BRCA1與Rad51的相互作用研究進(jìn)展

吳妮妮，馬 麗，盧 奎,2*

(1.河南工業(yè)大學(xué) 化學(xué)化工與環(huán)境學(xué)院，鄭州 450001；2.鄭州工程技術(shù)學(xué)院 化工食品學(xué)院，鄭州 450044)

由于環(huán)境因素以及電離輻射等多方面的影響，使得生物體細(xì)胞的正常生長機(jī)制被打亂，從而誘使生物體細(xì)胞異常生長，導(dǎo)致發(fā)生癌變。1994年科學(xué)家們初次分離并獲得乳腺癌易感基因(BRCA基因)，發(fā)現(xiàn)BRCA基因中的BRCA1和BRCA2與癌癥緊密相關(guān)[1]。女性若攜帶BRCA突變基因，則患乳腺癌、卵巢癌的概率大大增加，除此之外，其他幾種器官也易發(fā)生癌變。而男性此種基因突變攜帶者也會(huì)患癌[2]，如患前列腺癌、乳腺癌等，但男性患癌概率遠(yuǎn)低于女性。人的Rad51蛋白是維持基因組穩(wěn)定性的重要物質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)在某些癌變組織中檢測到細(xì)胞內(nèi)Rad51蛋白的高度表達(dá)，這類細(xì)胞對(duì)于抗癌藥物尤其順鉑藥物的耐藥性明顯增強(qiáng)。這些研究結(jié)果從側(cè)面證明Rad51與腫瘤緊密相關(guān)[3-8]。

BRCA1參與DNA修復(fù)，在維持基因組穩(wěn)定性方面起重要作用，可與多種DNA修復(fù)酶或重組蛋白發(fā)生作用，包括Rad51、Rad50/MRE11/NIBRIN復(fù)合物、Bloom解凍酶等[9]。研究發(fā)現(xiàn)BRCA1和Rad51可形成不同的DNA修復(fù)復(fù)合物和作用位點(diǎn)，改變DNA所處環(huán)境后，BRCA1仍可發(fā)揮修復(fù)作用，且在順鉑誘導(dǎo)下，BRCA1的羧基末端能夠與Rad51作用來對(duì)DNA損傷位點(diǎn)進(jìn)行修復(fù)[9]。因此，目前研究重點(diǎn)可著手于確定用順鉑和電離輻射治療后BRCA1在Rad51病灶中的作用。

多肽-蛋白質(zhì)通過關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行的相互作用[10]在生物體內(nèi)中發(fā)揮著重要作用。因此，可以利用ZDOCK和RDOCK的分子對(duì)接措施，對(duì)BRCA1和Rad51相互作用進(jìn)行研討[11]。

1 BRCA1基因

研究表明，抑癌基因的失活及原癌基因的活化與癌癥密切相關(guān)[12-14]。BRCA1是一種可以抑制癌癥產(chǎn)生的重要基因，其基因狀態(tài)在乳腺癌和卵巢癌臨床防治方面的應(yīng)用已成為醫(yī)學(xué)界的研究熱點(diǎn)。BRCA1蛋白囊括了大量的細(xì)胞過程，包括DNA復(fù)制、細(xì)胞周期檢查點(diǎn)控制、細(xì)胞凋亡和染色質(zhì)重塑等[14]。目前對(duì)于BRCA1的研究主要集中在它的RING 區(qū)[15-16]和BRCT區(qū)[17]，其他區(qū)域研究相對(duì)較少。從BRCA1 的結(jié)構(gòu)特征來看，BRCA1能夠與Rad51、p53等多種蛋白結(jié)合，同時(shí)參與細(xì)胞周期的調(diào)控、DNA的修復(fù)和中心體的復(fù)制[18]，從而抑制腫瘤的產(chǎn)生。

一旦基因發(fā)生突變，會(huì)大幅度增加患癌風(fēng)險(xiǎn)，目前采取的降低癌癥死亡率的最主要手段仍是早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，這主要依賴于疾病的早期篩查。早期篩查主要對(duì)BRCA1基因的突變[19]進(jìn)行檢測，檢測內(nèi)容主要包括無義突變、剪切位點(diǎn)突變和移碼突變。

醫(yī)學(xué)上對(duì)BRCA1基因進(jìn)行的基因突變性檢測，主要依賴于對(duì)PCR擴(kuò)增基因片段進(jìn)行篩查或者直接測序的手段。PCR擴(kuò)增的主要方式有：PCR-SSCP-SEQ，PCR-DHPLC-SEQ和PCR-SEQ。國內(nèi)主要利用PCR-測序法[4]檢測樣本中BRCA1的胚系突變，尋找更多的突變位點(diǎn)，擴(kuò)大突變譜圖，以此達(dá)到對(duì)基因突變引發(fā)乳腺癌的臨床病理學(xué)特征進(jìn)行更深入研究的目的。當(dāng)前對(duì)BRCA1/BRCA2基因突變的預(yù)測最常用的是BRCA Pro模型。

2 Rad51蛋白

HsRad51與大腸桿菌RecA同源，通過HR來進(jìn)行遺傳物質(zhì)(DNA雙鏈斷裂)修復(fù)。要使Rad51發(fā)揮修復(fù)作用，需切除DSB末端的DNA與Rad51來形成突觸纖維前體[20]。在此基礎(chǔ)上，利用免疫組化二步法[21]，進(jìn)行染色處理，得到的Rad51蛋白主要位于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)部或圍繞著細(xì)胞核。研究發(fā)現(xiàn)Rad51蛋白含量的多少與人體能否病變形成腫瘤密切相關(guān)[3-8]。目前，臨床上主要利用放射線或藥物損傷來破壞腫瘤細(xì)胞的DNA，從而使得細(xì)胞死亡達(dá)到治療腫瘤的目的。Rad51蛋白在生物體內(nèi)過量表達(dá)時(shí)，會(huì)加速腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的生長擴(kuò)散甚至?xí)铀侔┘?xì)胞轉(zhuǎn)移，使得腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞對(duì)放療和化療的抵抗力增加[22]。因此，如何有效降低卵巢癌、乳腺癌細(xì)胞對(duì)癌癥藥物的耐藥性[23-26]，需要從抑制 Rad51蛋白的過量表達(dá)這方面入手。

3 BRCA1與Rad51的相互作用

Vispé S等[11]報(bào)道，在BRCA1未發(fā)生堿基或堿基對(duì)的缺失或突變情況下，Rad51過表達(dá)的細(xì)胞在細(xì)胞周期的S/G2期對(duì)電離輻射具有抗性，這闡明了Rad51蛋白的表達(dá)量與癌癥的發(fā)生緊密聯(lián)系。在BRCA2堿基突變的狀況下，Antoniou等[27]對(duì)Rad51上的135G-C進(jìn)行患癌風(fēng)險(xiǎn)研究，結(jié)果顯示，此種情況下Rad51CC純合子的患癌率顯著增加。Krupa等[28]對(duì)Rad51和XRCC3的多態(tài)性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)XRCC3的Thr241Met基因會(huì)增加癌癥局部轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，而Rad51的135G-C則可與XRCC3Thr241Met形成能夠大大降低患癌風(fēng)險(xiǎn)的大型基因復(fù)合物，來產(chǎn)生拮抗作用。除此之外，據(jù)S?derlund小組[29]報(bào)道，使BRCA1、BRCA2 分別與Rad51形成大型復(fù)合物，這能夠?qū)θ橄侔┻M(jìn)行預(yù)前和預(yù)后性檢測。同時(shí)，BRCA1與DNA修復(fù)蛋白復(fù)合物的這種相互作用保持了基因組的穩(wěn)定性，使其可以作為腫瘤抑制因子來發(fā)揮作用。

因此，現(xiàn)階段可以通過對(duì)正常和癌變組織中的Rad51蛋白、BRCA1蛋白進(jìn)行蛋白含量表達(dá)變化分析，研究二者與體系癌變的關(guān)系，同時(shí)也可以對(duì)BRCA1和Rad51的蛋白表達(dá)以及兩者與遺傳物質(zhì)的相互作用進(jìn)行全面分析。

4 BRCA1與Rad51相互作用的研究方法

目前，關(guān)于BRCA1與Rad51的相互作用研究方法，主要有熒光光譜法、圓二色光譜法、核磁共振法、透射電鏡法和微量熱涌動(dòng)法等。

4.1 熒光光譜法

熒光光譜法是利用能夠發(fā)熒光的物質(zhì)與自身濃度之間的關(guān)系進(jìn)行研究的一種方法。通過Stern-Volmer[30]方程、雙倒數(shù)方程可求出結(jié)合位點(diǎn)數(shù)和結(jié)合常數(shù)，得到分子間的猝滅方式和機(jī)理，從而深層次研究其作用機(jī)理。Zhou Chenyi等[9]利用免疫熒光分析法，通過構(gòu)建BRCA1- siRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒載體來研究BRCA1羧基末端對(duì)Rad51蛋白表達(dá)含量的影響，發(fā)現(xiàn)BRCA1的羧基末端是順鉑治療之后進(jìn)行Rad51和BRCA1復(fù)合物構(gòu)建所必須的活性位點(diǎn)。霍彩霞等[31]運(yùn)用熒光光譜，研究ONE(奧硝哇)與HSA(人血清白蛋白)在生理?xiàng)l件下的結(jié)合反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)兩者以靜態(tài)猝滅的方式發(fā)生作用。姚軍亮[32]則通過熒光動(dòng)力學(xué)分析驗(yàn)證了沒食子酸(GA)能夠?qū)τ蒆eparin 引發(fā)的 R3 多肽的自聚集度起抑制作用。董超[33]用免疫熒光法、免疫共沉淀法以及免疫印跡法研究p53和BRCA1在輻射誘導(dǎo)條件下對(duì)DNA雙聯(lián)斷裂損傷修復(fù)的影響，認(rèn)為p53可以抑制BRCA1的重組過度修復(fù)，來維持正常的同源重組修復(fù)機(jī)制，同時(shí)，它還能夠維持染色體的穩(wěn)定性。呂艷陽等[34]利用熒光光譜法，模擬人體自身酸堿度條件下阿托伐他汀鈣與牛血清白蛋白的熒光猝滅譜圖，對(duì)其猝滅方式、相互作用力以及結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行了研究，認(rèn)為二者間通過疏水作用力進(jìn)行結(jié)合。

目前，以熒光法為主，結(jié)合免疫印跡等分析方法來分析蛋白與多肽相互作用。這種方法相對(duì)而言較為成熟，它能夠反映出蛋白與多肽之間的猝滅類型，并且能夠分析得出兩者之間的相互作用力類型，應(yīng)用較為廣泛，但由于蛋白自身會(huì)攜帶發(fā)色團(tuán)，在進(jìn)行熒光實(shí)驗(yàn)時(shí)，需要扣除蛋白自身的影響，構(gòu)建對(duì)照組。

在進(jìn)行BRCA1與Rad51復(fù)合物研究時(shí)，可用BRCA1作為猝滅劑，固定Rad51的濃度，按照一定的梯度依次增加BRCA1的濃度，測定復(fù)合物的熒光。由于BRCA1自身也有熒光效應(yīng)，必須扣除空白。BRCA1與Rad51熒光強(qiáng)度越小，則兩者的相互作用效果越好。

4.2 圓二色光譜法(CD)

圓二色光譜法(CD)是根據(jù)手性分子的偏振光變化來測定物質(zhì)結(jié)構(gòu)[35-36]的方法，可用來估算多肽及蛋白中各種二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量[37]。林海波[38]曾利用同步輻射的真空紫外圓二色譜儀對(duì)處于溶液環(huán)境的蛋白質(zhì)進(jìn)行測定，這為蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)含量的測定提供了新方法。張新波等[39]利用圓二色法對(duì)磺胺嘧啶(SD)和牛血清白蛋白(BSA)進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)加入SD會(huì)使得BSA α-螺旋含量減少，構(gòu)像發(fā)生變化。丁成榮等[40]則通過圓二色法對(duì)三環(huán)唑與BSA相互作用進(jìn)行分析，結(jié)果顯示BSA的肽鏈發(fā)生收縮和重排，同時(shí)借助其他分析儀器發(fā)現(xiàn)三環(huán)唑還可使BSA發(fā)生構(gòu)象變化。徐飛等[41]將CD應(yīng)用于中藥小分子(如苯丙素類、黃酮類、萜類)與蛋白質(zhì)相互作用研究中，發(fā)現(xiàn)小分子通過與DNA 結(jié)合，對(duì)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，使其發(fā)生結(jié)構(gòu)性改變，對(duì)蛋白的結(jié)構(gòu)功能產(chǎn)生影響。應(yīng)用圓二色法來研究小分子與蛋白的相互作用，此種方法較為廣泛，但是目前有關(guān)用CD法研究生物大分子與生物大分子之間的相互作用的報(bào)道并不多見，有待繼續(xù)深入研究。

依據(jù)前人報(bào)道，可采用這一方法嘗試對(duì)BRCA1-Rad51進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析。測定BRCA1-Rad51及BRCA1與緩沖溶液的復(fù)合物的圓二色圖譜，得到BRCA1-Rad51復(fù)合物的圓二色光譜圖，利用CD Pro分析得到二級(jí)結(jié)構(gòu)含量。隨著BRCA1濃度的升高，Rad51蛋白結(jié)構(gòu)有序性增強(qiáng)，則其二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主。

4.3 核磁共振法(NMR)

蛋白與蛋白的相互作用主要依據(jù)X-ray和NMR技術(shù)來獲得蛋白質(zhì)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)信息。進(jìn)行蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用研究時(shí)，NMR[42]技術(shù)具有無可替代的作用，可應(yīng)用其相關(guān)的順磁弛豫方法、分子間NOE檢測法以及化學(xué)位移擾動(dòng)法來進(jìn)行蛋白相互作用微觀分析。當(dāng)兩者動(dòng)力學(xué)行為過于復(fù)雜[42]，用其他方法難以檢測時(shí)，核磁共振法幾乎是獲取微觀作用信息的唯一手段。陳泉[43]運(yùn)用NMR方法，對(duì)泛素類相關(guān)修飾蛋白質(zhì)以及其與酶體系相互作用進(jìn)行研究，認(rèn)為泛素類修飾蛋白對(duì)酶的作用效果具有拮抗作用。張乃霞等[44]利用這種方法研究泛素-蛋白水解酶體通路，最終得到兩者相互作用力較弱的結(jié)論。史喆[45]則利用NMR技術(shù)，對(duì)人體的蛋白磷酸酶進(jìn)行雙特異性的篩選研究，得到了在參與促使有絲分裂和細(xì)胞周期調(diào)控中占據(jù)主導(dǎo)地位的酶類?；谏鲜鲅芯浚覀兛梢圆扇MR方法對(duì)BRCA1與Rad51的相互作用進(jìn)行研究。

4.4 電鏡法(TEM)

透射電子顯微鏡(TEM)[46]在一定條件下能夠觀察到物質(zhì)的亞顯微結(jié)構(gòu)或者超微結(jié)構(gòu)，有利于進(jìn)行微觀結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)分析，因此電鏡法較為常用。通常將電鏡法與其他分析法相結(jié)合，來進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。陳佳弘等[47]通過掃描電鏡觀察到絲素蛋白在CaCl2-H2O-C2H5OH體系中的微觀結(jié)構(gòu)變化，認(rèn)為絲素膨大，并且斷裂為片狀、層狀結(jié)構(gòu)，晶體結(jié)構(gòu)被破壞。吳麗萍等[48]利用透射電鏡與紅外光譜結(jié)合的方法，研究了pH對(duì)絲膠蛋白微觀結(jié)構(gòu)以及宏觀構(gòu)型變化的影響，發(fā)現(xiàn)pH越小，絲膠蛋白排列越緊密且體系越混亂。Hjalmarsson等[49]對(duì)鼠的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行電鏡分析，發(fā)現(xiàn)小鼠內(nèi)皮細(xì)胞糖萼被內(nèi)皮窗孔充滿。利用電鏡作相互作用研究時(shí)，可在適宜溫度下，將ssDNA、HsRad51加到預(yù)先配置好的緩沖溶液中，放置一段時(shí)間，再向其中加入BRCA1肽，經(jīng)過一系列后續(xù)處理，對(duì)所形成的復(fù)合物BRCA1-HsRad51-ssDNA進(jìn)行染色處理，進(jìn)行電鏡觀察，得到微觀構(gòu)型。

4.5 微量熱涌動(dòng)法(MST)

Ludwig[50]首次闡明分子能夠在給定的溫度梯度條件下發(fā)生定向運(yùn)動(dòng)，并把這種分子在溫度梯度下的定向運(yùn)動(dòng)現(xiàn)象稱為熱泳動(dòng)現(xiàn)象。Wienken 等[51]運(yùn)用微量熱涌動(dòng)方法，對(duì)溶液中生物大分子蛋白質(zhì)與一些小分子的相互作用進(jìn)行了深入研究。在進(jìn)行BRCA1-Rad51相互作用時(shí)，可將不同濃度的未標(biāo)記的BRCA1肽與固定濃度的熒光標(biāo)記蛋白R(shí)ad51蛋白混合，靜置，再進(jìn)行MST分析。在此過程中，Rad51作為受體，BRCA1作為配體，最終得到Kds值。與其他方法相比，MST法在蛋白與多肽的相互作用研究中應(yīng)用較少，但它具有特殊的優(yōu)勢(shì)。

4.6 其他方法

在進(jìn)行生物大分子與生物大分子或生物大分子與有機(jī)小分子之間的相互作用研究時(shí)，除了上述幾種方法外，還可以結(jié)合BiFC[52-53]、GST Pull-down[54]等方法，使得作用機(jī)理更為清晰明了，也就更能闡明其基本作用規(guī)律以及結(jié)合力等詳細(xì)信息。

5 結(jié)語

乳腺癌的形成涉及多方面的因素，而基因發(fā)生功能性改變是乳腺癌發(fā)生的關(guān)鍵因素。BRCA1基因在一定條件下發(fā)生突變，會(huì)大大增加患癌風(fēng)險(xiǎn)。Rad51蛋白是生物體內(nèi)進(jìn)行同源重組修復(fù)過程的關(guān)鍵蛋白。通過對(duì)BRCA1與Rad51相互作用的研究，探索其相互作用機(jī)理、關(guān)鍵作用位點(diǎn)以及修復(fù)機(jī)理等，可為乳腺癌治療藥物的設(shè)計(jì)提供基礎(chǔ)。

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