響應面法優(yōu)化青錢柳速溶茶的酶解工藝條件

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(1.右江民族醫(yī)學院基礎醫(yī)學院,廣西百色 533000; 2.廣西高校右江流域地道中藥材(民族醫(yī)藥)研究重點實驗室,廣西百色 533000； 3.右江民族醫(yī)學院藥學院,廣西百色 533000)

青錢柳(Cyclocaryapaliurus(Batal.)Iljinskaja)又名青錢李、山麻柳、一串錢、甜茶樹、搖錢樹等,為胡桃科植物,是國家重點保護的瀕危植物之一[1],屬三類保護植物。其主要成分為三萜皂苷、黃酮、甾體、有機酸等,具有降血糖、降血脂、降血壓、抗腫瘤、抗氧化、防衰老等藥理活性[2],在防治糖尿病方面的功效尤為突出,其降糖的主要活性成分為黃酮類和多糖類[3]。

民間將青錢柳用于治療或制成茶飲料時常用熱水煮的方式,用時較長且不方便,而速溶茶可以解決這個問題。速溶茶是在保證有效成分的基礎上,將其通過軋碎處理、浸提、凈化(過濾)、轉溶、濃縮、干燥等工藝過程,加工成一種易溶入水而無茶渣的顆粒狀、粉狀或小片狀的新型飲料。速溶茶不僅可以節(jié)省人類準備茶的時間和精力,還能保存原有味道[4]。本研究組曾用微波-超聲波聯(lián)用和乙醇來提取青錢柳總黃酮[5],其得率較高,但用的是乙醇,雖然用醇提取出來的有效成分較多,但醇為有機溶劑,會使有效成分的結構發(fā)生改變或者丟失,從而使該中藥制劑的某種療效發(fā)生改變。水煮的中草藥,其有效成分出來的很少,而生物酶的使用能夠提高有效成分的溶出。因此,為了飲用方便和提高治療效果,并結合生物酶的優(yōu)點,本研究以青錢柳降糖活性成分黃酮和多糖含量及浸膏得率為指標,采用綜合評分法,通過響應面實驗優(yōu)化青錢柳速溶茶的酶解工藝,旨在為下一步開發(fā)青錢柳提供理論依據(jù)和科學參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

青錢柳枝葉 2015年7月采于廣西隆林,并經(jīng)右江民族醫(yī)學院生物教研室黃元河老師鑒定,干燥粉碎后備用;蘆丁標準品 由中國藥品生物制品檢定所提供,批號為100080-200707;葡萄糖標準品 J&K CHEMICAL LTD;三氯化鋁、甲醇、乙醇、無水乙醇、丙酮、乙醚、苯酚、濃硫酸 均為分析純;纖維素酶(50 U/mg)、果膠酶(1000 U/mg)、中性蛋白酶(100 U/mg) 均為上海源葉生物科技有限公司生產(chǎn)。

DF-15型臺式連續(xù)投料粉碎機 溫嶺市林大機械有限公司;FA1104型電子天平 上海舜宇恒平科技儀器有限公司;TU-1800型紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;HHS21-4電熱式恒溫水浴鍋儀器 江蘇金壇宏凱儀器廠;金壇80-2電動離心機 江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠;KQ5200E超聲波儀器 昆山市超聲儀器有限公司;1010-2型電熱鼓風干燥箱 上海實驗儀器廠郵箱公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 青錢柳葉速溶茶生產(chǎn)工藝 青錢柳葉→粉碎過篩→酶解→抽濾→滅酶→濾渣再次酶解→離心過濾→滅酶→合并濾液,真空濃縮→噴霧干燥→青錢柳速溶茶。

青錢柳葉粉碎過40目篩。稱取青錢柳粉末1.0 g,按照液料比加入一定濃度的酶溶液,于超聲波(200 W)中以一定溫度超聲酶解一定時間,過濾,濾液于90 ℃水浴1 h滅酶,重復兩次,合并兩次濾液,真空濃縮(0.1 MPa、55 ℃)和噴霧干燥(熱風溫度180 ℃,熱風流量28.60 m3/h,入料流量1060 mL/h)后得到青錢柳速溶茶。

1.2.2 黃酮含量測定 以蘆丁為標準品,配制不同濃度梯度,采用三氯化鋁顯色法[5],運用分光光度計于409 nm處測吸光度,以吸光度A1與濃度C1進行直線回歸,得回歸方程為A1=22.737C1+0.0032,r=0.9998。將合并后的濾液用蒸餾水定容至25 mL,取一定量溶液按照蘆丁標準品的方法測定并計算黃酮含量。其計算公式為:黃酮含量(mg/g)=黃酮質量(mg)/干品質量(g)。

1.2.3 多糖含量測定 以葡萄糖為標準品,配制不同濃度梯度,采用苯酚-硫酸法測定[6],運用分光光度計于490 nm處測吸光度,以吸光度A2與濃度C2進行直線回歸,得回歸方程為A2=20.82C2-0.0836,r=0.9999。濃度在0.01～0.05 (mg/mL)之間呈現(xiàn)良好的線性關系。取定容后的溶液10 mL,加4倍量的95%乙醇,置低溫(4 ℃)靜置過夜冷凍后,在3000 r/min下離心15 min,收集沉淀,沉淀用無水乙醇、丙酮、乙醚依次洗滌兩次,真空干燥至恒重,得粗多糖。粗多糖用水定容至50 mL,取一定量溶液按照葡萄糖標準品的方法進行青錢柳多糖含量的計算。其計算公式為:多糖含量(mg/g)=多糖質量(mg)/干品質量(g)。

1.2.4 浸膏得率的測定 量取定容后的溶液10 mL,水浴蒸干后置烘箱105 ℃干燥3 h,取出，干燥器內(nèi)冷卻30 min,迅速稱定質量。其計算公式為:浸膏得率(%)=浸膏質量(mg)/干品質量(g)×100。

1.2.5 酶解工藝優(yōu)化 以青錢柳活性成分和浸膏得率為指標,進行綜合評分[7-8],考慮到青錢柳的活性成分主要為黃酮和多糖,其二者權重系數(shù)均為0.45,而浸膏得率的權重系數(shù)則為0.1,評分時以各指標在響應面實驗時的最大值為參照將數(shù)據(jù)進行歸一化,各項的值分別乘以不同權重系數(shù)再相加即為綜合評分Y=0.45X1×100/15.01+0.45X2×100/11.73+0.1X3×100/12.74。根據(jù)單因素實驗結果:0.75%纖維素酶、酶解時間30 min、酶解溫度50 ℃、液料比20∶1 (mL/g),酶解2次,以酶濃度(A)、浸提溫度(B)、提取時間(C)、液料比(D)為因素作為響應面分析因素水平見表1,以綜合評分值(Y)為響應變量,進行響應面實驗[9-10]。

表1 響應面分析因素水平Table 1 The factor levels of response surface analysis

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert 10軟件進行響應面分析。

2 結果與分析

2.1 響應面實驗設計及結果

在單因素實驗結果的基礎上,確定因素為酶濃度(A)、浸提溫度(B)、提取時間(C)、液料比(D)設計響應面實驗,以黃酮含量、多糖含量、浸膏得率計算綜合評分。根據(jù)Box-Behnken的中心組合實驗設計原理,以綜合評分Y為考察指標,采用Design-Expert軟件設計四因素三水平29個實驗點的響應面分析,設計方案及綜合得分的響應值見表2。

表2 Box-Behnken實驗設計及結果Table 2 Test design and result of Box-Behnken experiment

2.2 模型擬合及顯著性檢驗

通過 Design-Expert10.0軟件對響應值與各因素編碼值進行回歸擬合,得到回歸方程如下:Y=96.82+2.84A-3.78B-3.55C+7.61D-2.11AB-1.94AC+1.75AD+1.71BC-5.88BD+5.10CD-3.51A2-13.86B2-13.99C2-13.57D2。并對該響應面的二次回歸方程進行方差分析結果見表3。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis for regression equation

注：* 差異顯著(p<0.05);**差異極顯著(p<0.01)。

2.3 因素交互作用

交互項的響應面分析見圖1。從圖1a、b、c可以看出,綜合評分都隨著酶濃度的增加而增大。圖1a中,隨著酶解溫度的變化(45～55 ℃),青錢柳速溶茶的綜合評分先增大后減小,約在49.4 ℃達到最大值。圖1b中,隨著酶解時間的變化(20～40 min),青錢柳速溶茶的綜合評分先增大后減小,約在28.9 min達到最大值。等高線表明酶解時間和酶濃度二者交互作用對青錢柳的綜合得分影響不顯著(p>0.05)。圖1c中,隨著液料比的變化(15∶1～25∶1 mL/g),青錢柳速溶茶的綜合評分先增大后減小,約在21.2∶1 (mL/g)達到最大值。等高線表明液料比和酶濃度二者交互作用對青錢柳的綜合得分影響不顯著(p>0.05)。從圖1d可以看出,隨著酶解溫度的變化(45～55 ℃),青錢柳速溶茶的綜合評分先增大后減小,約在47.8 ℃達到最大值。隨著酶解時間的變化(20～40 min),青錢柳速溶茶的綜合評分先增大后減小,約在28 min達到最大值。等高線表明酶解溫度和酶解時間二者交互作用對青錢柳的綜合得分影響不顯著(p>0.05)。從圖1e可以看出,隨著酶解溫度和液料比的變化,青錢柳速溶茶的綜合評分先增大后減小,約在46.8 ℃、22.1∶1 (mL/g)達到最大值。等高線表明酶解溫度和酶解時間二者交互作用對青錢柳速溶茶的綜合得分影響極顯著(p<0.01)。從圖1f可以看出,隨著酶解時間和液料比的變化,青錢柳的綜合評分先增大后減小,約在25.6 min、20.9∶1 (mL/g)達到最大值。等高線表明酶解溫度和酶解時間二者交互作用對青錢柳的綜合得分影響極顯著(p<0.01)。

圖1 各因素及其交互作用對綜合評分影響的響應面曲面圖Fig.1 Response surface plot of synthesis grade analysis effect of factors and their interactions

2.4 驗證實驗

應用Design-Expert10軟件對回歸方程進行分

析,得到的最優(yōu)響應結果為:酶濃度0.841%、酶解溫度48.672 ℃、酶解時間28.794 min、液料比21.773∶1 (mL/g),綜合評分為99.749±0.711。根據(jù)實際情況優(yōu)化為:酶濃度0.84%、酶解溫度49 ℃、酶解時間29 min、液料比22∶1 (mL/g)條件下進行3次平行實驗,測得黃酮和多糖含量的平均值分別為15.14、11.88 mg/g,浸膏得率為23.03%,綜合評分為99.99,與預測值相差0.241,說明該優(yōu)化條件結果較為可靠,具有一定的實用價值。所得浸膏呈棕黃色,在此條件下進行噴霧干燥生產(chǎn)出來的產(chǎn)品顆粒細膩,無結塊,色澤呈鵝黃色,氣香味濃,口感適中,溶液均勻無沉淀。

3 結論

青錢柳速溶茶的酶解最佳工藝條件為:纖維素酶濃度為0.84%、酶解溫度49 ℃、酶解時間29 min、液料比為22∶1 (mL/g),所得黃酮和多糖含量分別為15.14、11.88 mg/g,浸膏得率為23.03%,綜合評分為99.99,與模型的預測值99.75接近。

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