南燭多酚氧化酶酶學性質的初步研究

徐廣洲

【摘 要】以南燭嫩葉為原料，粗制南燭多酚氧化酶（PPO）酶液，采用硫酸銨鹽析、透析袋透析的方法，對南燭多酚氧化酶進行初步純化，并對其酶學性質進行分析。結果表明：南燭多酚氧化酶的最適pH為6.5，最適溫度為45℃左右，最適底物為鄰苯二酚，本實驗為南燭黑色素的制備提供了一定的參考依據(jù)。

【關鍵詞】南燭；多酚氧化酶；酶學性質

南燭（Vaccinnium Bracteatum Thunb）屬于杜鵑花科越橘屬，在江浙、福建、湖廣一帶，人們以其莖葉浸漬染米加工烏飯。南燭黑色素作為一種植物來源的黑色素，安全性高，受到廣泛關注。魏國華等學者提出南燭黑色素的形成可能與酶相關[1-2]，王敬文等人在制備南燭黑色素的過程中，加入一定量的多酚氧化酶或其它類型的酶，得到了顏色更黑的南燭葉黑色素提取液[3]。多酚氧化酶是一種含銅的金屬酶，可以用一元酚和二元酚作底物，是發(fā)生酶促褐變的主要酶，存在于大多數(shù)果蔬細胞組織中。本文對南燭葉中的多酚氧化酶進行分離純化，并對其酶學性質的進行初步探究，為南燭黑色素的制備提供了一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、曲通拉X-100、硫酸銨、聚乙烯吡咯烷酮、L-多巴、鄰苯二酚、L-酪氨酸、綠原酸、愈創(chuàng)木酚、兒茶素、焦性沒食子酸。透析袋（分子量：14400）；可見分光光度計；冷凍離心機；磁力攪拌器；pH計；紫外探頭型可見光譜儀；電熱恒溫水浴鍋。

1.2 實驗方法

1.2.1 粗制酶液

取適量新鮮南燭嫩葉，加入磷酸鹽緩沖液（0.1 M，pH6.5），料液比1：5，加入1 %聚乙烯吡咯烷酮以及0.25%的曲通拉X-100，低溫勻漿30min，離心（10000rpm，5min，4℃）取清液，即為粗制酶液，4℃保存?zhèn)溆肹4]。

1.2.2 酶活性的測定

分光光度計比色法：2.0ml的磷酸鹽緩沖液 （0.1M）和0.9ml的鄰苯二酚（0.01M）的混合液，0.1ml酶液，恒溫5min，混勻，迅速測定反應體系在420nm吸光度變化，以最初直線段的斜率計算酶活力?？瞻讓φ眨亨彵蕉尤芤?磷酸鹽緩沖液的混合液。PPO酶活性的定義：每分鐘吸光值（420nm）變化0.001定義為1個酶活力單位，及1U，PPO酶活性表示為103×A420/min[4]。

1.2.3 分離純化

粗酶液中加入硫酸銨，使其飽和度達到20%，4℃下靜置4h，然后在10000rpm/min、4℃條件下離心10min，分離沉淀物。將鹽析得到的蛋白溶于0.01M磷酸鹽緩沖液后，透析除鹽，于4℃透析24h，每4h更換透析液[5]。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

每個實驗3個平行2個重復，利用Excel軟件統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，計算標準偏差并制圖。

2 結果與分析

2.1 pH對南燭PPO酶活性的影響

以鄰苯二酚為底物，研究pH對酶活性的影響，配制不同pH的磷酸鹽緩沖液，構建不同pH（3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5）的反應體系，37℃測定酶活，以各pH條件下測得的最高酶活作為100%計算相對酶活，結果如圖1所示。pH對南燭葉PPO的酶活性影響非常明顯：在pH值3.5-5.5的之間，隨著pH值升高，南燭葉PPO酶活性先升高后降低，在pH值為4.5時酶活性較大；pH值繼續(xù)變大，PPO的酶活力出現(xiàn)相同變化，但酶活性增強，pH值為6.5時酶的活性最高。因此，以鄰苯二酚為底物時南燭葉PPO酶的最適pH為6.5。

2.2 溫度對多酚氧化酶活性的影響

以鄰苯二酚為底物，研究溫度對PPO活性的影響。在pH 6.5條件下，在不同溫度（5、15、25、35、45、55 ℃）條件下，以各溫度條件下測得的最高酶活作為100 %計算相對酶活（圖2）。在15℃-45℃之間，PPO活性隨溫度升高而增加；在45℃-65℃之間，多酚氧化酶活性隨溫度升高而下降；以鄰苯二酚為底物，在pH6.5條件下，45℃左右時南燭葉多酚氧化酶表現(xiàn)出最大酶活性。

2.3 PPO酶的米氏常數(shù)

用磷酸鹽緩沖液（pH6.5）分別配制濃度為5、10、20、50、100mM的底物溶液，分別測定不同底物在不同濃度條件下的酶活反應初速度，并采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法作圖，計算底物的Km、Vm值[4]，結果如表1所示。由結果可知，兒茶素對南燭葉多酚氧化酶的Km值最小，有最好的親和力，但綜合考慮Vmax/Km的值大小，南燭葉多酚氧化酶最合適的底物為鄰苯二酚。

3 討論

由于酶的大多數(shù)為蛋白質，凡能影響蛋白質的理化因素都可能影響酶的結構與功能，影響酶促反應的因素主要有底物、pH、溫度、抑制劑及激活劑等。首先酶在催化反應時，對于底物有嚴格的選擇性，只有酶的活性中心與底物契合的時候，才會發(fā)生酶促反應；其次PPO是一種含銅酶，強酸或者強堿條件都可能會導致Cu2+的解離以及蛋白質的變性，從而降低PPO的活性；酶作為催化劑，隨著反應溫度的升高，分子熱運動加劇，單位時間內底物與酶接觸的幾率上升，酶活性增大，隨著反應溫度的繼續(xù)升高，酶蛋白的變性程度不斷加深，導致其催化能力的喪失。對比牛蒡、蘋果、梨和蓮藕 PPO[4，6，7，8]等主要酶學特性發(fā)現(xiàn)：鄰苯二酚、焦性沒食子酸及L-多巴是普遍適合的底物，而酪氨酸，愈創(chuàng)木酚等一元酚不是這些PPO的適合底物；最適pH大多在6.0-7.4范圍；最適溫度大多在20-40℃范圍。

在本實驗條件下，南燭多酚氧化酶的最適底物為鄰苯二酚，對其酶促反應的最適pH為6.5，最適溫度為45℃。這些都為南燭黑色素的制備和南燭葉多酚氧化酶的實際應用提供了一定的參考。本文只是研究了南燭多酚氧化酶部分酶學性質，還可以進一步研究其他底物、抑制劑和激活劑對南燭葉多酚氧化酶的影響。

【參考文獻】

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