SERS技術(shù)應(yīng)用于食品中羅丹明B的快速檢測

, ,,懷志,*

(1.廈門華廈學(xué)院檢驗科學(xué)與技術(shù)系,福建廈門 361024; 2.廈門大學(xué)薩本棟微米納米科學(xué)技術(shù)研究院,福建廈門 361005; 3.廈門市普識納米科技有限公司,福建廈門 361005)

食品安全已成為全民共同關(guān)注的主要問題,完善的樣品處理及檢測技術(shù)可以幫助我們及時發(fā)現(xiàn)食品安全中存在的問題。目前,針對不同樣品缺乏最佳的處理及檢測方式,使得對所檢樣品準(zhǔn)確、可靠的監(jiān)測和控制不能完全實現(xiàn)。因此,開發(fā)出準(zhǔn)確、便捷的食品樣品處理和檢測技術(shù)對保障食品安全意義重大[1-2]。

羅丹明B(Rhodamine B,RB)是一種人工合成的三苯甲烷類堿性染料,曾經(jīng)用作食品添加劑,根據(jù)國際癌癥研究署(IARC)化學(xué)品致癌風(fēng)險評價實驗證明RB具有潛在的毒性和致癌性[3],目前我國和歐盟等都嚴(yán)禁在食品中添加,是近些年來食品中重點監(jiān)測的非法添加劑[4]。但因其具有色澤鮮艷[5]、著色穩(wěn)定[6]、價格低廉[7]等特點,常被一些不法商家非法用作食品著色劑(以辣椒制品為主),嚴(yán)重危害了消費者的健康。目前,在中國還沒有關(guān)于羅丹明B檢測的國家標(biāo)準(zhǔn),也沒有快速檢測標(biāo)準(zhǔn),只有進出口食品中羅丹明B的檢測標(biāo)準(zhǔn)[8]。主要檢測方法是提取后經(jīng)凝膠色譜凈化,再用HPLC和HPLC-MS聯(lián)用法進行檢測[8]。該處理系統(tǒng)價格昂貴,過程繁瑣,應(yīng)用設(shè)備多,所需有機溶劑復(fù)雜,且檢測時間長,很難普及,更不適用于現(xiàn)場快速檢測。在快速檢測方面,有根據(jù)固相萃取原理開發(fā)出來的快速檢測法[9-10],但該法主要是根據(jù)肉眼觀察固相萃取柱上的紅色條帶進行判斷,易出現(xiàn)假陽性,準(zhǔn)確度低,檢測靈敏度也不高。

激光技術(shù)的出現(xiàn)使拉曼光譜檢測方式在分析化學(xué)等很多領(lǐng)域中得到了很好的發(fā)展和應(yīng)用。表面增強拉曼光譜(SERS)是近年來發(fā)展起來的一項高靈敏度振動光譜檢測技術(shù),借助于納米金屬基底的表面等離激元誘導(dǎo)的表面電磁場的增強效應(yīng),SERS可將待測物的信號放大6～10個數(shù)量級[11-12],在食品科學(xué)和材料科學(xué)等領(lǐng)域已經(jīng)得到了廣泛應(yīng)用[13-14]。

本實驗提出了一種以納米金溶膠為拉曼信號增強模塊,結(jié)合SERS快速分析的特點,利用自制的樣品前處理儀與便攜式拉曼光譜檢測儀,實現(xiàn)對辣椒制品、臘肉、果汁、葡萄酒等食品中羅丹明B的快速檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

散裝辣椒粉、海堤特級辣椒醬、海堤泰式甜辣醬、愛之味酸辣醬和壇壇鄉(xiāng)精制剁椒醬,實驗編碼為L0～L4；廣東風(fēng)味臘腸和天鑼香腸,實驗編碼為R1、R2；果繽紛、貝奇野菜以及長城干紅葡萄酒,實驗編碼為G1～G3；以上材料均購自廈門生鮮超市；氯金酸(HAuCl4)、檸檬酸鈉、正己烷等實驗中所用試劑 分析純,上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司;羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)品 上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司;水溶液皆用超純水(Millipore)配制;金納米粒子(自制);pers-A1增強助劑 廈門市普識納米科技公司。

自制SERS前處理儀 與廈門市普識納米科技公司合作研發(fā)),如圖1所示:儀器由超聲池、揮發(fā)池、離心裝置以及控制系統(tǒng)構(gòu)成。揮發(fā)池同時具有加熱揮發(fā)和抽氣揮發(fā)兩種功能,即可以提高揮發(fā)度,又能通過抽氣方式增加空氣流動,對揮發(fā)出來的萃取劑進行迅速抽離;自帶離心裝置,可以現(xiàn)場對少量樣品進行快速離心;控制系統(tǒng)可以實現(xiàn)對超聲時間、抽氣時間、加熱溫度等的控制；便攜式拉曼光譜儀 美國Dalt Nu公司;HITACHI S-4800型掃描電鏡 Hitachi公司;Waters 2695E液相色譜儀(帶熒光檢測器) 美國Waters 公司;UV-3600紫外可見分光光度計 日本島津公司。

圖1 自制SERS前處理儀Fig.1 Appearance of the homemade SERS

1.2 金納米溶膠的制備及表征

利用檸檬酸鈉還原HAuCl4的方法[15]合成金納米溶膠。制備過程如下:將1.2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的檸檬酸鈉迅速加入到含有1 mmol/L HAuCl4的100 mL沸水溶液中,同時劇烈攪40 min,得到棕紅色納米金溶膠。取兩份適量金溶膠,一份進行紫外可見光譜(UV/Vis)分析，掃描延長為400～800 nm;另一份在5500 r/min室溫條件下離心分離10 min,棄去上清液至剩余約5 μL左右的濃縮金納米粒子,后用超純水稀釋10倍,用移液槍移取5 μL滴加在準(zhǔn)備好的硅片上,真空抽干,進行電鏡(SEM)掃描。

1.3 羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)品適量,加入無水乙醇溶解,配成質(zhì)量濃度為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。再分別準(zhǔn)確量取適量儲備液,用水稀釋成所需濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4 樣品前處理及羅丹明B的提取

1.4.1 辣椒粉及其相關(guān)制品類固體調(diào)味品的前處理方法 分別稱取1.0 g海堤特級辣椒醬、海堤泰式甜辣醬、愛之味酸辣醬和壇壇鄉(xiāng)精制剁椒醬于提取劑瓶中,加入10 mL超純水,放置于便攜式快速前處理儀超聲處理模塊,超聲頻率40 kHz,功率為60 W,超聲振蕩1 min,取上清液于分離管中,平行三份,依據(jù)檢測要求分別加入0.5、1.0 mg/kg的羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)溶液,之后向溶液中加入4 mL的正己烷進行萃取,將分離管放置于便攜式快速前處理儀揮發(fā)模塊進行加熱吹干,待測。

1.4.2 肉制品的前處理方法 由于在肉制品中,色素主要吸附于肉制品的纖維中,利用水進行提取,提取效率低,故采用正己烷作為提取劑,其余操作條件同1.4.1。分別取1.0 g廣東風(fēng)味臘腸和天鑼香腸樣品,經(jīng)超聲提取后,上清液置于分離管中,平行三份,依據(jù)檢測要求分別加入0.5、1.0 mg/kg的羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)溶液,放置于便攜式快速前處理儀揮發(fā)模塊進行加熱吹干后待測。

1.4.3 果汁、葡萄酒等液體樣品的前處理方法 分別量取4 mL果繽紛、貝奇野菜以及長城干紅葡萄酒于分離管中,加入8 mL正己烷萃取,平行三份,依據(jù)檢測要求分別加入0.5、1.0 mg/kg的羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)溶液,將分離管放置于便攜式快速前處理儀揮發(fā)模塊進行加熱吹干后待測。

1.4.4 前處理方法對比 為了驗證自制快速處理儀器的提取性能,本實驗也進行了自制前處理儀與常規(guī)樣品處理方法的對比。其中,實驗室常規(guī)提取方法的具體流程[16-17]為:

稱取1.0 g樣品→經(jīng)超聲提取(30 ℃,10 min)→離心(室溫,5500 r/min 5 min)→正己烷萃取(4 min)→靜置分層(11 min)→氮吹(10 min)→超純水重新溶解(0.5 mL)→即得到提取液。

1.5 拉曼光譜分析

取400 μL上述待測樣品,加入20 μL金納米溶膠,再加入20 μL pers-A1增強助劑,混勻后迅速在便攜式拉曼光譜儀上進行檢測。該儀器的激光波長為785 nm,激光功率為60 mW,激發(fā)時間少于5 s,掃譜范圍為200～1800 cm-1。

1.6 液相色譜分析

取1.4.4所得辣椒粉樣品提取液,離心后取上清液過0.45 μm微孔濾膜后,采用液相色譜測定。色譜條件:流動相A:0.1%甲酸乙腈,B:0.1%甲酸溶液;0 min:A 20%;5.0 min:A 50%;8.0 min:A 50%;8.1 min:A 20%;15 min:A 20%。色譜柱:Symmetry Shield RP 4.6 mm×250 mm,185 μm,流速:1.0 mL/min;柱溫:35 ℃;檢測波長:Ex 550 nm,Em 580 nm;進樣體積:5.0 μL。

1.7 數(shù)據(jù)處理

因為光源輸出功率的穩(wěn)定性、樣品不同添加濃度等因素會引起拉曼信號的偏差,影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此,本實驗選擇羅丹明B的一個穩(wěn)定特征峰(1355 cm-1)為內(nèi)標(biāo)信號,采用內(nèi)標(biāo)法定量。將羅丹明B的另外三個特征峰(620、1510、1645 cm-1)與內(nèi)標(biāo)峰比值作為相對強度,以相對強度作為加標(biāo)不同濃度的羅丹明B溶液的響應(yīng)值進行歸一化計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 自制金粒子溶膠表征

取適量1.2中自制金納米溶膠進行UV/Vis和SEM分析,結(jié)果如圖2所示,從UV/Vis(圖2A)圖可以看出,在550 nm附近有一個明顯的吸收峰對應(yīng)50 nm左右金納米粒子的特征吸收峰;而由SEM(圖2B)則可以得知合成的金納米粒子顆粒較為均勻,大小在45～50 nm之間,與紫外可見光譜結(jié)果一致。

圖2 自制金納米粒子的紫外-可見吸收光譜及SEM電鏡圖Fig.2 UV/Vis and SEM diagram of Au colloid 注:A為紫外-可見吸收光譜, B為SEM電鏡圖(40.0 k×)。

2.2 辣椒粉經(jīng)常規(guī)前處理和快速法處理的SERS結(jié)果對比

從圖3可以看到,兩種處理方法得到的樣品在620、1355、1510、1645 cm-1處都出現(xiàn)了羅丹明B的特征拉曼峰。其中,620 cm-1處的拉曼峰對應(yīng)氧雜蒽環(huán)的面內(nèi)振動模式,1355 cm-1處的拉曼峰對應(yīng)苯環(huán)上的C-C單鍵的彎曲振動,1510 cm-1處的拉曼峰對應(yīng)苯環(huán)上C-H單鍵的彎曲振動,而1645 cm-1附近的拉曼峰則對應(yīng)苯環(huán)上的C-C單鍵的彎曲或C=C雙鍵的伸縮振動模式。兩種處理方法對于SERS譜圖的影響差異并不明顯。另外,用常規(guī)方法處理辣椒粉,整個過程需要大約40～45 min,而用自制的快速前處理儀進行樣品處理只需要大約10 min,時間上縮短了3/4,大大提高了檢測效率。

圖3 羅丹明B實驗室常規(guī)處理方法與快檢法SERS對比圖Fig.3 SERS spectrum of Rhodamine B with the instrument and the pretreatment methods注:a:自制前處理儀(約10 min);b:常規(guī)方法(40～45 min)。

2.3 不同辣椒制品中各種成分的干擾實驗

2.3.1 不同辣椒制品中RB的SERS檢測 為保證檢測結(jié)果的有效性,實驗同時進行羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)品、空白樣品和加標(biāo)樣品的對比測定,結(jié)果如圖4所示。通過對市面上不同品牌的辣椒調(diào)味品進行測試發(fā)現(xiàn):未添加標(biāo)準(zhǔn)羅丹明B的辣椒制品(空白樣品)的SERS曲線(圖4中所有e曲線),在200～1800 cm-1區(qū)間內(nèi),基本上為無特征信號的背景曲線,說明空白樣品中不含RB成分;而對比羅丹明標(biāo)準(zhǔn)品的SERS譜圖可以看到,加標(biāo)0.2 mg/kg濃度的RB后的樣品SERS曲線在620、1355、1510、1645 cm-1處出現(xiàn)了羅丹明B的尖銳特征峰,而且隨著羅丹明B加標(biāo)溶液質(zhì)量濃度的增大,拉曼峰強度也隨著增強,說明檢測出了羅丹明B的存在。這表明本實驗方法能對這些成分復(fù)雜多樣的辣椒制品中所含痕量羅丹明B進行高靈敏度的快速檢測,同時不受不同的樣品成分的干擾。本方法對辣椒制品的檢測具有普適性,而且檢測低限可達(dá)到0.2 mg/kg。

圖4 不同成分辣椒制品中羅丹明B SERS譜圖Fig.4 SERS spectrum of Rhodamine B in chilli products注:L1～L4分別為海堤特級辣椒醬、海堤泰式甜辣醬、愛之味酸辣醬和壇壇鄉(xiāng)精制剁椒醬。

2.3.2 SERS和常規(guī)液相色譜方法對比實驗 為了驗證快速檢測方法的可行性,實驗選取了辣椒粉及其制品經(jīng)快速前處理儀提取后,進行SERS和常規(guī)液相色譜兩種方法檢測,結(jié)果如表1所示。

表1 實際辣椒粉樣品及辣椒制品的SERS及LC兩種方法檢測結(jié)果對比Table 1 Determination results of the chilli samples

由表1可以看出,除了散裝辣椒粉中含有微量羅丹明B以外,其他辣椒制品中均不含該成分,兩種檢測結(jié)果真實可信且無明顯差異,說明本實驗方法可用于各種辣椒制品中羅丹明B的現(xiàn)場篩查或?qū)嶒炇翌A(yù)檢。

2.4 其他食品中羅丹明B的檢測

2.4.1 肉制品中羅丹明B的檢測 由于在肉制品中,色素主要吸附于肉制品的纖維中,利用水進行提取,提取效率低,低濃度情況下無法檢出,而且在1 mg/kg時信號也比較微弱。因此,本實驗直接采用正己烷提取臘肉及其他肉制品中的羅丹明B,結(jié)果如圖5所示。由圖5中可知,未添加標(biāo)準(zhǔn)羅丹明B的肉制品(空白樣品)的SERS譜圖(d曲線)中,200～1800 cm-1區(qū)間內(nèi),基本上依然是無特征信號的背景曲線,說明兩種肉制品中不含羅丹明B成分;當(dāng)添加0.5 mg/kg及以上濃度的標(biāo)準(zhǔn)羅丹明B溶液時,SERS譜圖在了620、1355、1510、1645 cm-1附近明顯出現(xiàn)了羅丹明B的尖銳特征峰,能夠輕易地分辨出該臘肉等制品中是否添加了羅丹明B。本實驗方法可成功實現(xiàn)對臘腸中羅丹明B的檢測,而且最低檢測濃度可達(dá)0.5 mg/kg。

圖5 肉制品中羅丹明B的SERS譜圖 Fig.5 SERS spectrum of Rhodamine B in Bacon and its products注:R1、R2分別為廣東風(fēng)味臘腸和天鑼香腸。

2.4.2 果汁及葡萄酒中羅丹明B檢測 為了驗證方法的普適性,實驗還對果汁、葡萄酒等進行快速檢測。由于SERS具有指紋圖譜特點,所以葡萄酒類樣品無需任何前處理。以加標(biāo)0.5、1 mg/kg羅丹明B樣品及標(biāo)準(zhǔn)溶液進行對比,結(jié)果如圖6所示。由圖6可以看到,所有d曲線在200～1800 cm-1區(qū)間內(nèi),空白樣品基本為無特征信號的背景曲線,說明這幾種果汁、酒品中不含羅丹明B;而加標(biāo)0.5 mg/kg濃度后的譜圖上可以清楚看到在620、1355、1510、1645 cm-1附近出現(xiàn)了羅丹明B的尖銳特征峰,說明檢測到RB的存在,而且隨著加標(biāo)溶液質(zhì)量濃度的增大,強度也隨著增強。綜上可知,對于含量高于0.5 mg/kg羅丹明B的樣品,可以根據(jù)拉曼譜圖中特征譜峰位置和相對強度確定樣品中是否含有羅丹明B成分。

通過上述各種食品中RB的檢測實驗可以看出,本方法適用于不同品種、不同成分的樣品檢測,結(jié)果準(zhǔn)確可靠、方法可行,最低檢測濃度可以達(dá)到0.5 mg/kg。

2.5 回收率實驗

以加標(biāo)辣椒粉樣品中羅丹明B的測定為例,在100、200、300 μg/L 3個添加水平下,采用內(nèi)標(biāo)法進行定量,以被測物的特征峰為內(nèi)標(biāo)信號,即以羅丹明B在1355 cm-1的特征峰進行歸一化計算,添加平均回收率分別為82.4%、87.0%和81.1%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD分別為2.1%、3.0%和2.2%。由此可見,本方法的準(zhǔn)確度良好,滿足樣品快速分析的要求。

3 結(jié)論

本實驗基于納米金溶膠表面增強拉曼光譜技術(shù),利用自主研發(fā)的拉曼前處理儀和便攜式拉曼檢測儀實現(xiàn)了對辣椒及其制品,以及其他食品如果汁、葡萄酒中羅丹明B的現(xiàn)場快速檢測。樣品的分析時間由常規(guī)的40～50 min縮短到約10 min,同時達(dá)到0.5 mg/kg的最低檢出濃度,以RB在1355 cm-1處的特征峰為內(nèi)標(biāo)信號進行歸一化計算,在100、200、300 μg·L-1三個添加水平下,得到其平均回收率在81.1%～87.0%之間,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD在2.1%～3.0%范圍內(nèi)。本檢測方法幾乎涵蓋了行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《進出口食品中羅丹明B的檢測方法》中主要檢測對象,而且樣品前處理簡單,耗時少,檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠,且儀器設(shè)備便攜、易操作,可用于食品中羅丹明B的現(xiàn)場篩查或?qū)嶒炇翌A(yù)檢,有望彌補國內(nèi)現(xiàn)有食品行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中關(guān)于羅丹明B的檢測空白。

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