可能加重肺纖維化免疫炎癥，促進(jìn)肺部膠原纖維的沉積。CCR6主要由朗漢斯細(xì)胞，記憶性T細(xì)胞、B細(xì)胞、CD+25CD+4調(diào)節(jié)T細(xì)胞表達(dá)，CCR6與CCL20結(jié)合后，可募集未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞(DCs)、專職的抗原提呈細(xì)胞(APCs)、成熟DCs至炎癥反應(yīng)部位[16]。本研究結(jié)果顯示F、D兩組相對(duì)于N組各時(shí)期Treg細(xì)胞百分比降低、Th17/Treg比值結(jié)果增高，并且CCR6與Treg相關(guān)性分析呈負(fù)相關(guān)、與Th17/Treg呈正相關(guān)，推斷CCR6可能參與Th17/Treg細(xì)胞失衡致大鼠肺纖維化的形成過(guò)程。

TH9細(xì)胞是以分泌IL-9、IL-10細(xì)胞因子為主的新型 CD4+T 細(xì)胞亞群，VeldhoenM,、DardalhonV[17,18]等人證實(shí)了“Th9”細(xì)胞，為已有的包括輔助性T細(xì)胞1型(Thelpercell1,Th1)、2型(Th2)、Th17和Treg在內(nèi)的Th細(xì)胞亞群添加新成員。PU.1作為Th9細(xì)胞特異的轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)IL-9 基因組蛋白乙?；瘡亩龠M(jìn) Th9 細(xì)胞表達(dá)[19]。TH9細(xì)胞參與機(jī)體多種炎癥反應(yīng)性疾病，如支氣管哮喘、過(guò)敏性鼻炎、潰瘍性結(jié)腸炎、多發(fā)性硬化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等。本研究指出B、D兩組相對(duì)于N組各時(shí)期IL-9、Th17/Treg比值結(jié)果明顯增高，并且IL-9與Th17/Treg相關(guān)性分析呈正相關(guān)，提示TH9細(xì)胞可能參與肺纖維化Th17/Treg失衡理論的調(diào)節(jié)機(jī)制。Veldhoen M[20]等在研究Th9細(xì)胞的功能時(shí)發(fā)現(xiàn)，存在RAG-1缺陷小鼠，即便缺失Treg細(xì)胞,也可通過(guò)來(lái)源于Th9細(xì)胞的IL-9作用于Treg細(xì)胞，同時(shí)發(fā)揮促炎功能使組織炎性反應(yīng)更加嚴(yán)重。與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果相似。

總之，與對(duì)照組比較，CCR6、Th9相關(guān)因子、Th17、Th17/Treg在大鼠肺纖維化模型組中肺組織表達(dá)量顯著增高，與肺部炎癥、纖維化程度密切正相關(guān),Treg細(xì)胞百分率降低；CCR6、Th9相關(guān)因子與Th17相關(guān)性分析為正相關(guān)，與Treg細(xì)胞相關(guān)性分析呈負(fù)相關(guān)；故如何通過(guò)抑制CCR6細(xì)胞、Th9相關(guān)因子分泌及有效調(diào)節(jié)Th17/Treg細(xì)胞平衡，從而控制炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫狀態(tài)，將為肺纖維化臨床治療提供新的研究方向。

[1]King TJ,Pardo A,Selman M.Idiopathic pulmonary fibrosis[J].Lancet,2011,378(9807):1949．

[2]李樹(shù)民,鮑文華,王鳳玲,等.CCR6-CCL20趨化軸在TH17細(xì)胞介導(dǎo)的肺纖維化大鼠肺組織中作用機(jī)制的研究[J].臨床肺科雜志,2015,20(12):2177．

[3]鮑文華,王瑾,李樹(shù)民,等.Th9細(xì)胞相關(guān)因子在肺纖維化大鼠中的作用[J].中國(guó)呼吸與危重監(jiān)護(hù)雜志,2016,15(3):227.

[4] Eastaff-Leung N,Mabarrack N,Barbour A,et al.Foxp3+regula-tory T cells,Th17 effector cells,and cytokine environment in in-flammatory bowel disease[J].J Clin Immunol,2010,30 (1):80．

[5]Hwang I,An BS,Yang H,et al.Tissue-specific expression of oc-cludin，zona occludens-1,and junction adhesion molecule A inthe duodenum，ielum，colon，kidney，liver,lung,brain,andskeletal muscle of C57BL mice[J].J Physiol Pharmacol，2013,64(1):11．

[6]Harrington LE,Hatton RD,Mangan PR,et al.Interleukin 17-producing CD4+ effector T c- ells develop via a lineage distinct from the T helper type 1 and 2 lineages[J].Nat Immuno,l 2005,6(11):1123.

[7]Singh SP,Zhang HH,Foley JF,et al.Human T cells that are able to produce IL-17 express the chemokine receptor CCR6[J].J Immunol,2008,180(1):214.

[8]Stockinger B,Veldhoen M,Martin B.Thl7 T cells:Linking innate and adaptive immunity[J].Semin Immunol,2007,19(6):353.

[9]Hirota K,Yoshitomi H,Hashimoto M.Preferential recruitment of CCR6-expressing Thl7 cells to inflamed joints via CCL20 in rheumatoid arthritis and its animal model[J].J Exp Med,2007,204(12):2803.

[10]于永江,李樹(shù)民,鮑文華,等.TH17細(xì)胞、IL-21因子在鼠肺纖維化中的表達(dá)及意義[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2013,17(7):1176．

[11]李樹(shù)民,鮑文華,穆曉春,等.TH17細(xì)胞在肺纖維化大鼠模型中的表達(dá)[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2013,38(7):780．

[12]Sayour EJ,Mc Lendon P,Mc Lendon R,et al.Increased proportion of Fox P3+ regulatory T cells in tumor infiltrating lymphocytes is associated with tumor recurrence and reduced survival in patients with glioblastoma[J].Cancer Immunol Immunother， 2015，64(4):419.

[13] Lo Re S,Lison D,Huaux F.CD4+ T lymphocytes in lung fibrosis:diverse subsets,diverse functions[J].J Leukoc Biol，2013，93(4):499.

[14]Afzali B,Lombardi G,Lechler RI,et al.The role of T helper 17(Th17) and regulatory T cells(Treg) in human organ transplanta-tion and autoimmune disease[J].Clinical Exp Immunol,2007,148(1):32．

[15]賴小映,鐘小寧.Th17、Treg 在肺纖維化小鼠外周血、肺組織中的表達(dá)及意義[J].山東醫(yī)藥,2013,53(19):1．

[16]Rumbo M，Sierro F，Debard N，et al．Lymphotoxin beta receptor sig-naling inducers the chemokine CCL20 in intestinal epitheliu [J].Gastroenterology,2004,127(1):213．

[17]VeldhoenM,UyttenhoveC,SnickVJ,et al.Transforminggrowthfac-tor-beta`reprograms' thedifferentiationofThelper 2cellsandpro-motesaninterleukin 9-producingsubset[J].Natimmunol,2008,9(12):1341.

[18]DardalhonV,AwasthiA,KwonH,et al.IL-4inhibitsTGF-beta-in-ducedFoxp3+ Tcellsand,togetherwithTGF-beta,generatesIL-9+IL-10+ Foxp3(-)effectorT cells[J].NatImmunol,2008,9(12):1347.

[19]Goswami R，Kaplan MH.Gcn5 is required for PU.1-dependentIL-9 induction in Th9 cells[J]．J Immunol，2012，189:3026．

[20] Veldhoen M,Uyttenhove C,van Snick J,et al.Transforminggrowth factor-beta reprograms the differentiation of T helper 2cells and promotes an interleukin 9-producing subset[J].Nat Im-munol,2008,9(12):1341.