杏鮑菇重組漆酶對不同酚類污染物的降解研究

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(南京師范大學泰州學院,江蘇泰州 225300)

工業(yè)水體污染是當今社會所面臨的難題之一,酚類化合物是工業(yè)廢水中常見的一類單環(huán)芳香烴污染物,其中苯酚、氯酚、壬基酚的污染更為突出,是必須嚴格控制的污染物[1]。壬基酚(Nonylphenol,NP)具有毒性、高吸附性、難降解性、生物累積性和雌激素活性,是一種典型的內分泌干擾物(endocrine disrupting chemical,EDCs),已被聯(lián)合國環(huán)境保護署列入27種優(yōu)先控制的持久性有毒污染物(persistent toxic substances,PTS)[2-4],在水體、土壤、食品中都能檢測到,我國某河流中壬基酚最高檢出濃度為8 μg·L-1[5-7]。2,4-二氯酚(2,4-Dichlorophenol,2,4-DCP)是一種具有強生物毒性、難降解的有機污染物[8-10],具有雌性激素活性的物質,能干擾生物體正常的激素分泌,從而影響生殖功能,故屬于環(huán)境荷爾蒙物質及優(yōu)先污染控制物質[11-13]。對苯二酚(Hydroquinone,HQ)是重要的化工中間體[14],1998年,國家環(huán)?？偩值葐挝话褜Ρ蕉恿腥雵椅ｋU廢物名錄[15]。大部分酚類易溶于水、結構穩(wěn)定并且難分解和轉化,使其在自然界中不斷積累,給自然環(huán)境造成嚴重危害。

目前對酚類廢水的處理主要有物理法、化學法和生物法。其中,生物法無二次污染,在治理酚類污染物方面的作用日益突出。漆酶(laccase)是一種含銅多酚氧化酶,具有較強的氧化還原能力,可以催化降解多種酚類及其衍生物[16-19],因此其在環(huán)境治理方面具有廣闊的應用前景。目前利用漆酶對酚類物質進行降解被廣泛報道,陳輝[20]用漆酶降解2,4-二氯酚,其降解率10 h內達到94%;李旭春[21]利用礦質鹽培養(yǎng)基溶液(MSM)并以NP為唯一碳源分離得到一株NP高效降解菌NP-1,用該菌種對NP進行降解,培養(yǎng)10 d的降解率是65%,并且10 d以后基本不再降解;馬燕燕[22]采用梯度稀釋涂布法從李村河口底泥樣品中分離出四株真菌,通過實驗發(fā)現(xiàn)W-1,W-2對壬基酚的降解效果好,W-1和W-2培養(yǎng)28 d對壬基酚的降解率能達到95%。但是這些研究主要集中在真菌發(fā)酵漆酶復合同工酶對酚類物質進行降解,不能較好的研究單一漆酶同工酶對污染物的降解能力。此外,比較單一漆酶降解不同結構酚類污染物的研究也較少。

本文以來源于杏鮑菇的重組漆酶為研究對象,對該重組漆酶進行酶學性質的研究,并比較其對兩種不同結構酚類污染物的降解,研究降解時間、酚的濃度、漆酶濃度以及pH對降解效果的影響,為實現(xiàn)酚類污染物的高效降解提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

畢赤酵母工程菌P.pastorisKM71H(PeLac) 南京師范大學泰州學院微生物實驗室保存;2,2′-連氮-雙(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS) Sigma公司;無氨基酵母氮源(YNB) Gentihold公司;甲醇 色譜純，Merck集團;壬基酚和2,4-二氯酚 分析純，國藥集團;陰離子瓊脂糖凝膠(DEAE Sepharose F.F) GE公司;YPD完全培養(yǎng)基 1%酵母提取物,2%細菌蛋白胨,2%葡萄糖,2%瓊脂;BMGY誘導培養(yǎng)基 1%酵母提取物,2%細菌蛋白胨,100 mmol/L pH6.0的磷酸二氫鉀-磷酸氫二鉀緩沖液,1.34% YNB,0.004%生物素,1%甘油。

5810型高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司;1260型液相色譜 美國安捷倫科技有限公司;HZQ-X100恒溫振蕩器 上海天呈科技有限公司;PHS-25型數字pH計 上海大普儀器;FA2204電子分析天平 上海方瑞儀器;Millipore Direct 8超純水系統(tǒng) 美國Millipore;Labscale超濾系統(tǒng) 美國Millipore公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 重組漆酶的表達 將重組漆酶畢赤酵母工程菌株P.pastorisKM71H(PeLac)接種于YPD培養(yǎng)基中,28 ℃培養(yǎng)2～3 d,待長出單菌落后,儲存于冰箱中備用。挑單菌落于BMGY培養(yǎng)基,28 ℃,180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)1～2 d,按照5%的接種量轉接至新鮮的BMGY培養(yǎng)基中,28 ℃,180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng),每隔24 h添加終濃度為0.5%的甲醇,誘導7 d后每隔24 h取樣并測定其酶活。

1.2.2 重組漆酶酶活測定 以ABTS為底物,3 mL反應體系中含有1 mmol/L ABTS底物1 mL,50 mmol/L pH5.0檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液和酶液共計2 mL,420 nm下測定反應液3 min內的吸光值變化。一個酶活力單位定義為在當前反應條件下每分鐘氧化1 μmol ABTS所需的酶量[23]。計算重組漆酶酶活(EA)的公式如下:

式中:ΔA:吸光度的增量;Δt:反應時間的變化量;V1:總反應體積;V2:酶液的體積;ε:消光系數(εABTS=3.6×104L·mol-1·cm-1);N:酶液稀釋倍數。

1.2.3 重組漆酶的純化 每升漆酶粗酶液加入559.0 g的硫酸銨固體,其飽和度為85%,在4 ℃的冰箱靜置過夜,12000 r/min離心20 min,去上清,沉淀用20 mmol/L pH6.0磷酸鹽緩沖液溶解,超濾脫鹽濃縮。將濃縮后的重組漆酶酶液用DEAE Sepharose F. F進行純化,純化條件:上樣緩沖液選用20 mmol/L pH6.0磷酸鹽緩沖液;洗脫緩沖液選用含有1 mol/L氯化鈉的20 mmol/L pH6.0磷酸鹽緩沖液;洗脫方式為用0～1 mol/L的氯化鈉進行線性梯度洗脫;流速1 mL/min;在280 nm下進行吸光值檢測,收集具有酶活性的漆酶酶液,脫鹽濃縮并用50 mmol/L pH5.0檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液進行置換,經過純化濃縮后的漆酶的活性為10.2 U/mL。

1.2.4 重組漆酶的酶學性質測定

1.2.4.1 重組漆酶最適反應溫度 3 mL反應體系中含有1 mmol/L ABTS底物l mL,50 mmol/L pH5.0檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液和酶液共計2 mL,將重組漆酶于20、30、40、50、60、70、80 ℃的條件下測定酶活力,以最高酶活力為100%,計算其它溫度下的相對酶活力。

1.2.4.2 重組漆酶最適反應pH 3 mL反應體系中含有1 mmol/L ABTS底物l mL,重組漆酶于pH2.0、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0下測定酶活力,以最高酶活力為相對酶活100%,計算其它pH下的相對酶活力。

1.2.4.3 重組漆酶熱穩(wěn)定性 以ABTS作為重組漆酶酶活測定的底物,將重組漆酶于30、40、50、60 ℃條件下分別保溫10、20、30 min、1、1.5、2、4、8、12 h取樣,以不經過保溫處理測定的重組漆酶酶活為100%,檢測各個條件下的酶活力并計算相對酶活力。

1.2.4.4 重組漆酶pH穩(wěn)定性 以ABTS作為重組漆酶酶活測定的底物,研究重組漆酶在pH2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0條件下,30 ℃保溫24 h的穩(wěn)定性,以不經過任何處理測定的漆酶活力為100%,計算其它條件下的相對酶活。

1.2.5 重組漆酶對酚類化合物的降解

1.2.5.1 時間對重組漆酶降解酚類化合物的影響 分別將壬基酚和2,4-二氯酚置于pH4.0的50 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液中,反應體系中酚類物質的終濃度為10 mg/L,重組漆酶的濃度為1 U/mL,于30 ℃水浴恒溫振蕩,在4、8、12、16、20、24 h取樣,利用HPLC測定兩種酚類的濃度并計算兩種酚的降解率。

1.2.5.2 酚類物質的濃度對重組漆酶降解酚類化合物的影響 分別將壬基酚和2,4-二氯酚置于pH4.0的50 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液中,反應體系中酚類物質的終濃度分別為2.5、5、10、15、20 mg/L,重組漆酶的濃度為1 U/mL,于30 ℃水浴恒溫振蕩,在16 h取樣,利用HPLC測定兩種酚類的濃度并計算兩種酚的降解率。

1.2.5.3 重組漆酶濃度對酚類化合物降解的影響 分別將壬基酚和2,4-二氯酚置于pH4.0的50 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液中,反應體系中酚類物質的終濃度均為10 mg/L,重組漆酶的濃度均為0.25、0.5、0.75、1、1.25 U/mL,于30 ℃水浴恒溫振蕩,在16 h取樣,利用HPLC測定兩種酚類的濃度并計算兩種酚的降解率。

1.2.5.4 pH對重組漆酶降解不同酚類化合物的影響 分別將壬基酚和2,4-二氯酚置于pH3.0、3.5、4.0、4.5、5.0的50 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液中,反應體系中酚類物質的終濃度均為10 mg/L,重組漆酶的濃度均為1 U/mL,于30 ℃水浴恒溫振蕩,在16 h取樣,利用HPLC測定兩種酚類的濃度并計算兩種酚的降解率。

1.2.5.5 兩種酚的降解效果驗證實驗 在壬基酚濃度為10 mg/L,pH3.5,酶濃度為1 U/mL的條件下,于30 ℃,恒溫振蕩16 h測定壬基酚的濃度并計算其降解率;在2,4-二氯酚濃度為5 mg/L,pH4.0,酶濃度為1.25 U/mL的條件下,于30 ℃,恒溫振蕩16 h測定2,4-二氯酚的濃度并計算其降解率。

1.2.6 酚類化合物的含量測定及計算 酶解樣本經乙酸乙酯(1∶1)萃取3次后,用0.22 μm有機色譜濾膜過濾,采用液相色譜儀(色譜柱:Agilent HC-C18,4.6 mm×150 mm,5μm)測定壬基酚、2,4-二氯酚含量,流速為1 mL/min,進樣量為20 μL。壬基酚HPLC條件:柱溫25 ℃,流動相為甲醇∶水=90∶10,檢測器波長為225 nm。2,4-二氯酚HPLC條件:柱溫30 ℃,流動相為甲醇∶水=40∶60,檢測器波長為240 nm。

降解率(%)=(反應前酚類濃度-反應后酚類濃度)÷反應前酚類濃度×100。

1.3 數據處理

實驗中每個處理重復三次,采用SPASS 17.0進行統(tǒng)計分析,不同處理間差異顯著性用單因素方差分析進行比較(p<0.05),并采用Origin 8.0作圖。

2 結果與討論

2.1 重組漆酶的酶學性質

2.1.1 重組漆酶的最適反應溫度和pH 由圖1可知,在20～60 ℃范圍內,隨著溫度的增加,其相對酶活越來越高,不同溫度下各組之間的相對酶活差異顯著(p<0.05)。當溫度高于60 ℃,隨著溫度的升高,相對酶活迅速下降,60、70、80 ℃時,相對酶活分別為100%、91.0%和61.5%,各組之間差異顯著(p<0.05),因此該重組漆酶的最適反應溫度是60 ℃。由圖2可知,重組漆酶在pH2.5和3.0酶活最高,在這兩個pH條件下酶活差異不顯著(p>0.05),在pH3.0～6.0范圍內,隨著pH的升高,相對酶活呈下降趨勢,相對酶活差異顯著(p<0.05),因此其最適反應的pH是2.5～3.0。

圖1 溫度對重組漆酶活性的影響Fig.1 The effect of temperature on activity of recombinant laccase注:不同字母表示差異性顯著(p<0.05),圖2、圖4～圖8同。

圖2 pH對重組漆酶活性的影響Fig.2 The effect of pH on activity of recombinant laccase

2.1.2 重組漆酶的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性 由圖3可知,隨著溫度的升高重組漆酶的穩(wěn)定性逐漸下降,重組漆酶在30、40、50 ℃的條件下處理12 h,當溫度超過40 ℃,重組漆酶熱穩(wěn)定性顯著下降,60 ℃下處理4 h時酶活力幾乎全部喪失,因此該重組漆酶在30 ℃下具有較好的溫度穩(wěn)定性。由圖4可知,重組漆酶在pH2.0的緩沖溶液中處理24 h,其相對酶活力只有6.2%,在pH4.0～8.0范圍內隨著pH的增加,相對酶活逐漸增加,在該范圍內,各組之間差異顯著(p<0.05),之后隨著pH繼續(xù)增加,酶的穩(wěn)定性逐漸上升,當在pH8.0、9.0、10.0的條件下處理24 h,其相對酶活都能維持在80%以上。

圖3 重組漆酶熱穩(wěn)定性Fig.3 The thermal stability of recombinant laccase

圖4 重組漆酶pH穩(wěn)定性Fig.4 The pH stability of recombinant laccase

2.2 重組漆酶對酚類化合物的降解

2.2.1 時間對重組漆酶降解酚類化合物的影響 由圖5可知,在4～16 h范圍內,隨著反應時間的延長,漆酶對不同酚類的降解率逐漸增加,反應時間為4～16 h時,降解率變化顯著(p<0.05);在反應達到16 h后,重組漆酶對壬基酚和2,4-二氯酚的降解率基本達到平衡,反應時間為16～24 h時降解率變化不顯著(p>0.05),16 h時壬基酚和2,4-二氯酚的降解率分別為94.2%和89.3%。

圖5 時間對重組漆酶降解酚類化合物的影響Fig.5 Effect of reaction time on degradation of phenols by recombinant laccase

2.2.2 酚類濃度對漆酶降解酚類化合物的影響 由圖6可知,壬基酚濃度為2.5、5、10 mg/L時,各組之間的降解率差異不顯著(p<0.05),當壬基酚濃度為15、20 mg/L時,降解率分別為89.4%和85.0%。當2,4-二氯酚濃度為2.5和5 mg/L時,其降解率分別為93.5%和92.5%,當2,4-二氯酚濃度為5～20 mg/L時,隨著2,4-二氯酚濃度的增加,降解率顯著下降(p>0.05)。

圖6 酚類濃度對重組漆酶降解酚類化合物的影響Fig.6 Effect of recombinant laccase on degradation of different concentrations of phenols

2.2.3 重組漆酶濃度對酚類化合物降解的影響 由圖7可知,不同的酶濃度對2,4-二氯酚降解的影響顯著,當酶濃度為0.25～1.25 U/mL時,降解率顯著升高(p<0.05)。酶濃度對壬基酚降解率的影響較小,在所選擇的濃度范圍內,壬基酚的降解率均在90%以上。當酶濃度為1.25 U/mL時,重組漆酶對壬基酚、2,4-二氯酚降解率分別達到95.1%和89.3%。

圖7 重組漆酶濃度對酚類物質降解的影響Fig.7 Effect of recombinant laccase dosage on degradation of phenols

2.2.4 pH對重組漆酶降解不同酚類化合物的影響 由圖8可知,重組漆酶對不同酚類降解的最適pH有所不同,重組漆酶對壬基酚的降解率隨著pH的升高而下降,當pH在3和3.5時,幾乎檢測不到壬基酚,此時的降解率為100%。2,4-二氯酚的降解率隨著pH的升高呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢,不同pH下的降解率差異顯著(p<0.05),當pH為4.0時,降解率最高達到87.4%。pH對兩種酚類降解效果影響明顯,因為pH的改變會影響蛋白質的解離情況以及底物的離子平衡情況,對于不同的底物其最適作用的pH不同,因此漆酶降解兩種酚類化合物時最適合的pH不同,除此之外,漆酶的催化效果可能與酚類物質的取代基的種類、數目、位置有關[24]。

圖8 pH對重組漆酶降解不同酚類的影響Fig.8 Effect of pH on degradation of phenols by recombinant laccase

2.2.5 壬基酚和2,4-二氯酚降解效果驗證實驗 在確定的最佳條件下進行壬基酚和2,4-二氯酚的降解效果驗證實驗,重復三次,壬基酚的降解率為100%,壬基酚的降解率為95.1%±0.92%。用漆酶對酚類物質進行降解,具有降解率高,降解時間短的優(yōu)點。王穎[10]用殼聚糖固定化漆酶對2,4-二氯酚進行降解,降解率是54.8%,潘艷[25]在漆酶酶液中添加HBT,對壬基酚的降解率為90%左右。目前所用的漆酶大多是漆酶的復合酶,用單一漆酶對酚類進行降解的報道較少。本實驗用畢赤酵母工程菌P.pastorisKM71H(PeLac)所分泌的單一重組漆酶對兩種酚類進行降解,該重組漆酶16 h對壬基酚的降解率能達到100%,對2,4-二氯酚的降解率為95.1%。重組漆酶對不同結構的酚類化合物降解效果有所不同,可能與酶和底物的親和力有關。

3 結論

本實驗研究了重組漆酶的酶學特性及其對兩種不同結構的酚類化合物的降解,結果表明:該重組漆酶的最適反應溫度是60 ℃,在30 ℃時具有較好的穩(wěn)定性;最適反應pH是2.5～3.0,在pH9.0～10.0具有較好的pH穩(wěn)定性。重組漆酶對兩種不同結構的酚類化合物都具有較好的降解效果,當降解時間為16 h,重組漆酶濃度1 U/mL,pH3.5時,10 mg/L的壬基酚的降解率為100%;當降解時間為16 h,漆酶濃度是1.25 U/mL,pH4.0時,5 mg/L的2,4-二氯酚的降解率為95.1%。本實驗研究的重組漆酶具有較強的降解不同結構酚類的能力,為處理含酚廢水提供了方法以及思路。

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