正相高效液相色譜法同時測定腌臘肉制品中13-HODE和9-HODE含量

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(1.南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院食品科學(xué)系,江蘇南京 210097; 2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,江蘇南京 210014; 3.江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇南京 210095)

亞油酸(Linoleic acid,LA)是磷脂中主要的多不飽和脂肪酸,也是內(nèi)皮細(xì)胞中甘油三酯的重要組分[1-2]。在自由基誘導(dǎo)的自動氧化或脂氧酶(LOX)作用下的氧化途徑中,LA首先被氧化為氫過氧化十八碳二烯酸(hydroperoxyoctadecadienoic acids,HPODEs)[3]。HPODEs不穩(wěn)定,可以降解形成含羥基、羰基等的一系列次級氧化產(chǎn)物。在谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)或Fe2+等作用下,HPODE被還原形成羥基十八碳二烯酸(HODEs)[4]。HODEs主要有兩種位置異構(gòu)體：9-HODE和13-HODE。9-HODE和13-HODE的比例與LA的氧化途徑密切相關(guān),自由基誘導(dǎo)的自動氧化產(chǎn)生等量的9-HODE和13-HODE,而在LOX催化的氧化中二者的比例取決于LOX的來源,哺乳動物的LOX催化LA氧化產(chǎn)生的HODEs以13-HODE為主[5]。研究表明,HODEs可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放白介素1β[6]，阻止細(xì)胞程序性死亡[7]，導(dǎo)致線粒體腫脹[8],體內(nèi)HODEs水平升高會促進(jìn)動脈粥樣硬化,并與某些癌癥的發(fā)生或發(fā)展密切相關(guān)[9-11]。值得關(guān)注的是,HODEs廣泛存在于富含油脂、高溫加工或加工周期較長的食品中[12-13],在腌臘肉制品中含量尤其豐富[14]。雖然外源性HODEs是否具有同樣的病理生理學(xué)作用尚未可知,但已有研究證實,膳食中13C標(biāo)記的羥基脂肪酸被攝入后,可不經(jīng)修飾直接進(jìn)入人體血液[15]。由此可見,腌臘肉制品中高含量的HODEs具有潛在的食品安全隱患。

目前,HODEs的分析主要應(yīng)用于病理生理學(xué)等研究領(lǐng)域。常用的檢測方法有:GC-MS[16-17]、酶聯(lián)免疫吸附分析[18-19]、放射免疫分析[20]、HPLC-UV[21-22]、LC-MS/MS[23-24]等。近年來,膳食中包括HODEs在內(nèi)的脂質(zhì)氧化產(chǎn)物與人類多種疾病的關(guān)系越來越受到關(guān)注,其分析方法、形成規(guī)律及機(jī)理等已成為食品科學(xué)的一大研究熱點(diǎn)。對食品中的13-HODE和9-HODE同時進(jìn)行分析,可以完整地了解食品中的HODEs含量水平,為進(jìn)一步開展暴露評估提供數(shù)據(jù)。另一方面,由此得到的二者比例可用于評價亞油酸氧化中酶促氧化和非酶促氧化途徑的貢獻(xiàn),是研究腌臘肉制品中HODEs形成機(jī)制的重要內(nèi)容[4,21]。Püssa 等[13]和Song等[14]建立了肉制品中HODEs含量的LC-MS/MS分析方法。LC-MS/MS在靈敏度、準(zhǔn)確性等方面具有顯著的優(yōu)勢,但設(shè)備昂貴,難以在非專業(yè)分析實驗室普及推廣。本文利用HODEs存在共軛雙鍵,在234 nm具有紫外吸收的特性,建立同時測定9-HODE和13-HODE的正相HPLC-DAD分析方法。方法操作簡便、快捷,具有較好的靈敏度和準(zhǔn)確性,滿足腌臘肉制品9-HODE和13-HODE含量分析的要求,適于非專業(yè)化學(xué)分析實驗室推廣應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

農(nóng)家臘腸、肉丁香腸及咸肉 購自附近農(nóng)貿(mào)市場;柴火臘肉、純?nèi)舛∠隳c、金字香腸、雨潤臺式香腸、蘇式香腸 購自BHG超市;雙匯特嫩方腿香腸、雙匯蒜蓉烤腸、雙匯臺式烤香腸、荷爾美加州香腸、荷爾美鮮嫩香腸 購自蘇果超市;標(biāo)準(zhǔn)品0.1 mg/mL 9-HODE及0.5 mg/mL 13-HODE 上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司;Sep-Pak C18固相萃取柱(500 mg/3 mL) 美國Waters公司;正己烷、異丙醇及乙酸 均為色譜純;其余試劑 均為分析純。

高效液相色譜Waters e2695 美國Milford公司,配有二極管陣列檢測器(DAD);Biofuge stratos高速離心機(jī) 德國Heraeus公司;T25高速勻漿機(jī) 德國IKA公司;氮吹儀 美國Organomation公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 吸取適量體積質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的13-HODE、0.1 mg/mL 9-HODE的標(biāo)準(zhǔn)溶液小心氮吹,用正己烷分別配制成濃度為20 μg/mL的儲備液。再取適量儲備液,配制13-HODE和9-HODE的系列混合工作溶液,濃度范圍分別為0.5～20 μg/mL和1～12.5 μg/mL,置于-40 ℃儲存,有效期為一個月。

1.2.2 固相萃取條件的優(yōu)化

1.2.2.1 甲醇濃度對凈化效果的影響 用不同濃度甲醇水溶液(40%～90%,v/v)配制質(zhì)量濃度均為0.5 μg/mL的13-HODE,9-HODE的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別吸取5 mL溶液過C18小柱(預(yù)先用3 mL甲醇、3 mL水進(jìn)行活化與平衡),然后再進(jìn)行甲醇(2 mL)洗脫,氮吹后正己烷(200 μL)溶解,并進(jìn)行色譜分析(每個濃度的甲醇水溶液做三個重復(fù))。

1.2.2.2 甲醇體積對凈化效果的影響 用40%(v/v)的甲醇水溶液配制質(zhì)量濃度均為0.5 μg/mL的13-HODE,9-HODE的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別吸取5 mL溶液過C18小柱(預(yù)先用3 mL甲醇、3 mL水進(jìn)行活化與平衡),然后分別選用不同體積的甲醇(0.5～3 mL)洗脫,氮吹后正己烷(200 μL)溶解,并進(jìn)行色譜分析(每個體積的甲醇水溶液做三個重復(fù))。

1.2.3 樣品處理 根據(jù)Song等[14]的方法,并作修改。將選購的腌臘肉制品切碎至均勻肉餡狀,裝入密封袋,置于-20 ℃儲存?zhèn)溆谩７Q取2 g樣品于80 mL離心管中,加入15 mL甲醇后5000 r/min均質(zhì)2 min,加水10 mL,混合均勻后3200 r/min離心10 min。吸取5 mL上清液過C18固相萃取柱(預(yù)先用3 mL甲醇、3 mL水進(jìn)行活化與平衡),然后用2 mL甲醇洗脫,洗脫液在30 ℃下氮吹至干,溶于200 μL正己烷(對于HODEs含量高的樣品,需根據(jù)HODE的含量增加正己烷用量,保證目標(biāo)分析物的濃度在線性范圍內(nèi)),過0.22 μm濾膜,用于色譜分析。

樣本處理換算公式:

HODE的含量(μg/g)=5c×v/2

其中,c為樣品中HODE的質(zhì)量濃度(μg/mL),v為氮吹后溶于正己烷的體積(mL),2為樣品的質(zhì)量(g),5為總樣品液與C18小柱上樣液的體積之比。

1.2.4 色譜條件 色譜柱:Lichrosorb Si 60(250 mm×4.0 mm,5 μm);流動相:正己烷/異丙醇/乙酸(98∶2∶0.5,v/v/v);流速:1 mL/min;柱溫:30 ℃;檢測器:二極管陣列(DAD),波長:234 nm;進(jìn)樣量:10 μL。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 將13-HODE和9-HODE系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,進(jìn)行HPLC-DAD分析,每個濃度重復(fù)測定3次。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μg/mL)為x,以峰面積為y,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。按照3倍信噪比(S/N=3)和10倍信噪比(S/N=10)計算方法的檢出限和定量限,并根據(jù)樣本處理換算公式得到樣本的檢出限和定量限。

1.2.6 精密度實驗 分別選用高、中、低HODEs含量的三種腌臘肉制品,按照1.2.3進(jìn)行樣品處理。日內(nèi)精密度實驗:在1 d內(nèi),樣品按6個重復(fù)進(jìn)行處理、并完成高效液相色譜分析;日間精密度實驗:每天按3個重復(fù)處理樣品，并完成高效液相色譜分析,連續(xù)進(jìn)行4 d。以測得的結(jié)果分別計算日內(nèi)和日間的精密度(以相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD表示)。

1.2.7 回收率實驗 分別選用高、中、低HODEs含量的三種腌臘肉制品,進(jìn)行13-HODE和9-HODE的回收率實驗。根據(jù)樣品中13-HODE和9-HODE的含量分別添加水平相近的13-HODE和9-HODE標(biāo)準(zhǔn)品,按1.2.3進(jìn)行處理,每個添加水平做3個重復(fù),測定其13-HODE和9-HODE的含量,計算兩種目標(biāo)分析物的回收率。

1.2.8 兩種方法同時檢測14種腌臘肉制品中13-HODE和9-HODE的含量 運(yùn)用本文建立的HPLC-DAD方法對14種腌臘肉制品中的13-HODE和9-HODE的含量進(jìn)行測定,同時根據(jù)Song等[14]的方法,采用LC-MS/MS對這幾種腌臘肉制品中的目標(biāo)分析物進(jìn)行測定,并對其測定結(jié)果進(jìn)行比較,進(jìn)一步驗證本方法的準(zhǔn)確性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS statistics 17.0進(jìn)行單因素方差分析與相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 固相萃取條件的優(yōu)化

生物樣本中HODEs的分析檢測多采用溶劑萃取的方法,常用的提取溶劑有乙酸乙酯[21]、甲醇[16-17]、乙醚等[22,25]。因此,本文選擇乙酸乙酯、甲醇、乙醚等溶劑提取腌臘肉制品中的HODEs,并對提取效率進(jìn)行了比較。結(jié)果表明,甲醇的提取效率最高。但腌臘肉制品富含蛋白、脂肪等,簡單的液液萃取難以有效去除這些雜質(zhì),影響HODEs的定性、定量分析。Pussa 等[13]和Song等[14]運(yùn)用固相萃取(SPE)進(jìn)行凈化,采用提取液直接過C18小柱的方法,可以滿足LC-MS/MS分析的要求。但這樣的SPE方法不適于本文建立的正相HPLC-DAD檢測方法。

為了優(yōu)化腌臘肉制品甲醇提取液中HODEs的固相萃取條件,本文利用HODEs標(biāo)準(zhǔn)溶液,觀察了不同濃度甲醇水溶液(40%～90%,v/v)對HODEs在C18小柱上保留的影響,結(jié)果如圖1。由圖1可看出,當(dāng)甲醇濃度大于65%(v/v)時,溶液中的HODEs不能完全保留在C18小柱上。最終將提取液甲醇濃度調(diào)整至60%(v/v),然后離心、上樣,以確保樣品中的HODEs完全保留在C18小柱上。在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步研究了洗脫C18小柱上HODEs所需的最小甲醇使用量,結(jié)果如圖2。由圖2可知,當(dāng)洗脫液甲醇體積≥1.5 mL時,均可將HODEs從C18小柱上洗脫下來,最終選擇2 mL甲醇用量以求完全洗脫HODEs。本文建立的腌臘肉制品中HODEs的C18小柱SPE凈化方法,最大限度的去除了雜質(zhì),較好地體現(xiàn)了SPE凈化、濃縮的特點(diǎn)。

圖1 甲醇濃度對回收率的影響Fig.1 Effects of methanol concentration on recovery rate

圖2 甲醇體積對回收率的影響Fig.2 Effects of methanol volume on recovery rate

2.2 色譜條件的優(yōu)化

HODEs具有共軛雙鍵,在234 nm具有的特征吸收使建立HODEs的HPLC-UV或HPLC-DAD分析方法成為可能。為了實現(xiàn)同時分析腌臘肉制品中的13-HODE和9-HODE,本文利用混合標(biāo)準(zhǔn)溶液比較了二者在反相柱(C18柱)和正相柱(Si 60柱)的保留行為。當(dāng)選用C18柱時,13-HODE和9-HODE的保留時間極為接近,先后采用等度和多種模式的梯度洗脫,都無法實現(xiàn)二者的完全分離。當(dāng)選用Si 60柱時,二者在等度條件下即可以獲得完全分離。因此,本文選用Si 60柱作為色譜分離柱,在此基礎(chǔ)上對色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化。

基于腌臘肉制品成分復(fù)雜,本文參考文獻(xiàn)[16]選擇正己烷、異丙醇為主要成分構(gòu)成流動相,觀察了兩者比例對雜質(zhì)和HODEs分離的影響。正己烷與異丙醇的比例顯著影響13-HODE和9-HODE的保留時間,HODEs的保留時間隨著異丙醇比例的增加而縮短,當(dāng)正己烷:異丙醇的比例為98∶2(v/v)時,HODEs的保留時間適中,可與雜質(zhì)實現(xiàn)基線分離。HODEs為含羥基的長碳鏈羧酸,流動相pH影響對其保留行為也有影響。本文選擇乙酸降低流動相pH,抑制HODEs的解離。在0.05%～1.2%(v/v)的范圍內(nèi),隨著乙酸的增加,HODEs的峰型逐步得到改善,但由于其截止波長(230 nm)與HODEs特征吸收波長234 nm相近,導(dǎo)致基線噪聲不斷上升,影響HODEs的靈敏度。因此,最終將乙酸濃度設(shè)定在0.5%(v/v)。

本文還觀察了流速、柱溫對HODEs在Si 60柱上保留的影響。流速、柱溫的提高均可以縮短HODEs的保留時間,提高分析效率,但過度的增加流速和柱溫也會影響HODEs與雜質(zhì)的分離,同時提升儀器系統(tǒng)壓力。綜合考慮,本文設(shè)定的流速為1 mL/min,柱溫為30 ℃。

表2 13-HODE的日內(nèi)精密度實驗結(jié)果Table 2 Intra-day precision of the method for determination of 13-HODE

表3 9-HODE的日內(nèi)精密度實驗結(jié)果Table 3 Intra-day precision of the method for determination of 9-HODE

在本文設(shè)定的色譜條件下,HODEs具有適中的保留時間(分別為7.12 min和9.22 min)和良好的峰型,與雜質(zhì)完全分離。圖1中的A和B分別是13-HODE和9-HODE混合標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的色譜圖。

圖3 混標(biāo)與香腸樣品的液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of HODEs in mixed standard solution and in sausage sample注:A:混標(biāo)1=13-HODE(5.0 μg/mL);2=9-HODE (10.0 μg/mL);B:肉丁香腸1=13-HODE (4.91 μg/g);2=-HODE(2.5 μg/g)。

2.3 線性范圍及最低檢測限

配制13-HODE和9-HODE濃度分別為0.5～20 μg/mL和1～12.5 μg/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,然后進(jìn)行HPLC-DAD測定。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μg/mL)為x,其對應(yīng)的峰面積為y,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,線性相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.999,由此可見在本文設(shè)定的范圍內(nèi),13-HODE和9-HODE 濃度與峰面積具有良好的線性關(guān)系。按照3倍信噪比(S/N=3)和10倍信噪比(S/N=10)計算方法的檢出限和定量限,13-HODE和9-HODE的檢出限分別為0.075 μg/g和0.15 μg/g,定量限分別為0.25 μg/g和0.50 μg/g(見表1)。腌臘肉制品中HODEs的含量普遍高于1 μg/g,甚至高達(dá)100 μg/g以上[14]。因此,本文建立的腌臘肉制品中13-HODE和9-HODE的分析方法可以滿足同時分析腌臘肉制品中13-HODE和9-HODE含量的要求。

表1 方法的線性、檢出限以及定量限Table 1 The linearity,detection limits, quantification limits of the proposed method

2.4 精密度實驗

本方法的精密度通過對高、中、低三種HODEs水平的腌臘肉制品中13-HODE和9-HODE的日內(nèi)和日間實驗進(jìn)行評價,實驗結(jié)果見表2～表5。13-HODE的日內(nèi)和日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為1.5%～2.7%和2.2%～2.5%,9-HODE日內(nèi)和日間RSD分別為1.6%～2.5%和2.3%～3.1%。由此可見,本文建立的腌臘肉制品中13-HODE和9-HODE的分析方法具有較好的精密度。

表4 13-HODE的日間精密度實驗結(jié)果(n=3)Table 4 Inter-day precision of the method for determination of 13-HODE(n=3)

表5 9-HODE的日間精密度實驗結(jié)果(n=3)Table 5 Inter-day precision of the method for determination of 9-HODE(n=3)

2.5 回收率實驗

本文通過添加回收實驗驗證方法的準(zhǔn)確性。選擇高、中、低三種HODEs水平的腌臘肉制品,分別添加與其自身HODEs水平相近的13-HODE和9-HODE標(biāo)準(zhǔn)品,通過分析添加前后的樣品中HODEs的含量,計算回收率,結(jié)果見表6。

由表6可以看出,在3～15 μg/g的添加范圍內(nèi),13-HODE的回收率在83.3%～91.7%之間,平均回收率為88.2%;在1～6 μg/g 的添加范圍內(nèi),9-HODE的回收率在82.0%～89.2%之間,平均回收率為86.0%。由此可見,本文建立的腌臘肉制品中13-HODE和9-HODE的分析方法具有較好的準(zhǔn)確性。

表6 分析物在不同添加水平的回收率(n=3)Table 6 Recoveries of the analytes at different spiked levels(n=3)

2.6 實際樣品分析

為了驗證建立的腌臘肉制品中13-HODE和9-HODE的HPLC-DAD分析方法,本文采集了附近農(nóng)貿(mào)市場、超市的14種腌臘肉制品,包括生制腌臘肉制品9種和即食腌臘肉制品5種,采用1.2.3的樣品前處理方法,并在1.2.4的色譜條件下對其中13-HODE和9-HODE的含量進(jìn)行了分析,結(jié)果見表7。

表7 實際樣品中13-HODE和9-HODE的含量(n=3)Table 7 Contents of 13-HODE and 9-HODE in practical samples(n=3)

從表7中可以看出,所有樣本都含有13-HODE和9-HODE,其中13-HODE的含量1.20～167.54 μg/g,9-HODE的含量0.63～139.20 μg/g。不同產(chǎn)品中的HODEs含量差異巨大,這一現(xiàn)象與Song等[14]的報道一致。腌臘肉制品種類繁多,原輔料以及加工工藝也大不相同。原料中脂質(zhì)含量、加工溫度、時間以及添加劑等對脂質(zhì)氧化程度及其產(chǎn)物都具有重要影響[26],這可能是導(dǎo)致不同腌臘肉制品中HODEs含量差異巨大的原因。

為了進(jìn)一步驗證本文建立的腌臘肉制品中13-HODE和9-HODE的分析方法,我們參考Song等[14]的方法,采用LC-MS/MS對上述腌臘肉制品中農(nóng)家臘腸、雙匯特嫩方腿香腸和荷爾美鮮嫩香腸中13-HODE和9-HODE的含量同時進(jìn)行了分析,兩種方法的結(jié)果列于表8。統(tǒng)計分析顯示,兩種方法的結(jié)果之間無顯著差異,進(jìn)一步表明本文建立的腌臘肉制品中13-HODE和9-HODE的分析方法具有優(yōu)良的準(zhǔn)確性。

3 結(jié)論

表8 兩種測定方法檢測三種腌臘肉制品中13-HODE和9-HODE的含量(n=3)Table 8 Contents of 13-HODE and 9-HODE in three practical samples(n=3)by two methods

本文通過樣本處理條件以及色譜條件的優(yōu)化,建立了同時測定腌臘肉制品中13-HODE、9-HODE的HPLC-DAD分析方法。腌臘肉制品中13-HODE和9-HODE用甲醇提取,經(jīng)固相萃取柱凈化濃縮,在Si 60色譜柱上進(jìn)行分離,流動相為正己烷/異丙醇/乙酸(98∶2∶0.5,v/v),在234 nm對13-HODE、9-HODE進(jìn)行檢測。結(jié)果表明,13-HODE、9-HODE分別在0.5～20、1.0～12.5 μg/mL的范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系(R2>0.999),檢出限分別為0.075、0.15 μg/g,定量限分別為0.25、0.50 μg/g,不同添加水平的平均回收率分別為88.2%,86.0%。對14種腌臘肉制品含量分析表明,所有樣本都含有13-HODE和9-HODE,含量分別在1.2～167.54、0.63～139.20 μg/g范圍內(nèi)。腌臘肉制品普遍含有羥基十八碳二烯酸,其形成規(guī)律及機(jī)理、膳食暴露等值得進(jìn)一步研究。

[1]Mueller H W,O’Flaherty J T,Wykle R L. Ether lipid content and fatty acid distribution in rabbit polymorphonuclear neutrophil phospholipids[J]. Lipids,1982,17(2):72.

[2]Lagarde M,Sicard B,Guichardant M,et al. Fatty acid composition in native and cultured human endothelial cells[J].InVitroCellular & Developmental Biology-Plant,1984,20(1):33.

[3]Niki E,Yoshida Y,Saito Y,et al. Lipid peroxidation:Mechanisms,inhibition,and biological effects[J]. Biochemical & Biophysical Research Communications,2005,338(1):668-676.

[4]Niki E. Lipid peroxidation:Physiological levels and dual biological effects[J]. Free Radical Biology & Medicine,2009,47(5):469-484.

[5]Gardner H W. Isolation of a pure isomer of linoleic acid hydroperoxide[J]. Lipids,1975,10(4):248-252.

[6]Ku G,Thomas C E,Akeson A L,et al. Induction of interleukin 1 beta expression from human peripheral blood monocyte-derived macrophages by 9-hydroxyoctadecadienoic acid[J]. Journal of Biological Chemistry,1992,267(20):14183.

[7]Mangan D F,Welch G R,Wahl S M. Lipopolysaccharide,tumor necrosis factor-alpha,and IL-1 beta prevent programmed cell death(apoptosis)in human peripheral blood monocytes[J]. Journal of Immunology,1991,146(5):1541-1546.

[8]Blondin G A. Isolation,properties,and structural features of divalent cation ionophores derived from beef heart mitochondria[J]. Annals of the New York Academy of Sciences,1975,264(1 Carriers and):98-111.

[9]Choque B,Catheline D,Rioux V,et al. Linoleic acid:Between doubts and certainties[J]. Biochimie,2014,96(1):14-21.

[10]Jira W,Spiteller G,Carson W,et al. Strong increase in hydroxy fatty acids derived from linoleic acid in human low density lipoproteins of atherosclerotic patients[J]. Chemistry & Physics of Lipids,1998,91(1):1-11.

[11]Reddy N,Everhart A,Eling T,et al. Characterization of a 15-lipoxygenase in human breast carcinoma BT-20 cells:stimulation of 13-HODE formation by TGF alpha/EGF[J]. Biochemical & Biophysical Research Communications,1997,231(1):111-116.

[12]Martínez-Yusta A,Goicoechea E,Guillén M D. A Review of Thermo-Oxidative Degradation of Food Lipids Studied by 1 H NMR Spectroscopy:Influence of Degradative Conditions and Food Lipid Nature[J]. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety,2014,13(5):838-859.

[13]Püssa T,Raudsepp P,Toomik P,et al. A study of oxidation products of free polyunsaturated fatty acids in mechanically deboned meat[J]. Journal of Food Composition & Analysis,2009,22(4):307-314.

[14]Song H,Wu H,Geng Z,et al. Simultaneous determination of 13-HODE,9,10-DHODE,and 9,10,13-THODE in cured meat products by LC-MS/MS[J]. Food Analytical Methods,2016(10):1-10.

[15]Montine T J,Quinn J,Kaye J,et al. F(2)-isoprostanes as biomarkers of late-onset Alzheimer’s disease[J]. Journal of Molecular Neuroscience,2007,33(1):114-119.

[16]Inouye M,Mio T,Sumino K. Formation of 9-hydroxy linoleic acid as a product of phospholipid peroxidation in diabetic erythrocyte membranes.[J]. Biochimica Et Biophysica Acta,1999,1438(2):204.

[17]Li L,Duker J S,Yoshida Y,et al. Oxidative stress and antioxidant status in older adults with early cataract[J]. Eye,2009,23(6):1464-1468.

[18]Spindler S A,Clark K S,Callewaert D M,et al. Significance and immunoassay of 9-and 13-hydroxyoctadecadienoic acids[J].Biochemical & Biophysical Research Communications,1996,218(1):187.

[19]Spindler S A,Clark K S,Blackburn M L,et al. Occurrence of 13(S)-Hydroxyoctadecadienoic Acid in Biological Samples-Importance of lipoxygenases in modulating epidermal growth factor-dependent mitogenesis[J]. Prostaglandins,1997,54(6):875-880.

[20]Tonogai Y,Tai H H. Quantitation of 13-hydroxyoctadecadienoic acid(13-HODE)by radioimmunoassay[J]. Prostaglandins Leukotrienes & Essential Fatty Acids,1990,39(39):125-129.

[21]Cho H,Gallaher D D,Csallany A S. Nonradiometric HPLC measurement of 13(S)-hydroxyoctadecadienoic acid from rat tissues[J]. Analytical Biochemistry,2003,318(1):47-51.

[22]Gata J L,Pinto M C,Macias P. Lipoxygenase activity in pig muscle:purification and partial characterization.[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry,1996,44(9):2573-2577.

[23]Levandi T,Püssa T,Vaher M,et al. Oxidation products of free polyunsaturated fatty acids in wheat varieties[J]. European Journal of Lipid Science & Technology,2009,111(7):715-722.

[24]Yuan Z X,Rapoport S I,Soldin S J,et al. Identification and profiling of targeted oxidized linoleic acid metabolites in rat plasma by quadrupole time-of-flight mass spectrometry[J]. Biomedical Chromatography,2013,27(4):422-432.

[25]Teng J I,Smith L L. High-performance liquid chromatography of linoleic acid hydroperoxides and their corresponding alcohol derivatives[J]. J Chromatogr,1985,350(2):445-451.

[26]Jin G F. Lipolysis and lipid oxidation in bacon during curing and drying-ripening.[J]. Food Chemistry,2010,123(2):465-471.