超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測定減肥保健食品中10種減肥類化合物的含量

熊 岑，林葉婧，李衛(wèi)崗，張 悅，李 意，柏文良

（1．深圳市計量質(zhì)量檢測研究院，深圳518000； 2．廣東石油化工學院 環(huán)境與生物工程學院，茂名525000；3．珠海出入境檢驗檢疫局 技術(shù)中心，珠海519000）

肥胖會引起高血壓、心臟病等多種疾病，民眾對健康和身材控制的要求也越來越高。順應(yīng)市場需求，很多聲稱有減肥功效的保健品出現(xiàn)在市場上，但其產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊。各地執(zhí)法部門曾以減肥為賣點的保健品中檢出如酚酞、麻黃堿、咖啡因等非法藥物添加。媒體也多次進行曝光，在保健中添加非法藥物這一行為甚至演變成行業(yè)潛規(guī)則，因此需要對保健品進行針對性排查和監(jiān)管［1－2］。

國家食品藥品監(jiān)督管理局于2012年3月發(fā)布《關(guān)于發(fā)布保健食品中可能非法添加的物質(zhì)名單（第一批）的通知》中減肥類保健食品非法添加的名單有西布曲明、麻黃堿和芬氟拉明。而氫氯噻嗪、酚酞、茶堿、咖啡因、布美他尼、吲達帕胺、克倫特羅、苯丙酸諾龍等8種物質(zhì)尚未納入減肥藥保健品非法添加名單中，且無相關(guān)公告或標準規(guī)定。到目前為止，國家發(fā)布的針對減肥類保健食品非法添加物質(zhì)的檢測方法，僅針對西布曲明、芬氟拉明及麻黃堿等3種物質(zhì)，其他可能添加入減肥類產(chǎn)品的物質(zhì)尚未發(fā)布。保健食品中非法添加藥物測定方法主要有高效液相色譜法［3］、氣相色譜－質(zhì)譜法、離子遷移法［4］、高分辨質(zhì)譜法［5－6］和液相色譜－質(zhì)譜法等［7－9］。其中，大部分集中在常檢出的幾種非法添加成分，如酚酞、西布曲明的檢測方法研究［10－12］，和基于液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法的高通量篩查和檢測上［13－14］。

1 試驗部分

1．1 儀器與試劑

TSQ Vantage AM 型液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀；SK2510LHC型超聲波萃取儀；CPA224S型電子分析天平。

混合標準溶液：稱取各標準品適量，用甲醇溶解并稀釋至質(zhì)量濃度均為10．00mg·L－1。此溶液于4℃下可保存6個月。用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度均為200，100，50．0，20．0，10．0，5．00，1．00，0．50μg·L－1的混合標準溶液系列，使用前現(xiàn)用現(xiàn)配。

鹽酸芬氟拉明：100．0mg·L－1，介質(zhì)為乙腈。

氫氯噻嗪（純度99．5%）、西布曲明鹽酸鹽（純度98%）、克倫特羅鹽酸鹽（純度98．5%）、酚酞（純度99．7%）、苯丙酸諾龍（純度99．35%）、布美他尼（純度95%）、茶堿（純度99．89%）、吲達帕胺（純度97%）、咖啡因（純度99．5%）標準品；甲醇、甲酸為色譜純，其余試劑均為分析純；試驗用水為超純水。

市售36批次減肥類樣品包括減肥茶、減肥膠囊。

1．2 儀器工作條件

1）色譜條件 Thermo Hypersil Gold色譜柱（100mm×2．1mm，1．9μm），柱溫25℃；進樣體積5μL；流量0．25mL·min－1；流動相A為0．1%（體積分數(shù)，下同）甲酸溶液，B為乙腈。梯度洗脫程序：0～3min時，B為15%；3～5min時，B由15%升至60%，保持7min；12～17min時，B由60%升至100%；17～20min時，B由100%降至15%。

2）質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI）；正負離子切換模式，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式；傳輸管溫度350℃；霧化溫度400℃；以氮氣為鞘氣及輔助氣，采用恒壓模式，鞘氣壓力206．8kPa，輔助氣壓力34．5kPa；噴霧電壓3 000V（＋）、2 500V（－）。各化合物的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

楊力生家門口是一條東西街，他本想往街西頭走，因見離他不遠的地方有幾個鄉(xiāng)親在街北邊閑聊，他便轉(zhuǎn)身向東面奔去。不承想，他們兩口子的吵鬧聲早被眾鄉(xiāng)親聽了個一清二楚，大家看著他匆匆離去的背影，有幾個和他交往比較不錯的鄰居便異口同聲地喊起來：

表1 質(zhì)譜參數(shù)Tab．1 MS parameters

1．3 試驗方法

樣品研細或粉碎，稱取樣品0．500 0g于50mL容量瓶中，加甲醇25mL，超聲提取20min，冷卻至室溫后加甲醇定容?；靹蚝?，用0．22μm濾膜過濾，按儀器工作條件進行測定。

2 結(jié)果與討論

2．1 色譜行為

混合標準溶液中10種化合物的提取離子對色譜圖見圖1。

圖1 10種化合物的提取離子對色譜圖Fig．1 Extracted ion chromatograms of 10compounds

2．2 提取時間的選擇

試驗分別考察了10，20，40min等不同時間對超聲提取效果的影響。空白基質(zhì)加標回收結(jié)果表明：20min即可完成提取。試驗選擇超聲提取時間為20min。

2．3 流動相的選擇

試驗采用0．1%甲酸溶液－甲醇體系為流動相時，等度洗脫或梯度洗脫后，西布曲明、酚酞、芬氟拉明和苯丙酸諾龍的出峰效果不理想；采用0．1%甲酸溶液－乙腈體系為流動相并梯度洗脫后，各物質(zhì)出峰效果良好，但茶堿和氫氯噻嗪會出現(xiàn)裂峰。綜合考慮，試驗選擇0．1%甲酸溶液－乙腈體系進行梯度洗脫。

2．4 質(zhì)譜條件的選擇

將各標準溶液用甲醇稀釋至1．00mg·L－1，對各化合物進行質(zhì)譜條件優(yōu)化。使用直接進樣方式，先采用一級全掃模式得到準分子離子，再使用二級掃描模式獲得2～3對子離子，對儀器毛細管電壓、碰撞電壓、噴針電壓、射頻透鏡電壓等參數(shù)進行優(yōu)化。選擇豐度最高的子離子作為定量離子，其余離子作為定性離子。優(yōu)化的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

實際樣品中目標化合物的定性是結(jié)合保留時間，化合物一級和二級離子等進行綜合評價的，幾個特征子離子的豐度比和目標化合物標準品豐度比相比較，最大允許偏差不得超過歐盟2002／657／EC指令［15］中規(guī)定的范圍。

2．5 標準曲線與檢出限

按儀器工作條件對各化合物標準溶液系列進行測定，以化合物的質(zhì)量濃度為橫坐標，對應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標繪制標準曲線。各化合物的線性范圍、線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表2。

以3倍信噪比時化合物的質(zhì)量分數(shù)為方法的檢出限（3S／N），以10倍信噪比時化合物的質(zhì)量分數(shù)為方法的測定下限（10S／N），結(jié)果見表2。

表2 線性參數(shù)、檢出限和測定下限Tab．2 Linearity parameters，detection limits and lower limits of determination

2．6 精密度和回收試驗

使用空白樣品（膠囊和茶葉類各1種），配制成基質(zhì)加標溶液，按試驗方法平行測定5次，計算其加標回收率和相對標準偏差（RSD），結(jié)果見表3。

表3 精密度和回收試驗結(jié)果（n＝5）Tab．3 Results of tests for precision and recovery（n＝5）

由表3可知：加標回收率在72．1%～117%之間，結(jié)果較為滿意；RSD在0．70%～6．2%之間。

2．7 樣品分析

試驗共抽檢減肥類保健品36批次，包括減肥茶和減肥膠囊兩大類產(chǎn)品。對樣品中10種化合物含量進行定性定量檢測。目標物的定性檢測通過色譜圖保留時間、質(zhì)譜圖與標準物質(zhì)對比來確證，見圖2和圖3。

由圖2、圖3可知：樣品中茶堿、咖啡因和西布曲明的色譜圖、質(zhì)譜圖與對應(yīng)的標準物質(zhì)譜圖基本一致。

各化合物的定量檢測是根據(jù)定量監(jiān)測離子對的色譜峰面積，采用外標法進行定量。樣品分析結(jié)果見表4。

由表4可知：36批次保健品中，共有20批次樣品檢出目標物，其中14批次樣品檢出茶堿，質(zhì)量分數(shù)為2．54×10－4～6．27×10－3g·kg－1；17批次樣品檢出咖啡因，質(zhì)量分數(shù)為0．014 0～2．52g·kg－1；1批次樣品檢出西布曲明，質(zhì)量分數(shù)為3．85g·kg－1。抽檢樣品中均未檢出氫氯噻嗪、酚酞、布美他尼、吲達帕胺、芬氟拉明、克倫特羅、苯丙酸諾龍。

圖2 色譜圖的對比Fig．2 Comparison of chromatograms

圖3 質(zhì)譜圖的對比Fig．3 Comparison of MS spectra

表4 樣品分析結(jié)果Tab．4 Analytical results of samples g·kg－1

2．7．1 茶堿和咖啡因檢測結(jié)果分析

檢出茶堿和咖啡因樣品均屬于減肥茶樣品。減肥茶的減肥機理主要是通過增加能量消耗來達到減肥目的。其中，茶葉中的茶堿和咖啡因有利尿和興奮代謝的作用?？Х纫蛴信d奮中樞神經(jīng)作用，使睡眠較少消耗增加。抽檢的減肥茶樣品中添加有茶葉或茶葉提取物，茶葉天然含有一定量的茶堿和咖啡因。文獻報道紅茶、綠茶等常見茶葉中茶堿的質(zhì)量分數(shù)在0．19～1．27g·kg－1范圍內(nèi)，甚至更高范圍，其含量會隨品種、產(chǎn)地、采摘時節(jié)和加工工藝不同而變化［16－17］。茶葉中咖啡因質(zhì)量分數(shù)在20～200g·kg－1之間，發(fā)酵茶中咖啡因含量遠大于非發(fā)酵茶，其中非發(fā)酵茶如綠茶甚至要小于20g·kg－1［18］。抽檢的減肥茶產(chǎn)品中的檢出的茶堿和咖啡因含量較低，這是由于減肥茶成分較為復雜，茶葉也可能是主要成分，而且茶葉品種不明確。例如，25號樣品成分為荷葉提取物、西洋參提取物、茯苓提取物、澤瀉提取物、山楂提取物、茶多酚、乳糖、赤蘚糖醇、甜菊糖苷。因此，抽檢的減肥茶中檢出的茶堿和咖啡因是屬于樣品本底值，不是非法添加。

2．7．2 西布曲明檢測結(jié)果分析

36批次減肥類保健品中，只有一款左旋肉堿減肥膠囊中檢出西布曲明，是屬于非法添加違禁藥物的減肥類產(chǎn)品。西布曲明是一種中樞神經(jīng)抑制劑，具有興奮、抑食等作用。將西布曲明非法添加進入減肥類保健品中，可以通過增加能量消耗，抑制能量攝取來達到減肥目的。西布曲明一直列在各地減肥類保健食品中非法添加違禁藥物的重點監(jiān)測的名單中。

本工作采用超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定減肥類保健食品中茶堿、氫氯噻嗪、酚酞、布美他尼、吲達帕胺、咖啡因、芬氟拉明、克倫特羅、西布曲明和苯丙酸諾龍等10種化合物的含量。方法對36批次減肥茶和減肥膠囊兩類減肥類保健食品進行檢測，檢出共20批次樣品中含有茶堿、咖啡因和西布曲明等3種物質(zhì)。其中1批次檢出的西布曲明屬于非法添加的情況，其余19批次檢出的咖啡因和茶堿是屬于樣品本底值。研究結(jié)果表明，方法簡便、快速、準確，能用于減肥類保健食品中非法添加化學品的定性定量檢測。

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