DNA－Fe配合物生物聚合離子膜修飾玻碳電極的制備及其用作過(guò)氧化氫電化學(xué)傳感器的研究

南明君，顧婷婷，周 洋，賈楠楠，王 旭

（遼寧科技大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，鞍山114051）

生物聚合離子膜（BPICM）是聚合離子膜的一種，是由帶相反電荷的生物聚合離子材料通過(guò)靜電作用而形成。BPICM不僅具備聚合離子膜的制作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性強(qiáng)、選擇性高和滲透性強(qiáng)等特點(diǎn)，還具有良好的生物相容性。BPICM已被用于催化反應(yīng)膜和生物大分子識(shí)別膜等生物感應(yīng)界面的構(gòu)筑［1－6］。由于DNA具有特異的分子識(shí)別能力以及一定的導(dǎo)電性，且DNA分子是帶負(fù)電荷的聚合陰離子，可以與帶正電荷的天然聚合陽(yáng)離子材料形成DNA BPICM，本課題組已經(jīng)成功地將DNA BPICM應(yīng)用于電化學(xué)生物傳感器分子識(shí)別界面的構(gòu)筑［5－6］。由于DNA BPICM本身不具備電化學(xué)活性，利用一些電化學(xué)電子媒介體分子（鐵氰化鉀、亞甲基藍(lán)等）及具有催化活性的過(guò)渡金屬離子（Cu2＋、Ni2＋等）與DNA的特異性結(jié)合作用，可以將這些分子固定在BPICM表面，從而實(shí)現(xiàn)DNA BPICM作為電化學(xué)活性和催化活性界面的構(gòu)筑［1－2，4］。

人體內(nèi)許多生化反應(yīng)產(chǎn)物含有過(guò)氧化氫，當(dāng)過(guò)氧化氫含量過(guò)多時(shí)可以加速細(xì)胞老化，DNA損傷，誘發(fā)基因突變。同時(shí)，測(cè)定過(guò)氧化氫也是測(cè)定其他產(chǎn)生過(guò)氧化氫中間產(chǎn)物的基礎(chǔ)。目前過(guò)氧化氫主要的測(cè)定方法包括高效液相色譜法、熒光光度法和電化學(xué)法等。電化學(xué)法由于具有靈敏度高、響應(yīng)快速、成本較低的特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用在過(guò)氧化氫的檢測(cè)中［7－19］。近些年，各種納米材料修飾電極，如碳納米管、石墨烯、納米金屬及其氧化物等［7－14］被用于過(guò)氧化氫的高敏感度檢測(cè)，但納米材料的增加對(duì)人體以及環(huán)境又帶來(lái)一定的危害［7－11］。

本工作利用DNA與天然聚合陽(yáng)離子－殼聚糖形成DNA－CTS BPICM，通過(guò)形成DNA－金屬離子配合物將鐵離子固定在玻碳電極表面，形成DNAFe／CTS BPICM修飾電極，研究了該修飾電極的電活性和催化活性。在此基礎(chǔ)上，發(fā)展了一種基于生物材料的過(guò)氧化氫電化學(xué)傳感器。

1 試驗(yàn)部分

1．1 儀器與試劑

CHI 832型電化學(xué)分析儀；三電極系統(tǒng)：玻碳圓盤(pán)電極（GCE，直徑3mm）為工作電極，銀／氯化銀（飽和氯化鉀）電極為參比電極，鉑絲電極（直徑1mm）為輔助電極；ΣIGMA／HD型掃描電子顯微鏡（SEM）。

鮭魚(yú)精DNA溶液：1．00g·L－1。

三氯化鐵溶液：3．00mmol·L－1。

殼聚糖（CTS）溶液：0．50g·L－1。

磷酸緩沖溶液（PBS）：0．1mol·L－1磷酸氫二鉀溶液與磷酸二氫鉀溶液配制pH 7．0的磷酸緩沖溶液。

試劑均為分析純，試驗(yàn)用水為二次去離子水。

1．2 修飾電極的制備

玻碳電極分別用納米研磨墊以及加研磨粉的研磨墊拋光3min，成鏡面，在水中超聲除去電極表面的雜質(zhì)，再用水沖洗后置于室溫干燥。將1．00g·L－1DNA溶液與1．00mmol·L－1三氯化鐵溶液振蕩混合后，得DNA－Fe（Ⅲ）配合物（DNA－Fe）。移取DNA－Fe 20μL滴涂于經(jīng)拋光的GCE表面，然后滴加0．50g·L－1CTS溶液10μL，罩在1L燒杯下，于室溫（約20℃）下干燥22h，用水沖去表面吸附的雜質(zhì)，在4℃保存，制得 DNA－Fe／CTS修飾電極?？瞻讓?duì)比的DNA／CTS修飾電極以相同方法制備。

1．3 電化學(xué)檢測(cè)

以各修飾電極為工作電極、銀／氯化銀為參比電極及鉑電極為輔助電極。置于pH 7．0的PBS 10mL中，在試驗(yàn)前通入氮?dú)?0min，進(jìn)行循環(huán)伏安法（CV）和安培－時(shí)間曲線(xiàn)法（i－t）檢測(cè)。

1．4 掃描電子顯微鏡表征

DNA－Fe／CTS BPICM 制備過(guò)程同電極制備。掃描電子顯微鏡（SEM）分析之前，在電極表面鍍一層10nm的鉑金。用同樣的方法制備表征DNA／CTS BPICM。

2 結(jié)果與討論

2．1 DNA－Fe／CTS BPICM 的掃描電子顯微鏡表征

DNA／CTS BPICM 和 DNA－Fe／CTS BPICM的SEM圖片見(jiàn)圖1。

圖1 DNA／CTS BPICM 與DNA－Fe／CTS BPICM 的SEM 圖片F(xiàn)ig．1 SEM images of DNA／CTS BPICM and DNA－Fe／CTS BPICM

由圖1可知：DNA／CTS BPICM顯示較為光滑的表面，固定了DNA－Fe（Ⅲ）配合物之后顯示為較粗糙的顆粒狀表面。

2．2 DNA－Fe／CTS BPICM 修飾電極的電化學(xué)表征

裸 電 極 上 FeCl3、DNA－Fe／GCE、DNA－Fe／CTS／GCE的循環(huán)伏安圖見(jiàn)圖2。

圖2 Fe／GCE、DNA－Fe／GCE和DNA－Fe／CTS／GCE的循環(huán)伏安圖Fig．2 CV－grams of Fe／GCE，DNA－Fe／GCE and DNA－Fe／CTS／GCE

結(jié)果表明：在－0．4～0．5V內(nèi)，裸電極上三氯化鐵的CV掃描曲線(xiàn)出現(xiàn)了一對(duì)氧化還原峰（勢(shì)電位為－0．03V），由文獻(xiàn)［20］可知此氧化還原峰來(lái)自于Fe3＋／Fe2＋電對(duì)；當(dāng)與DNA共存時(shí)，此氧化還原峰發(fā)生負(fù)移（勢(shì)電位為－0．064V），峰電流增大，根據(jù)文獻(xiàn)［21］提出的，勢(shì)電位發(fā)生負(fù)移，表明Fe3＋與DNA形成DNA－Fe配合物；DNA－Fe／CTS／GCE循環(huán)伏安曲線(xiàn)出現(xiàn)了一對(duì)明顯的氧化還原峰（圖2、圖3），氧化還原峰電位分別為Epa＝－0．036V，Epc＝－0．095V，勢(shì)電位為－0．065 5V。

在相同條件下，裸GCE和DNA／CTS／GCE都沒(méi)有明顯的氧化還原峰，說(shuō)明DNA和CTS都沒(méi)有明顯的電化學(xué)活性，此氧化還原峰來(lái)源于DNA－Fe配合物在電極表面的氧化還原反應(yīng)，表明DNA－Fe配合物被成功地固定在電極表面，見(jiàn)圖3。

對(duì)DNA－Fe／CTS修飾電極連續(xù)掃描50圈，試驗(yàn)結(jié)果表明：其氧化還原峰電流變化不明顯，表現(xiàn)了較好的穩(wěn)定性。ΔEp＝│Epa－Epc│＝0．059V，與文獻(xiàn)［22］所給59mV相符，表明該反應(yīng)為單電子轉(zhuǎn)移，｜Ipa／Ipc｜≈1說(shuō)明為準(zhǔn)可逆電對(duì)。

試驗(yàn)也考察了掃描速率為5～500mV·s－1時(shí)對(duì)電極的氧化還原峰的影響，見(jiàn)圖4。

圖3 GCE、DNA／CTS／GCE和DNA－Fe／CTS／GCE的循環(huán)伏安圖Fig．3 CV－grams of GCE，DNA／CTS／GCE and DNA－Fe／CTS／GCE

圖4 DNA－Fe／CTS／GCE在不同掃描速率下的循環(huán)伏安圖Fig．4 CV－grams of DNA－Fe／CTS／GCE with different scanning rates

由圖4可知：在所用的掃描速率范圍內(nèi)，峰電位與掃描速率無(wú)關(guān)，峰電流隨著掃描速率的增大而增大，且峰電流與掃描速率的一次方成正比，表明該電極表面電化學(xué)反應(yīng)受電子轉(zhuǎn)移控制［23］，根據(jù)Laviron方程［24］，計(jì)算得到的 DNA－Fe配合物在電極表面的電子轉(zhuǎn)移速率為18．10s－1，大于同樣條件下Fe3＋在溶液中的電子轉(zhuǎn)移速率（11．79s－1），表明DNA－Fe在電極表面保持較好的電化學(xué)活性。

DNA－Fe／CTS／GCE在不同酸度下的循環(huán)伏安圖見(jiàn)圖5。

由圖5可知：在pH 6．0～8．0時(shí)，DNA－Fe的氧化還原電位隨著溶液pH的增加向負(fù)向移動(dòng)，表明DNA－Fe與電極表面發(fā)生的電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)有質(zhì)子參與；勢(shì)電位與pH呈線(xiàn)性關(guān)系，斜率為－73．9mV。與理論值－59mV（等電子等質(zhì)子）相當(dāng)［24］，為單質(zhì)子參與反應(yīng)。

2．3 DNA－Fe／CTS BPICM 修飾電極對(duì)過(guò)氧化氫的響應(yīng)

圖5 DNA－Fe／CTS／GCE在不同酸度下的循環(huán)伏安圖Fig．5 CV－grams of DNA－Fe／CTS／GCE at different acidities

圖6 修飾電極對(duì)過(guò)氧化氫響應(yīng)的循環(huán)伏安圖Fig．6 CV－grams showing respense to H2O2 at the modified electrode

圖6為DNA－Fe／CTS修飾電極對(duì)不同濃度過(guò)氧化氫的電化學(xué)響應(yīng)的循環(huán)伏安圖。當(dāng)溶液中加入過(guò)氧化氫后，DNA－Fe／CTS修飾電極的還原峰電流隨著過(guò)氧化氫濃度的升高而增大，同時(shí)氧化峰電流隨著過(guò)氧化氫濃度的升高而減少。這是由于過(guò)氧化氫的加入使得Fe2＋原本在電極表面完成的氧化反應(yīng)轉(zhuǎn)移至溶液中，與過(guò)氧化氫反應(yīng)，表明DNA－Fe配合物對(duì)過(guò)氧化氫具有催化活性。電極表面以及溶液中的電化學(xué)反應(yīng)如下：

在此基礎(chǔ)上，利用安培－時(shí)間曲線(xiàn)法考察了修飾電極的還原峰電流增量（ΔI）隨過(guò)氧化氫濃度變化的響應(yīng)，見(jiàn)圖7。結(jié)果表明：在－0．20V的工作電位下，隨著溶液中過(guò)氧化氫濃度的增加，DNA－Fe／CTS電極響應(yīng)電流逐漸增大，電極到達(dá)穩(wěn)態(tài)電流的響應(yīng)時(shí)間約為6s。相比之下，裸電極對(duì)過(guò)氧化氫電流較不明顯。表明修飾電極的電化學(xué)響應(yīng)主要來(lái)自于 DNA－Fe／CTS BPICM。

圖7 修飾電極對(duì)過(guò)氧化氫響應(yīng)安培－時(shí)間曲線(xiàn)Fig．7 ΔI－t curve showing response to H2O2at the modified electrode

試驗(yàn)考察了工作電位對(duì)過(guò)氧化氫響應(yīng)的影響，結(jié)果表明：電位在－0．10～－0．35V之間，隨著電位的升高，響應(yīng)電流逐漸增大；電位在－0．20～－0．25V時(shí)，響應(yīng)電流逐漸穩(wěn)定。由于在高電位下干擾物質(zhì)會(huì)產(chǎn)生干擾電流，試驗(yàn)選定工作電位為－0．20V。

2．4 DNA－Fe／CTS BPICM 修飾電極的抗干擾性能

用DNA－Fe／CTS BPICM修飾電極對(duì)可能干擾物進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明：當(dāng)葡萄糖和尿酸以高于10倍過(guò)氧化氫濃度存在時(shí)，兩者都沒(méi)有產(chǎn)生明顯的電流響應(yīng)，再添加過(guò)氧化氫后對(duì)電流響應(yīng)仍沒(méi)有影響，說(shuō)明電極對(duì)葡萄糖和尿酸具有較好的抗干擾能力。

2．5 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和檢出限

試驗(yàn)考察了DNA－Fe／CTS BPICM 修飾電極對(duì)過(guò)氧化氫響應(yīng)的電流隨其濃度的變化情況。結(jié)果表明：過(guò)氧化氫的濃度在0．01～2．0mmol·L－1范圍內(nèi)，DNA－Fe／CTS BPICM 修飾電極對(duì)過(guò)氧化氫響應(yīng)的電流與過(guò)氧化氫濃度呈線(xiàn)性關(guān)系，線(xiàn)性回歸方程為y＝53．42x＋6．985，相關(guān)系數(shù)為0．991 2。檢出限（3S／N）為3μmol·L－1，靈敏度為53．417nA／（mmol·L－1）。

2．6 穩(wěn)定性和重現(xiàn)性試驗(yàn)

DNA－Fe／CTS BPICM 修飾電極的穩(wěn)定性以及重現(xiàn)性考查結(jié)果表明，5個(gè)電極5次試驗(yàn)測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)偏差為5．6%，具有較好的重現(xiàn)性。電極在4℃下保存，經(jīng)過(guò)30d后其響應(yīng)電流比第一次檢測(cè)降低了12．5%。

2．7 過(guò)氧化氫傳感器的檢測(cè)性能對(duì)比

表1中對(duì)比了一些納米材料修飾電極對(duì)過(guò)氧化氫的檢測(cè)性能，本試驗(yàn)結(jié)果的線(xiàn)性范圍、檢出限與大多數(shù)無(wú)酶納米材料添加型的修飾電極相當(dāng)，但工作電位較低，因此可避免高電位下電活性物質(zhì)的干擾。

表1 過(guò)氧化氫傳感器的檢測(cè)性能對(duì)比Tab．1 Comparison of detection performance of H2O2sensors

本工作利用生物聚合離子膜固定DNA－Fe配合物，構(gòu)筑基于DNA－Fe／CTS BPICM 修飾電極，利用掃描電子顯微鏡、循環(huán)伏安法、安培－時(shí)間曲線(xiàn)法對(duì)聚合離子膜進(jìn)行表征。結(jié)果表明：DNA－Fe／CTS BPICM修飾電極具有良好的電化學(xué)性能，對(duì)過(guò)氧化氫具有很好的催化活性，可以用作以過(guò)氧化氫為中間產(chǎn)物的生化代謝反應(yīng)物檢測(cè)，且具有良好的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、生物相容性，有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

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