豆薯花粉活力研究

陳忠文，周 黎，王德英，黃 超，文西強(qiáng)，王宏飛，潘晶晶

（1余慶縣種子管理站，貴州 余慶 564499；2黔東南民族職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州 凱里 556000；3余慶中學(xué)，貴州 余慶 564499；4余慶縣農(nóng)牧局，貴州 余慶 564499）

豆薯（Pachyrhizus erosus）原產(chǎn)南美洲，傳入我國(guó)約 400余年歷史，是一種食藥兼用作物［1，2］。國(guó)內(nèi)研究起步較晚，側(cè)重于豆薯種子繁殖、肉質(zhì)根栽培及加工等［3～6］，育種工作相對(duì)滯后。陳忠文等選育出“余慶地瓜1號(hào)”豆薯新品種［7］，并報(bào)道了雜交方法［8］。關(guān)于豆薯花粉活力測(cè)定，則未見相關(guān)報(bào)道。筆者在之前關(guān)于豆薯開花習(xí)性研究的基礎(chǔ)上［9，10］，采用幾種常用測(cè)定方法比較豆薯花粉活力，以為豆薯雜交育種及種子生產(chǎn)安全隔離提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

余慶地瓜1號(hào)、余慶地瓜2號(hào)和牧馬山地瓜等3個(gè)豆薯品種（品系）的花粉，分別于2015年、2016年7月上、中旬采自于貴州省余慶縣白泥鎮(zhèn)豆薯種子生產(chǎn)基地。

儀器：顯微鏡（10×40～100倍）；載玻片；蓋玻片；鑷子；恒溫箱；硫酸紙；棕色試劑瓶；燒杯；量筒；天平；pH酸度計(jì)或試紙等。

試劑：0.5%的2，3，5-氯化三苯基四氮唑溶液（TTC）粉劑，購(gòu)于上海華藍(lán)化學(xué)科技有限公司；單質(zhì)I2、KI；硼酸 1 g；蔗糖 50 g；95%酒精。

1.2 花粉采集

1.3 花粉活力測(cè)定

（1）TTC法

①試劑配制。稱取0.5 g TTC放入燒杯中，加入少許95%酒精使其溶解，然后用蒸餾水稀釋至100 mL。溶液裝入褐色玻璃瓶避光保存待用，若發(fā)紅，則不能再用［11］。

②染色。取少量花粉置于普通載玻片上，滴入TTC溶液2滴，用鑷子攪拌均勻，蓋上蓋玻片，在室溫（25～28℃）下放置15～20 min。

③顯微鏡觀察。具較強(qiáng)生活力的花粉粒呈紅色，微弱活力的花粉粒呈淡紅色，無(wú)活力或不育的花粉為無(wú)色。取少許花粉置于載玻片上，加1～2滴TTC溶液，蓋上蓋玻片。觀察3個(gè)制片，每片取5個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)并計(jì)算花粉活力百分率（花粉萌發(fā)率＝萌發(fā)花粉粒數(shù)／視野花粉粒數(shù)×100%）。

（2）I2-KI法

①I2-KI的配制。稱取2 g KI溶于10 mL蒸餾水中，然后加入1 g I2，待全部溶解后，加蒸餾水定容至300 mL，制成0.1%I2-KI溶液。

②染色。取少量花粉置于載玻片上，滴上1～2滴I2-KI染色液，5 min后在顯微鏡下觀察。

數(shù)據(jù)的標(biāo)定用來(lái)獲得傳感器的靜態(tài)特性,其標(biāo)定的精度將直接影響傳感器使用時(shí)的測(cè)量精度,其重要程度顯而易見。

③顯微鏡觀察。凡是染成藍(lán)黑色的花粉粒具較強(qiáng)活力，淡藍(lán)色次之，幾乎無(wú)色則為無(wú)活力花粉。觀察3個(gè)制片，每片取3個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)并計(jì)算花粉活力百分率。

（3）花粉離體萌發(fā)測(cè)定法

①液體培養(yǎng)基的配制。硼酸設(shè)10、50、100 mg／L等3個(gè)水平，蔗糖濃度設(shè)5%、10%、20%等3個(gè)梯度，并測(cè)定對(duì)應(yīng)的pH值（表1）。

表1 花粉離體萌發(fā)測(cè)定法的蔗糖、硼酸濃度及pH值

②培養(yǎng)基篩選。采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

③花粉萌發(fā)觀察。用鑷子夾住花萼部，用手輕拍花朵，使花粉均勻散落于載玻片上，取2～3滴培養(yǎng)基溶液滴于花粉上，蓋上蓋玻片，編號(hào)，置于底部鋪有用水浸濕的濾紙的培養(yǎng)皿上，于30℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min、1、2、3、4、5、6、7、8 h，在光學(xué)顯微鏡下觀察花粉萌發(fā)率。以花粉管的長(zhǎng)度大于和等于花粉的直徑計(jì)為萌發(fā)花粉粒，每次觀察3張片，每片取3個(gè)視野，記錄平均值，統(tǒng)計(jì)花粉萌發(fā)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同測(cè)定方法豆薯花粉活力比較

3種花粉活力測(cè)定方法結(jié)果表明：⑴不同的測(cè)定方法結(jié)果差異較大，I2-KI染色測(cè)定花粉活力達(dá)到92%以上，其次為TTC染色法達(dá)45%以上，并有相近的測(cè)定結(jié)果，離體測(cè)定較低，在36%以下并相差較大（表2）。

表2 3種方法測(cè)定豆薯花粉活力（%）結(jié)果

⑵不同豆薯品種對(duì)于相同的測(cè)定方法亦存在差異。離體萌發(fā)測(cè)定顯示‘余慶地瓜1號(hào)’花粉萌發(fā)率達(dá)36.00%，明顯高于‘余慶地瓜2號(hào)’和‘牧馬山地瓜’兩個(gè)品種，與品種的莢粒數(shù)9～12、8～10、6～8粒相對(duì)應(yīng)，而TTC染色效果則剛好相反。

本試驗(yàn)TTC法染色效果不明顯。

2.2 I2－K I染色及不同濃度效果比較

在實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)1%I2-KI染色時(shí)間快、染色深，必須即時(shí)觀察，有礙批量處理，故而進(jìn)行不同濃度染色比較，結(jié)果以0.5%為宜（表3）。

表3 I2－KI染色效果比較

2.3 培養(yǎng)條件對(duì)豆薯花粉離體萌發(fā)率的影響

因處理1～5豆薯花粉基本無(wú)萌發(fā)，不能統(tǒng)計(jì)分析。

2.3.1 豆薯花粉離體萌發(fā)時(shí)間

因品種而異，不同的豆薯品種花粉在1～2 h后開始萌發(fā)，6～7 h達(dá)到最高值（表4）。因此，在豆薯花粉離體6～7 h進(jìn)行離體測(cè)定無(wú)疑是最合適的。

2.3.2 蔗糖、硼酸濃度對(duì)豆薯花粉離體萌發(fā)的影響

在蔗糖濃度≤10%、硼酸濃度為5、50 mg／L時(shí)，3個(gè)豆薯品種花粉基本無(wú)萌發(fā)。蔗糖濃度10%、硼酸濃度100 mg／L時(shí)，‘余慶地瓜1號(hào)’無(wú)萌發(fā)，‘牧馬山地瓜’和‘余慶地瓜2號(hào)’分別在1和2 h開始萌發(fā)。蔗糖濃度20%、硼酸濃度50 mg／L時(shí)，僅‘余慶地瓜1號(hào)’花粉能萌發(fā)；硼酸濃度100 mg／L‘牧馬山地瓜’無(wú)萌發(fā)，其余品種萌發(fā)。蔗糖濃度20%、硼酸濃度10 mg／L時(shí)，pH值7.22，3個(gè)品種皆能萌發(fā)，是本試驗(yàn)花粉離體萌發(fā)測(cè)定最佳處理。

表4 不同品種在蔗糖和硼酸濃度組合下的萌發(fā)結(jié)果（%）

2.4 豆薯花粉粒數(shù)量

在10×40倍鏡下觀測(cè)，單個(gè)豆薯花藥花粉760～860粒，推算每朵花的花粉量7600～8600粒。而豆薯莢粒數(shù)一般在12粒以下，表明豆薯自花授粉率在0.15%以下，非常低。

3 討論

（1）花粉活力的測(cè)定方法很多。本試驗(yàn)關(guān)于豆薯花粉活力測(cè)定僅采用TTC法、I2-KI法和離體培養(yǎng)方法。染色效果最為明顯的是I2-KI法，可能是因?yàn)槎故砘ǚ壑械牡矸酆亢芨撸琁2-KI較易滲透進(jìn)花粉壁而使花粉粒染色［12］。I2-KI染色法的基本原理是根據(jù)淀粉遇碘變藍(lán)的特性，根據(jù)藍(lán)色的深淺程度來(lái)判斷花粉粒中淀粉的含量，從而確定花粉?；钚缘母叩?。凡是染成藍(lán)黑色的花粉粒具較強(qiáng)活力，淡藍(lán)色次之，幾乎無(wú)色則為無(wú)活力花粉［13］。本試驗(yàn)豆薯花粉遇1%I2-KI能快速染成藍(lán)黑色，表明其花粉活力非常強(qiáng)，用0.5%I2-KI溶液處理能達(dá)到同樣效果且便于操作和延時(shí)觀察。

（2）本試驗(yàn)豆薯花粉離體培養(yǎng)萌發(fā)測(cè)定結(jié)果與豆薯品種的結(jié)莢粒數(shù)相對(duì)應(yīng)，似乎更能反映其實(shí)際結(jié)果。

（3）本試驗(yàn)中TTC法測(cè)定染色效果不明顯，是否與TTC粉劑未經(jīng)過(guò)磷酸鹽緩沖溶液而直接用95%酒精配制有關(guān)，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

［1］ 王清惠 .涼薯的功效與作用［DB／OL］.http：／／zyk.99.com.cn／zyfj／zysy／2013／0123／350740.html［2013-01-23］.

［2］ 陳忠文，周介雄，文西強(qiáng).貴州地瓜產(chǎn)業(yè)發(fā)展分析與評(píng)價(jià)［J］.種子，2008，27（12）：140-142.

［3］ 陳忠文，文西強(qiáng).余慶地瓜1號(hào)種子高產(chǎn)技術(shù)［J］.長(zhǎng)江蔬菜，2007（12）：28.

［4］ 畢光美，李光武，李 梅，等.豆薯引種及高產(chǎn)栽培技術(shù)研究初報(bào)［J］.北方園藝，2011（13）：39-40.

［5］ 張連平.豆薯高產(chǎn)栽培技術(shù)［J］.蔬菜，2011（7）：15-16.

［6］ 鄭兵福，李彥坡，蔣立文.涼薯加工產(chǎn)品的發(fā)展現(xiàn)狀［J］.農(nóng)產(chǎn)食品科技，2010，4（2）：52-54.

［7］ 陳忠文，馮仕喜，郭仕平，等.余慶地瓜1號(hào)的選育與利用［J］.種子，2007，26（6）：80-81.

［8］ 陳忠文，李雪維.豆薯雜交技術(shù)探討［J］.中國(guó)園藝文摘，2015，31（6）：27，29.

［9］ 陳忠文，曾祥忠，馮仕喜.豆薯開花習(xí)性觀察研究［J］.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2013（21）：80-82.

［10］陳忠文，文西強(qiáng)，王宏飛，等.豆薯種子與花冠顏色及花器結(jié)構(gòu)描述［J］.作物研究，2014，28（2）：152-153.

［11］ 氯化三苯基四氮唑法［DB／OL］.https：／／baike.baidu.com／item／%E6%B0%AF%E5%8C%96%E4%B8%89%E8%8B%AF%E5%9F%BA%E5%9B%9B%E6%B0%AE%E5%94%91%E6%B3%95／9885951 fr＝aladdin.

［12］韓成剛，蓋樹鵬.芍藥花粉活力測(cè)定方法的研究［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（5）：124-126.

［13］左丹丹，明 軍，劉 春，等.植物花粉生活力檢測(cè)技術(shù)進(jìn)展［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35（16）：4742-4745.