QuEChERS凈化－高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定蜂蜜中農(nóng)藥及抗生素的含量

苗瓊晨，聶 晶，吳慧珍，錢(qián)鳴蓉，孫彩霞，李祖光＊

（1．浙江工業(yè)大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，杭州310014； 2．浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，杭州310021）

蜂蜜作為人們?nèi)諠u喜愛(ài)的養(yǎng)生產(chǎn)品越來(lái)越受歡迎，但由于養(yǎng)蜂過(guò)程中，蜂農(nóng)為了防止蜜蜂患上腐臭病、白血病等細(xì)菌性疾病，會(huì)使用大量抗生素來(lái)防治，這可能會(huì)導(dǎo)致蜂蜜抗生素殘留超標(biāo)而影響蜂蜜質(zhì)量［1－3］，給食用者帶來(lái)不同程度的身體損害［4－6］；蜜蜂在采蜜過(guò)程中可能會(huì)采集到被農(nóng)藥污染的蜜源，造成蜂產(chǎn)品中出現(xiàn)農(nóng)藥殘留。三唑類(lèi)農(nóng)藥作為一代新的殺菌劑，廣泛應(yīng)用于糧食作物、蔬菜和水果中［7］，由于其親脂性的特性，其積聚在各種生物組織以及在生態(tài)系統(tǒng)中進(jìn)行傳輸而會(huì)對(duì)食物鏈造成污染［8］。目前，針對(duì)蜂產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留檢測(cè)的主要對(duì)象是有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑和擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥，尚未制定三唑類(lèi)農(nóng)藥在蜂產(chǎn)品中的限量標(biāo)準(zhǔn)，因此建立對(duì)蜂蜜中抗生素及三唑類(lèi)農(nóng)藥殘留的監(jiān)測(cè)對(duì)保證蜂蜜產(chǎn)品的安全具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

QuEChERS方法是一種快速高效的前處理分析方法，QuEChERS方法應(yīng)用在蜂蜜中農(nóng)藥及獸藥殘留檢測(cè)方面已有文獻(xiàn)［9－15］報(bào)道。本工作在傳統(tǒng)QuEChERS方法的凈化步驟上進(jìn)行了改進(jìn)，利用帶磁性的凈化吸附劑來(lái)除雜，免去離心的步驟，加快了蜂蜜樣品的凈化處理過(guò)程，并且磁性凈化劑還可以回收利用，符合綠色環(huán)保的要求。本工作對(duì)各個(gè)影響因素進(jìn)行了優(yōu)化，在優(yōu)化條件下采用高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)蜂蜜中15種三唑類(lèi)農(nóng)藥及15種抗生素（包括2種四環(huán)素類(lèi)，4種大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)和9種喹諾酮類(lèi)）殘留進(jìn)行測(cè)定，可為蜂產(chǎn)品中30種農(nóng)藥和抗生素的快速篩選提供科學(xué)的分析檢測(cè)技術(shù)。

1 試驗(yàn)部分

1．1 儀器與試劑

Thermo TSQ Quantum型液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀，配Survey液相操作系統(tǒng)；AL 204型電子分析天平；KQ－50E型超聲波清洗器。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱(chēng)取15種三唑類(lèi)農(nóng)藥包括聯(lián)苯三唑醇、糠菌唑、苯醚甲環(huán)唑、氟環(huán)唑、腈苯唑、三氟苯唑、氟喹唑、氟硅唑、己唑醇、腈菌唑、多效唑、戊菌唑、戊唑醇、三唑酮和滅菌唑，15種抗生素包括2種四環(huán)素類(lèi)（金霉素、四環(huán)素），4種大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)（交沙霉素、羅紅霉素、替米考星和泰樂(lè)菌素）和9種喹諾酮類(lèi)（氧氟沙星、環(huán)丙沙星、洛美沙星、達(dá)氟沙星、奧比沙星、恩諾沙星、雙氟沙星、沙拉沙星和司帕沙星）等標(biāo)準(zhǔn)品適量，用甲醇溶解，分別配制成100．0mg·L－1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于－4℃避光保存。使用時(shí)用甲醇稀釋至5．00mg·L－1，配成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，于－4℃避光保存。

Na2EDTA－Mcllvaine緩沖溶液：將0．1mol·L－1檸檬酸溶液1L與0．2mol·L－1磷酸氫二鈉溶液625mL混合，再用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至4．0，稱(chēng)取乙二胺四乙酸二鈉60．5g放入上述混合溶液中，使其溶解，搖勻。

氯化鈉、乙酸鈉、無(wú)水硫酸鎂、無(wú)水硫酸鈉均為分析純；乙腈、甲醇、乙酸乙酯均為色譜級(jí)；試驗(yàn)用水為去離子水。

1．2 儀器工作條件

1）色譜條件 Luna C18色譜柱（150mm×2．00mm，3μm），柱溫30 ℃；進(jìn)樣量5μL；流量0．2mL·min－1；流動(dòng)相 A 為0．1%（體積分?jǐn)?shù)，下同）甲酸溶液，B為乙腈。梯度洗脫程序：0．0～0．1min時(shí)，B為80%，保持5min；5．0～12．0min時(shí)，B由80%降至10%；12．0～18．0min時(shí)，B由10%升至80%。

2）質(zhì)譜條件 電噴霧正離子源（ESI＋），毛細(xì)管溫度350℃；噴霧電壓4 000V；鞘氣流量0．7L·h－1；輔助氣 流 量 0．2L·h－1；碰 撞 氣 為氬氣（0．2Pa）；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式。

30種化合物的其他質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1，其中“＊”為定量離子。

表1 質(zhì)譜參數(shù)Tab．1 MS parameters

表1（續(xù)）

1．3 試驗(yàn)方法

稱(chēng)取蜂蜜樣品1．000 0g于50mL離心管中，加入 pH 4．0 的 Na2EDTA－Mcllvaine緩沖溶液6mL，渦旋30s，再加入乙酸－乙腈（1＋19）混合溶液18mL繼續(xù)渦旋30s，之后依次加入氯化鈉2g，無(wú)水硫酸鈉4g，快速搖勻，振蕩2min后，以7 000r·min－1轉(zhuǎn)速離心5min后靜置。取上清液6mL轉(zhuǎn)移至已加入磁性C18和N－丙基乙二胺（PSA）各20mg的20mL樣品瓶中，振蕩30s后，使用外部磁力將固液兩相進(jìn)行分離，將液體倒入10mL玻璃管內(nèi)經(jīng)氮?dú)獯蹈珊?，?mL初始流動(dòng)相0．1%甲酸溶液－乙腈（2＋8）混合液復(fù)溶后，過(guò)0．22μm膜，按儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2．1 色譜行為

50μg·kg－1的30種農(nóng)藥及抗生素的色譜圖見(jiàn)圖1。

2．2 鹽析條件的選擇

2．2．1 緩沖溶液及其酸度

蜂蜜中含糖量較高，對(duì)樣品前處理造成干擾，因此，為了緩解蜂蜜樣品黏稠狀態(tài)，需要加入適當(dāng)?shù)娜芤簛?lái)稀釋樣品，從而有利于化合物的提取［16］。試驗(yàn)選擇較為常用的水溶液和Mcllvaine緩沖溶液來(lái)稀釋樣品。結(jié)果表明：在Mcllvaine緩沖液稀釋作用下，提取效率明顯提高，同時(shí)考慮到提取目標(biāo)物中含有能和金屬離子產(chǎn)生螯合作用的四環(huán)素類(lèi)抗生素，試驗(yàn)選擇Na2EDTA－Mcllvaine緩沖溶液為蜂蜜樣品的稀釋溶液。

考慮到目標(biāo)物大都屬于兩性化合物，試驗(yàn)還考察了不同 酸 度 （pH 分 別為 3，4，5，6，7，8）的Na2EDTA－Mcllvaine緩沖溶液對(duì)提取效率的影響［15］，見(jiàn)圖2。

圖1 15種三唑類(lèi)藥物（1～15）和15種抗生素（16～30）的色譜圖Fig．1 Chromatograms of 15triazoles（1－15）and 15antibiotics（16－30）

由圖2可知：農(nóng)藥和抗生素的回收率隨緩沖溶液酸度增大基本呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，其中三唑類(lèi)農(nóng)藥和四環(huán)素類(lèi)抗生素表現(xiàn)較為明顯，各類(lèi)藥物在Na2EDTA－Mcllvaine緩沖溶液pH為4時(shí)均出現(xiàn)了較為理想的回收率。蜂蜜樣品的pH控制在3．2～4．5之間時(shí)，加入緩沖鹽可以保持蜂蜜樣品的酸堿穩(wěn)定性，試驗(yàn)選擇Na2EDTA－Mcllvaine緩沖溶液的酸度為pH 4．0。

2．2．2 提取劑

圖2 緩沖溶液的酸度對(duì)提取回收率的影響Fig．2 Effect of acidity of buffer solution on extraction recovery

在QuEChERS方法對(duì)抗生素的提取試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，乙腈為提取劑時(shí)，蛋白質(zhì)等共提物比較少，且乙腈比丙酮、甲醇更易與水分離［17］；試驗(yàn)還考察了乙腈、甲醇、丙酮等溶劑對(duì)三唑類(lèi)農(nóng)藥的提取效率，結(jié)果表明乙腈對(duì)三唑類(lèi)農(nóng)藥的提取效率較高。試驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在乙腈溶液中加入5%（體積分?jǐn)?shù)）乙酸溶液，農(nóng)藥和抗生素的回收率均較高，試驗(yàn)選擇乙酸－乙腈（1＋19）混合溶液作為提取劑。

2．2．3 鹽析劑和吸水劑

QuEChERS方法常用的鹽析劑有乙酸鈉、氯化鈉，常用的吸水劑有無(wú)水硫酸鎂、無(wú)水硫酸鈉?？紤]到硫酸鎂中的Mg2＋和四環(huán)素類(lèi)藥物可能會(huì)結(jié)合生成螯合物，從而影響四環(huán)素類(lèi)藥物的提取，而乙酸鈉水解作用下會(huì)影響緩沖體系的酸度，試驗(yàn)選擇氯化鈉為鹽析劑，無(wú)水硫酸鈉為吸水劑。

2．3 凈化條件的選擇

2．3．1 除雜吸附劑

在QuEChERS方法中，較為常用的除雜吸附劑主要有C18和PSA，C18可除去脂類(lèi)等非極性物質(zhì)，PSA可除去極性有機(jī)酸、脂肪酸、糖類(lèi)等物質(zhì)。傳統(tǒng)的凈化過(guò)程是加入不帶磁性的C18和PSA來(lái)除雜吸附，再離心分離，所需凈化劑量較大，且離心分離需要較長(zhǎng)時(shí)間。試驗(yàn)分別考察了無(wú)磁性C18和PSA、磁性C18和PSA對(duì)試驗(yàn)過(guò)程的影響。結(jié)果表明：使用無(wú)磁性C18和PSA時(shí)，傳統(tǒng)離心步驟以及吸取上清液轉(zhuǎn)移至少需要10min；磁性吸附劑只需要1min即可完成吸附雜質(zhì)和傾倒提取液2步，其主要依靠外部磁場(chǎng)來(lái)完成，方便快捷。試驗(yàn)選擇使用磁性C18和PSA來(lái)進(jìn)行除雜吸附。

2．3．2 磁性C18和PSA用量

試驗(yàn)考察了磁性C18和PSA用量（二者分別加入10，20，30，40，50mg）對(duì)各類(lèi)藥物回收率的影響，其結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 吸附劑用量對(duì)回收率的影響Tab．2 Effect of the amounts of adsorbent on recovery

由表2可知：在磁性C18和PSA加入量分別為20mg時(shí)，藥物回收率達(dá)到最高；增加磁性C18和PSA的用量，藥物回收率呈下降趨勢(shì)，這可能是由于加入的吸附劑量過(guò)大，磁性吸附劑對(duì)目標(biāo)物有一定吸附及包裹，使藥物在分離過(guò)程中被保留而降低其回收率。試驗(yàn)選擇磁性C18和PSA的用量分別為20mg。

用過(guò)的磁性C18和PSA經(jīng)丙酮、甲醇清洗后可重復(fù)使用，在節(jié)省成本方面也具有優(yōu)勢(shì)。試驗(yàn)將用過(guò)一次的磁性C18和PSA依次用丙酮10mL、甲醇10mL浸泡，并超聲洗滌，該過(guò)程重復(fù)2次，回收后烘干。再次作為除雜吸附劑使用時(shí)，20mg磁性C18和20mg磁性PSA除雜效果接近首次使用，當(dāng)重復(fù)利用4次后，需要另外增加10mg新的吸附劑即可達(dá)到首次使用的吸附效果。表明磁性C18和PSA重復(fù)使用率較高，降低了吸附劑使用成本。

2．4 工作曲線與檢出限

在空白蜂蜜基質(zhì)樣品溶液中添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0．20，0．50，1．00，2．00，5．00，20．0，50．0，100．0μg·kg－1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，按試驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定。以各化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制基質(zhì)工作曲線。30種化合物的線性范圍、線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表3。

分別以3倍信噪比和10倍信噪比計(jì)算檢出限（3S／N）和測(cè)定下限（10S／N），其結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 線性參數(shù)、檢出限和測(cè)定下限Tab．3 Linearity parameters，detection limits and lower limits of determination

2．5 精密度和回收試驗(yàn)

對(duì)空白基質(zhì)分別添加10．0，20．0，50．0μg·kg－1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，按照試驗(yàn)方法對(duì)每一個(gè)添加水平平行測(cè)定5次，計(jì)算其加標(biāo)回收率和測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），其結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝5）Tab．4 Results of tests for precision and recovery（n＝5）

表4（續(xù)）

由表4可知：30種化合物的回收率在71．1%～116%之間，RSD小于22%。說(shuō)明方法的精密度和準(zhǔn)確度較高。

2．6樣品分析

按試驗(yàn)方法對(duì)12個(gè)蜂蜜樣品進(jìn)行測(cè)定，其中7個(gè)蜂蜜樣品有檢出，其檢出結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 樣品分析結(jié)果Tab．5 Analytical results of samples μg·kg－1

由表5可知：三唑類(lèi)農(nóng)藥中苯醚甲環(huán)唑檢出較多，質(zhì)量分?jǐn)?shù)在9．6～44．0μg·kg－1之間，喹諾酮類(lèi)和四環(huán)素類(lèi)藥物也有檢出，但質(zhì)量分?jǐn)?shù)均較低。

本工作建立了同時(shí)測(cè)定蜂蜜樣品中15種三唑類(lèi)農(nóng)藥和15種抗生素藥物的QuEChERS－HPLCMS／MS分析方法，分別對(duì)提取劑、凈化方法、吸附劑及其用量等樣品前處理?xiàng)l件進(jìn)行了優(yōu)化，將磁性材料用于QuEChERS方法，縮短了測(cè)定時(shí)間。方法操作簡(jiǎn)便快速，凈化效果好，適用蜂蜜中農(nóng)藥及抗生素的多殘留檢測(cè)。

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