全緣馬尾藻(Sargassum integerrimum)生殖細胞排放規(guī)律及人工促排條件*

歐澤奎 劉東超 謝恩義 吳啟藩

(廣東海洋大學 湛江 524088)

全緣馬尾藻(Sargassum integerrimum)是一種中國特有的大型褐藻, 隸屬褐藻門, 墨角藻目, 馬尾藻科, 主要產(chǎn)于廣東省沿海。藻體雌雄異株, 自然生長于低潮帶石沼中(曾呈奎等, 2000)。全緣馬尾藻具有很高的營養(yǎng)價值, 富含人體需要的不飽和脂肪酸(盧虹玉等, 2013a)。它還具有多種潛在的藥用價值, 研究發(fā)現(xiàn)從藻體中提取的多糖類物質(zhì)有神經(jīng)保護作用及抗氧化功能。此外, 藻體中還富含具有抗腫瘤、抗氧化效果的褐藻多酚類物質(zhì)(盧虹玉等, 2013b; Jin et al,2014; 肖為等, 2015)。全緣馬尾藻極具開發(fā)價值, 但目前全緣馬尾藻工廠化育苗程度低, 嚴重制約了其大規(guī)模栽培。

目前, 采苗量低是馬尾藻人工育苗中亟需解決的關(guān)鍵問題之一。研究表明, 導致雌雄異株類馬尾藻采苗量低的主要原因有兩個。一是生殖細胞排放量少、不同步, 導致可用于采苗的受精卵量少(Pang et al,2005; Fu et al, 2014)。二是一些馬尾藻的受精卵產(chǎn)生的假根部分會大量分泌“黏液”粘附在生殖托上(Inoh et al, 1932), 呈現(xiàn)“掛卵”的特性, 使得大多數(shù)受精卵不能在 24h內(nèi)脫落到采苗設(shè)施上(張婧, 2012), 從而導致受精卵在采苗設(shè)施上的附著率低(Pang et al,2005; Fu et al, 2014)。同時, 馬尾藻的生殖托從完全成熟到生殖細胞排放完成之間的周期長(徐金根,2013)。據(jù)此推測在馬尾藻人工育苗過程中可通過提高受精卵的脫落量來提高采苗率, 縮短促排時間和排卵時間來提高育苗效率。國內(nèi)外已報道了羊棲菜(Hizikia fusiforme)、鼠尾藻(Sargassum thunbergii)、銅藻(Sargassum horneri)的生殖細胞排放規(guī)律, 以及通過改變溫度、鹽度、水流速度等關(guān)鍵環(huán)境條件可提高藻體的采苗量(Pang et al, 2005, 2006, 2009; Zou et al,2005; 王增福等, 2007; Liu et al, 2016),且有研究發(fā)現(xiàn)溫度、鹽度等環(huán)境因子是引發(fā)半葉馬尾藻(Sargassumhemiphyllum)、海黍子(Sargassum muticum) 生殖細胞釋放的關(guān)鍵因子(Kam et al, 2016; Kerrison et al,2016)。而目前關(guān)于全緣馬尾藻的生殖細胞排放規(guī)律未見報道, 其人工育苗技術(shù)的基礎(chǔ)研究很少, 僅見報道了溫度、水流速度及干出處理對幼孢子體生長的影響(黃苑媚等, 2014; 孫宗紅等, 2015; 歐澤奎等,2016)。所以, 本文探究了全緣馬尾藻生殖細胞的排放規(guī)律以及溫度、鹽度和水流速度等主要環(huán)境因子的改變對排卵量、受精量、脫落卵量、促排時間和排卵時間的影響, 以期找到最適的人工促排條件, 進而為提高人工育苗生產(chǎn)中的采苗率提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

觀察實驗及單因子實驗材料: 2014年5月上旬從湛江市徐聞縣四塘村的近岸海域(110°08′E, 20°14′N)采集全緣馬尾藻成藻, 此時藻體上的生殖托剛開始成熟, 并可通過生殖托形狀辨別雌、雄藻體。觀察實驗使用促熟的生殖托, 促熟條件為在溫度29°C、光照強度7000lx, 光照周期18h∶6h[光照(L)∶黑暗(D)]、鹽度33條件下充氣培養(yǎng)。單因子實驗使用暫養(yǎng)成熟的生殖托, 在溫度(25±0.5)°C、光照強度(3000±100)lx,光照周期12h∶12h(L∶D)、鹽度 33±0.5條件下充氣暫養(yǎng)。雌、雄藻體上的生殖托同步達到完全成熟后,挑取托內(nèi)生殖細胞已成熟的雌、雄生殖托, 并用已消毒的手術(shù)刀將生殖托從藻體上取下后用于實驗。培養(yǎng)液用已滅菌的PESI培養(yǎng)液, pH值8.2±0.2, 每天更換一次。正交優(yōu)化實驗材料: 2015年5月上旬從同一海域采集并按上述單因子實驗采用的方法處理。

論文中PESI培養(yǎng)液為PESI儲存液與消毒海水按照體積比 1∶49的比例混合而成的混合液。PESI儲存液的組成成分為, NaNO3、NH4Cl、Na2HPO4·12H2O、甘油磷酸鈉、EDTA與 Fe按摩爾比 1∶1配制、PII金屬液、Tris、KI, 各組分的相應濃度為 3.5g/L、0.5g/L、0.5g/L、0.5g/L、0.025g/L、250ml/L、5g/L、0.001g/L, 該儲存液由蒸餾水配制, pH值調(diào)節(jié)為7.8。PII金屬液組分為, EDTA·2Na、FeCl3、H3BO3、MnCl2、ZnCl2、CoCl2, 各組分的相應濃度為1g/L、0.01g/L、0.2g/L、0.04g/L、0.005g/L、0.001g/L, 該金屬液由超純水(Milli-Q Advantage 10, MILLIPORE)配制。消毒海水為經(jīng)沙濾及暗處理的自然海水煮沸消毒 20min,冷卻至常溫, 12h后再次煮沸消毒20min, 冷卻至常溫后即可用。

1.2 暫養(yǎng)條件下觀察雌、雄生殖細胞排放規(guī)律

觀察受精規(guī)律, 用量筒準確量取 500mL已滅菌的 PESI培養(yǎng)液加入 500mL燒杯中, 培養(yǎng)液 pH值8.2±0.2, 實驗過程中不更換培養(yǎng)液, 實驗設(shè)置3個平行組。用天平分別準確稱取濕重 0.1g雌生殖托以及濕重 5g雄生殖托放入燒杯中, 由于生殖托會下沉,需要用聚乙烯繩將生殖托固定于水面以下 2—3cm。在溫度(25±0.5)°C、光照強度(3000±100)lx, 光照周期12h∶12h(L∶D)、鹽度 33±0.5條件下靜置培養(yǎng)生殖托, 第一批卵細胞排出后, 立即將雌生殖托移出, 并用培養(yǎng)液將卵細胞從生殖托上輕輕沖洗至直徑90mm培養(yǎng)皿中, 燒杯中的雄生殖托不被移出。隨后立即用一次性吸管吸取 100個卵細胞至原燒杯中, 每隔 1h用吸管將燒杯中所有的卵吸取至5個直徑90mm培養(yǎng)皿中, 每個皿中 20個卵, 皿中已加能完全浸沒卵的滅菌 PESI培養(yǎng)液, 并用吸管將卵分散以保證各卵不重疊。然后將每個培養(yǎng)皿均在ZEISS體視鏡下拍照3次, 拍攝畫面保證圖像清晰; 每次拍攝完成后, 將取出的卵吸取回原燒杯。在實驗完成后選取清晰圖片并用photoshopCS6對圖片上的受精卵計數(shù), 記錄。受精率計算方法: R(%)=Nf·100%。其中, R為受精率(fertilization rates), Nf為記錄的受精卵數(shù)(fertilized eggs number)。根據(jù)已有馬尾藻早期發(fā)育相關(guān)文獻(張婧等, 2012; 賈檉等, 2012; 楊彬等, 2013; 趙素芬等,2013; 李健鵬等, 2014)以及觀察得出, 剛釋放出來的卵細胞具有8個分散的細胞核, 精子與卵中的一個細胞核結(jié)合后, 其余的細胞核逐漸與該核融合, 最終在細胞中央形成一個近似圓形的大細胞核, 標志著受精過程完成, 受精卵已形成。受精卵形成后開始第一次分裂, 沿赤道板橫裂成2個細胞。隨后經(jīng)過多次橫、縱分裂, 形成了類似地雷狀的多細胞胚胎。隨后, 基部細胞橫裂形成囊泡狀細胞, 囊泡狀細胞繼續(xù)橫裂,逐漸伸長, 形成假根, 假根完全形成意味著已形成完整的幼孢子體; 此后幼孢子體迅速伸長和發(fā)育。綜上,本文判定卵細胞和受精卵的依據(jù)為: 剛排出的8核細胞為卵細胞; 細胞處于受精過程中或者受精卵分裂過程中, 以及處于幼孢子體發(fā)育過程中, 均判定為“受精卵”。

觀察排放習性, 用量筒準確量取 2L已滅菌的PESI培養(yǎng)液加入 2L燒杯中, 培養(yǎng)液 pH值 8.2±0.2,實驗過程中不更換培養(yǎng)液, 實驗設(shè)置3個平行組。將取下的雌、雄生殖托用天平分別準確稱取不同濕重(0.5, 1, 2, 4, 8g), 將等重量的雌、雄生殖托放入同一燒杯中。用聚乙烯繩將生殖托固定于水面以下 2—3cm, 在室內(nèi)靜置暫養(yǎng)條件下培養(yǎng)生殖托。當每個光周期或暗周期結(jié)束時以及結(jié)束后6h時, 在 90mm培養(yǎng)皿中加入能完全浸沒卵的滅菌 PESI培養(yǎng)液后, 用鑷子在燒杯中隨機取 10個雌生殖托至培養(yǎng)皿中; 并用電子天平上稱量放入生殖托前后培養(yǎng)皿的重量,前后的重量差即為取樣生殖托的重量。由于雌生殖托呈三棱形, 將其三個面在體視鏡下各拍照3次; 同時用玻璃棒攪拌均勻燒杯中的培養(yǎng)液, 然后用吸管隨機吸取培養(yǎng)液至10mL量筒中定容5mL, 定容后將量筒中的卵吸出至培養(yǎng)皿中, 向每個培養(yǎng)皿吸入若干卵并用吸管將卵分散以保證各卵不重疊, 在吸入卵之前皿中已加能完全浸沒卵的滅菌PESI培養(yǎng)液。每個培養(yǎng)皿均在體視鏡下拍照 3次, 每次拍攝完成后,將取出的雌生殖托、卵、培養(yǎng)液均放回原燒杯, 在實驗完成后選取清晰圖片并用 photoshopCS6對圖片上的受精卵、未受精卵計數(shù), 記錄, 并計算出排卵量、總受精卵量、脫落的受精卵量。計算方法:

NR(個/g)=[400× (N1+N2)+M1/M2× (M3+M4)]/M1;

NZ(個/g)=(400×N1+M1/M2×M3)/M1;

NE(個/g)=400× (N1+N2)/M1。

其中, NR為排卵量(released eggs number), NZ為總受精卵量(zygotes number), NE為脫落的受精卵量(exutive zygotes number), N1為水樣中的受精卵量, N2為水樣中的未受精卵量, M1為實驗生殖托重量, M2為取樣生殖托重量, M3為取樣生殖托上的受精卵量, M4為取樣生殖托上的未受精卵量。

1.3 溫度、鹽度及水流速度對全緣馬尾藻生殖細胞排放的影響

溫度實驗, 溫度設(shè)置25, 27, 29, 31, 33°C五個梯度, 其他條件為光照周期 0h∶24h(L∶D), 鹽度 33,pH值8.2, 靜置培養(yǎng)。鹽度實驗, 鹽度設(shè)置29, 31, 33,35, 37五個梯度, 其它條件為光照周期 0h∶24h(L∶D), 溫度 29°C, pH值 8.2, 靜置培養(yǎng)。流速實驗, 水流速度實驗設(shè)置0, 3, 6, 9, 12cm/s五個梯度, 其他條件為光照周期 0h∶24h(L∶D), 溫度 29°C, 鹽度 33,pH值8.2。在單因子實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上進行促排正交實驗, 正交設(shè)計采用34實驗設(shè)計, 其他條件為光照周期0h∶24h(L∶D), pH值8.2。

溫度使用光照培養(yǎng)箱控制; 光照由光照培養(yǎng)箱提供, 并用分體式照度計測定; 鹽度使用海水精鹽和超純水調(diào)節(jié), 采用便攜式鹽度計測定; 水流速度由氣石充氣提供, 將氣石固定在與生殖托同一水層面, 通過控制氣流大小調(diào)整水流速度, 水流速度采用便攜式流速測定儀測定, 保證生殖托所在水層面的水流速度。由于水流速度小, 燒杯下層流速近于 0, 脫落的卵細胞和受精卵會逐漸沉降在燒杯底部。

每個實驗組量取2L已滅菌的PESI培養(yǎng)液至2L大燒杯中, 培養(yǎng)液pH值8.2, 實驗過程中培養(yǎng)液不更換, 每個實驗組設(shè)置3個平行組。每個燒杯中放入2g等重量的雌、雄生殖托, 用聚乙烯繩將生殖托固定于水面以下 2—3cm。實驗在上述實驗條件下進行, 實驗開始后定時取杯中的雌生殖托在體視鏡下觀察,判斷排卵結(jié)束的時間并記錄。在排卵結(jié)束時以及排卵結(jié)束后6h時取杯中的雌生殖托以及攪拌均勻的培養(yǎng)液, 將二者在體視鏡下快速拍照, 并利用圖片計算排卵量、總受精卵量、脫落的受精卵量, 具體方法如觀察排卵習性時所用方法。

1.4 雌、雄生殖托的比例對生殖細胞排放的影響

雌、雄生殖托的重量比值設(shè)置 1∶1(2g∶2g),1∶2 (2g∶4g), 1∶4(2g∶8g), 1∶6(2g∶12g), 1∶8(2g∶16g)五個梯度。在溫度 31°C, 鹽度 33±1, 水流速度(6±1)cm/s, 光照周期 0h∶24h(L∶D)的條件下進行實驗。

每個實驗組量取2L已滅菌的PESI培養(yǎng)液至2L大燒杯中, 培養(yǎng)液pH值8.2, 實驗過程中培養(yǎng)液不更換, 每個實驗組設(shè)置3個平行組。然后將雌、雄生殖托按比例放入燒杯中, 用聚乙烯繩將生殖托固定于水面以下 2—3cm。實驗開始后, 定時取杯中的雌生殖托在體視鏡下觀察, 判斷排卵結(jié)束的時間并記錄。在排卵結(jié)束時以及排卵結(jié)束后6h時取杯中的雌生殖托以及攪拌均勻的培養(yǎng)液, 將二者在體視鏡下快速拍照, 并利用圖片計算排卵量、總受精卵量、脫落的受精卵量, 具體方法如觀察排卵習性時所用方法。

1.5 數(shù)據(jù)處理

實驗所得數(shù)據(jù)用 SPSS18.0進行處理, 結(jié)果表示為平均值±標準差。數(shù)據(jù)比較采用方差分析和 Tukey多重比較法, 以 P＜0.05作為顯著差異, 并用Origin8.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 卵細胞的受精率與排出時間的關(guān)系

當卵細胞排出后(見圖1b), 在雄生殖托(見圖1c)排出精細胞足夠量的條件下受精。由圖 2可以得出,卵細胞排出1h后, 受精率為(63±3.06)%, 隨著時間的延長, 卵細胞的受精率逐漸升高, 且前 3h之間的受精率差異明顯(P＜0.05)。受精率在 4h達到最大值(89.7±0.6)%, 受精率在 4h后不再升高, 其原因可能是: 在 4h內(nèi)無有活性的精子與排出的卵細胞結(jié)合,卵細胞將會凋亡。結(jié)果表明, 排出的卵細胞在 4h內(nèi)具有活性, 能夠受精。

圖1 全緣馬尾藻的雄生殖托及受精前、后的雌生殖托Fig.1 The receptacles of male Sargassum integerrimum and the female one before and after fertilization注: 字符1為剛排出的卵細胞; 2為受精卵, 已開始分裂; 3為未受精的卵細胞, 已死亡。子圖a和b為雌生殖托, c為雄生殖托。圖中標尺均為1mm

圖2 全緣馬尾藻排卵以后受精率的變化Fig.2 Variation in fertilization rate of S. integerrimum after ovulation注: 誤差線表示標準差, 組間不同字母表示差異顯著

2.2 在室內(nèi)暫養(yǎng)條件下雌、雄生殖細胞的排放規(guī)律

在室內(nèi)暫養(yǎng)條件下暫養(yǎng)約 5d后, 雌生殖托開始排卵。從圖3可以發(fā)現(xiàn), 雌生殖托排放卵細胞主要在黑暗條件下完成。完成整個排卵過程約需 3d。第 1d的排卵量最多, 為(8473±1065)個/g, 后 2d的排卵量逐漸減少。3d內(nèi)卵細胞的總排放量可以達到(14431±1288)個/g。由于排出的卵細胞在4h內(nèi)能完成受精, 研究在每個光周期或暗周期結(jié)束后拍照記錄用以計算排卵量, 6h再次拍照記錄用以計算受精卵量以及脫落的受精卵量。對比圖3與圖4, 發(fā)現(xiàn)受精卵量隨卵細胞排出量變化而改變, 且二者數(shù)量的變化時間相對一致, 這從側(cè)面說明雄生殖托排放精子與雌生殖托排放卵細胞基本同步。整個排卵過程的受精率為50%—60%, 最終得到的受精卵量為(8358±734)個/g。

受精完成后, 受精卵如圖1a“掛卵”, 只有部分受精卵脫落。從圖5中可看出在42h內(nèi)的脫落受精卵量很低, 直到48h才開始大量脫落, 72h內(nèi)的總脫落的受精卵量為(4283±272)個/g。與排卵過程相似, 受精卵的脫落過程也主要集中在黑暗條件下。72h內(nèi)總排卵量除去脫落受精卵量得到掛卵量約為 10000個/g,接近48h內(nèi)的排卵量, 這表明卵脫落的原因可能是雌生殖托表面積有限, 新排出的卵細胞導致“掛卵”脫落。由此可以推測, 在靜置條件下, 脫落受精卵量主要與排卵量相關(guān)。

2.3 雌生殖托的排卵量與其重量的關(guān)系

將表 1中的雌生殖托(見圖 1)總排卵量與雌生殖托重量進行一元線性回歸分析, 二者回歸關(guān)系極其顯著, 符合回歸方程?y= –3080.875+17295.056x, 判定系數(shù) R2=0.99。同時對二者進行相關(guān)分析, 得到相關(guān)性系數(shù)r=0.99, 說明雌生殖托的總排卵量與雌生殖托的重量呈正相關(guān), 且相關(guān)極其顯著。在實際應用中可以依據(jù)雌生殖托的重量估算其總排卵量。

2.4 溫度、鹽度及水流速度對全緣馬尾藻生殖細胞排放的影響

從表2可得出, 改變溫度對實驗組所需促排時間影響較大。29°C組促排需要的時間最長, 33°C組所需促排時間最短。當溫度高于或低于 29°C時, 各實驗組需要的促排時間都逐漸減少, 且差異顯著(P＜0.05)。隨著溫度改變, 排卵時間變化與促排時間變化相一致。改變鹽度對實驗組所需促排時間影響也較大。鹽度33組所需促排時間最長, 29組所需促排時間最短。當鹽度高于或低于 33時, 各實驗組需要的促排時間逐漸減少, 且差異顯著(P＜0.05)。隨著鹽度改變, 各實驗組的排卵時間變化與促排時間變化相一致。相比于溫度和鹽度, 改變水流速度對實驗組促排時間影響較小。0cm/s組需要的促排時間最長,12cm/s組所需促排時間最短。當水流速度高于0cm/s時, 需要的促排時間逐漸減少, 除 3和 6cm/s組外,各實驗組的促排時間差異顯著(P＜0.05), 其他各實驗組需要的促排時間差異顯著(P＜0.05)。隨著水流速度改變, 排卵時間變化與促排時間變化相一致。

圖3 全緣馬尾藻的排卵量Fig.3 The amount of S. integerrimum eggs released注: 誤差線表示標準差

圖4 全緣馬尾藻的受精卵量Fig.4 The amount of S. integerrimum zygotes that fertilized注: 誤差線表示標準差

圖5 全緣馬尾藻排卵以后的脫落受精卵量Fig.5 The amounts of exutive eggs of S. integerrimum after eggs release注: 誤差線表示標準差

表1 雌生殖托的重量與其排卵量的關(guān)系Tab.1 Relationship between the weight of female receptacles and the capacity of its reproduction

從圖6可得, 溫度改變對雌生殖托的排卵量影響相對較小, 除33°C組外, 其他4組的排卵量差異不顯著(P＞0.05)。33°C 組的排卵量最少, 為(6422±670)個/g。27°C 組、29°C 組、31°C 組的受精卵量最高(P＞0.05)。當溫度過高(33°C)或者過低(25°C)時, 實驗組的受精卵量明顯減少, 與其他三組相比差異顯著(P＜0.05)。33°C組的受精卵量最低, 為3048±338個/g。各實驗組的脫落受精卵量與排卵量都成呈正相關(guān),除 33°C組外, 各組的脫落受精卵量差異不顯著(P＞0.05)。33°C 組脫落受精卵量最少, 為(334±183)個/g。分析可得, 溫度在27—31°C間時得到的受精卵以及脫落受精卵最多。

圖7顯示, 改變鹽度對雌生殖托的排卵量影響較大。鹽度 29組的排卵量最少, 為(4214±253)個/g, 與其他 4組差異顯著(P＜0.05)。隨著鹽度的升高, 排卵量明顯增加, 33組以及 35組的排卵量達到最多(P＞0.05)。當鹽度高于33時, 排卵量逐漸下降; 鹽度越高, 排卵量下降越明顯。37組的排卵量與31組的排卵量相近(P＞0.05)。但 35組的受精卵量最高, 為(10450±1214)個/g。除33組外, 各實驗組的受精卵量與排卵量成正相關(guān), 29組受精量最低, 為(1037±206)個/g。各實驗組的脫落受精卵量與排卵量成正相關(guān),且33、35、37組的脫落受精卵量差異顯著(P＜0.05), 可見鹽度比溫度對脫落受精卵量的影響更明顯。33組的脫落受精卵量最多, 為(3333±376)個/g; 29組的脫落受精卵量最少, 為(366±136)個/g。鹽度過高或者過低時受精卵量明顯減少, 所以將鹽度控制在 35左右可使形成的受精卵量最多; 但是在實際生產(chǎn)中只能收集到脫落的受精卵, 所以鹽度控制在 33左右可收集到的受精卵最多。

表2 改變環(huán)境因子對促排時間和排卵時間的影響Tab.2 Changes in decorporation time and ovulation time under different environmental condition

圖6 改變溫度對全緣馬尾藻的排卵量、受精卵量、脫落受精卵量的影響Fig.6 Variations of gamete released, zygotes, and exutive eggs of S. integerrimum with temperature注: 誤差線表示標準差

圖7 改變鹽度對全緣馬尾藻的排卵量、受精卵量、脫落受精卵量的影響Fig.7 Variations of gamete released, zygotes, and exutive eggs of S. integerrimum with salinity注: 誤差線表示標準差

從圖8可得, 當水流速度從0cm/s升高至6cm/s,雌生殖托的排卵量逐漸增多, 3和 6cm/s組的排卵量為最多(P＞0.05), 二者與 0cm/s組的排卵量差異顯著(P＜0.05)。隨著水流速度加快, 排卵量開始下降, 流速越高, 下降越明顯。9cm/s組的排卵量下降至與0cm/s組相近(P＞0.05)。12cm/s組的排卵量最少, 與其他 4組均差異顯著(P＜0.05), 為(8412±772)個/g。受精卵量與排卵量成正相關(guān), 12cm/s組的受精卵量最低, 為(1548±231)個/g, 6cm/s組的受精卵量最高, 為(11339±1170)個/g。脫落受精卵量與水流速度變化基本相一致,水流速度越多, 受精卵量的脫落率越高, 0、3和6cm/s組脫落受精卵量差異顯著(P＜0.05), 6cm/s組的脫落受精卵量最高, 為(8044±644)個/g; 但當水流速度高于6cm/s時, 由于卵量影響, 脫落受精卵量逐漸減少(P＜0.05), 12cm/s組的脫落受精卵量最少, 為(1468±222)個/g。水流過高或過低都不利于增加受精卵量,所以將水流控制在6cm/s左右可使形成的受精卵量最多, 且在實際生產(chǎn)中只能收集到脫落的受精卵, 所以鹽度控制在6cm/s左右可收集到的受精卵最多。

圖8 改變水流速度對全緣馬尾藻的排卵量、受精卵量、脫落受精卵量的影響Fig.8 Variations of gamete released, zygotes, and exutive eggs of S. integerrimum with flow speed注: 誤差線表示標準差

2.5 生殖細胞排放過程中溫度、鹽度、水流速度條件的優(yōu)化

對表 3中的脫落受精卵量進行一般線性模型分析, 得到單因素統(tǒng)計量Kn值。三種不同溫度對應的K值間差異不顯著(P＞0.05), 說明溫度對脫落受精卵量影響不顯著; 三種不同鹽度對應的 K值間差異不顯著(P＞0.05), 說明鹽度對脫落受精卵量影響不顯著;三種不同水流速度對應的K值間差異不明顯(P＞0.05),說明水流速度對脫落受精卵量影響不顯著。所以, 在溫度為(29±2)°C, 鹽度為 33±1, 水流速度為(6±1)cm/s的條件下對生殖細胞促排, 實驗組得到的脫落受精卵量最多。

排卵時間變化與促排時間的變化呈正相關(guān), 所以僅對促排時間分析, 得到單因素統(tǒng)計量Kn值見表2—3。三種不同溫度對應的K值間差異顯著(P＜0.05),說明溫度對所需促排時間影響顯著; 三種不同鹽度對應的K值間差異不顯著(P＞0.05), 說明鹽度對所需促排時間影響不顯著; 三種不同水流速度對應的 K值間差異不明顯(P＞0.05), 說明水流速度對所需促排時間影響不顯著。比較溫度的 Kn值, 當溫度為 31°C時對應的K值最小, K值越小, 表明此因素在該水平下所需促排時間最短。所以, 在溫度為31°C, 鹽度為33±1, 水流速度為(6±1)cm/s的條件下對生殖細胞促排, 實驗組所需促排時間以及排卵時間最短。

綜上分析, 在溫度為 31°C, 鹽度為 33±1, 水流速度為(6±1)cm/s的條件下, 實驗組得到的受精卵量最多, 且所需促排和排卵時間最短, 該條件為最適促排條件。

表3 促排實驗正交設(shè)計及結(jié)果Tab.3 Orthogonal design and results for decorporation experiments

2.6 提高雌、雄生殖托重量比對生殖細胞排放及受精率的影響

從表4中可以得出, 雌、雄生殖托的重量比對促排時間的影響較大, 各實驗組所需促排時間差異顯著(P＜0.05)。隨著雌、雄生殖托重量比的降低, 各實驗組所需促排時間逐漸減少。當雌、雄生殖托重量比為 1∶6時所需促排時間最少, 比暫養(yǎng)條件下所需促排時間縮短了4d。當雌、雄生殖托重量比低于1∶6時, 所需促排時間不再減少。雌、雄生殖托的比例對排卵時間的影響不大, 隨著雌、雄生殖托重量比的降低,各實驗組的排卵時間逐漸減少。除1∶6以及1∶8兩組外, 其他各組的排卵時間差異不顯著(P＞0.05)。當雌、雄生殖托重量比為 1∶6時所需排卵時間最少, 排卵時間比暫養(yǎng)條件下的排卵時間縮短了 2d。當雌、雄生殖托重量比低于 1∶6時, 排卵時間不再減少。在最適條件下, 雌、雄生殖托重量比對受精率的影響不大。隨著雌、雄生殖托重量比降低, 受精率逐漸升高, 當雌、雄生殖托重量比低于 1∶2時, 各組之間的受精率差異不明顯(P＞0.05)。雌、雄生殖托重量比為 1∶6時受精率達到最高, 為(94.4± 0.3)%。

表4 不同生殖托比例對生殖細胞排放的影響Tab.4 The effect on discharging gametes for changing ratios of female and male receptacles

3 討論

3.1 全緣馬尾藻生殖細胞的排放規(guī)律

在觀察中發(fā)現(xiàn), 全緣馬尾藻生殖細胞排放集中在凌晨2點—4點完成, 具有夜間排放習性。與全緣馬尾藻同屬馬尾藻科的羊棲菜也具有這一習性(Zou et al, 2005)。此外, 巖藻(Fucus ceranoides)與全緣馬尾藻同屬墨角藻目, 其生殖細胞排放習性也為夜間排放(Brawley, 1992)。其原因可能是物種在長期進化過程中對環(huán)境的適應。黑暗條件有利于生殖細胞的存活, 剛排放出來生殖細胞不能進行光合作用, 沒有光照的要求; 如果光照過強, 生殖細胞以及受精卵會因為光刺激而受到一定程度損傷。其次, 自然海區(qū)凌晨的溫度較低, 有利于提高生殖細胞以及受精卵的存活率。受精卵的“掛卵”特點也可能是全緣馬尾藻為適應環(huán)境而形成的防御特性。自然海區(qū)的風浪較大,“掛卵”有利于受精卵的萌發(fā)和生長。而部分受精卵脫落的根本原因可能是由于雌生殖托的表面積有限從而藻體產(chǎn)生的一種繁殖策略。附著能力低的受精卵由于生存能力低將會脫落, 雌生殖托自身會再形成新的受精卵代替這些脫落的受精卵, 這種現(xiàn)象屬于MacArthur提出的 r—選擇繁殖策略。導致受精卵脫落的主要直接原因可能是雌生殖托通過自身調(diào)節(jié)減少表面黏性或者分泌物質(zhì)消解受精卵的黏性分泌物。其次, 新排出的卵細胞產(chǎn)生的物理張力也會加快受精卵脫落。當馬尾藻受到環(huán)境改變帶來的威脅時會產(chǎn)生應激反應提前進行生殖行為(Agrawal, 2012)。本研究小范圍改變溫度、鹽度等非生物因素和生物因素都縮短其促排時間和排卵時間, 說明全緣馬尾藻的生物應激性較強, 這一特點也是全緣馬尾藻適應多變的海洋環(huán)境的體現(xiàn)。本研究中全緣馬尾藻排出的卵細胞在4h內(nèi)具有受精活性。巖藻和羊棲菜與全緣馬尾藻同屬墨角藻目, 二者的卵細胞排出后分別在 2h內(nèi)和6h內(nèi)具有活性( Brawley, 1992; Pang et al, 2006);而全緣馬尾藻同屬馬尾藻屬的銅藻, 其卵細胞排出后在48h內(nèi)具有受精能力(Pang et al, 2009)。比較說明全緣馬尾藻的自然繁殖能力在馬尾藻屬中相對較弱, 從而其雌、雄生殖細胞排放的同步性對其卵細胞的受精率尤其重要。

生物信息素為雌、雄生殖托排放的外激素, 為植物間傳遞信號的化學物質(zhì), 在褐藻門植物的雌、雄生殖托的分化、成熟以及生殖細胞排放過程中都有重要的作用, 各種藻體產(chǎn)生的信息素所含化學物質(zhì)的種類也不同, 但均源于不飽和脂肪酸。如信息素可首先誘導雄性生殖囊排放精子, 精子排放后有利于雌、雄植株同步排放, 同時也有利于誘導雌性植株排放雌性信息素(Pantke-B?cker et al, 1995)。在生殖細胞排放之前, 生物信息素能誘導生殖托分化, 增強生殖托對強光照的適應能力, 進而促進生殖托成熟。如雄性生殖托較少, 雄性生殖托產(chǎn)生的生物信息素會使雌性生殖托的趨光性減弱, 導致成熟的雌性生殖托個體較小, 說明生物信息素誘導雌、雄生殖托的同步成熟(Togashi et al, 2004)。生殖托成熟后, 雄生殖托產(chǎn)生的生物信息素與雌生殖托細胞表面的受體結(jié)合后,經(jīng)細胞信號轉(zhuǎn)導后作用于細胞結(jié)構(gòu), 促使卵細胞排放, 其作用強度決定了雌、雄生殖細胞排放的同步性。此前, Pang等(2005)研究發(fā)現(xiàn)羊棲菜雌、雄生殖細胞排放不完全同步, 但在其研究中通過改變環(huán)境條件使生殖細胞完全同步排放后, 羊棲菜卵細胞的受精率可高達90%。本研究中, 暫養(yǎng)條件下卵細胞的受精率50%—60%, 說明其信息素誘導的排放并不完全同步。

3.2 溫度、鹽度對生殖細胞排放及受精過程的影響

王增福等(2007)研究發(fā)現(xiàn), 在成熟時的溫度的基礎(chǔ)上, 升高溫度有利于生殖細胞的排放。本研究結(jié)果顯示, 促排溫度為 29°C時全緣馬尾藻促排所需時間最長, 溫度升高或者降低均使促排所需時間明顯減少, 其原因可能為: 29°C為全緣馬尾藻卵細胞形成的最適宜溫度, 在此溫度下已成熟的卵細胞排放最為穩(wěn)定, 促排所需時間最長; 溫度升高或者降低會對卵細胞產(chǎn)生刺激, 產(chǎn)生一系列的生理變化, 從而使卵細胞提前排放。溫度對排卵量的影響不大, 溫度25—31°C時雌生殖托的排卵量相差不大, 溫度高于31°C時排卵量明顯減少, 這可能是由于溫度過高導致卵細胞活性下降甚至衰亡, 從而使排出的卵細胞減少。溫度 27—31°C時得到的受精卵量最多, 且受精率最高, 而當溫度高于31°C或者低于25°C時, 得到的受精卵量顯著減少以及受精率都明顯下降, 其原因可能是溫度 27—31°C時信息素信號細胞轉(zhuǎn)導所需酶的活性最高, 從而提高了雌、雄生殖細胞排放的同步性。促排鹽度為33時全緣馬尾藻促排所需時間最長, 鹽度升高或者降低均使促排所需時間明顯減少, 其原因可能為: 全緣馬尾藻卵細胞形成的最適宜鹽度為 33, 在此鹽度下已成熟的卵細胞排放最穩(wěn)定,促排所需時間最長, 鹽度升高或者降低會對卵細胞產(chǎn)生刺激, 產(chǎn)生一系列的生理變化, 從而使卵細胞提前排放。本研究中, 鹽度為33—35時排卵量最大, 當鹽度升高或下降時排卵量都呈下降趨勢, 這可能是細胞外鹽度改變引起細胞內(nèi)滲透壓過高或者過低,從而導致卵細胞大量衰亡(Agrawal, 2012)。溫度對受精卵的脫落過程基本無影響, 而鹽度對受精卵的脫落過程有一定的影響, 在鹽度為 35時不利于受精卵的脫落, 這可能是由于此鹽度條件下, 受精卵表層分泌的的黏性物質(zhì)較處于其他鹽度時增多, 具體機制有待進一步研究。

墨角藻目海藻的卵細胞受精方式多為體外受精。與人類等高等生物相似, 其卵細胞的細胞膜上具有Na+依賴性通道, 可以控制精子進入。在一個精子進入卵細胞后, 通道暫時關(guān)閉, 可以防止其他精子進入而造成多精受精。多精受精卵不能正常分裂, 容易死亡。但是隨著海水鹽度的大幅度改變, 滲透作用使細胞內(nèi)的 Na+濃度水平不穩(wěn)定, Na+依賴性通道的保護功能受到破壞, 從而使產(chǎn)生多精受精卵的概率增大(Brawley, 1992)。本研究結(jié)果表明鹽度在35時的受精率最高, 說明全緣馬尾藻卵細胞的 Na+依賴性通道在鹽度35時更具穩(wěn)定性。另外, Na+依賴性通道進行正常生理活動需要能量, 所以溫度會通過影響產(chǎn)能所需酶的活性進而影響受精率。參考已有的海洋表面溫度(SST)數(shù)據(jù), 5月份我國南海海區(qū)表層海水的平均溫度在 29°C 左右(湯超蓮, 2008; Wang et al, 2012), 推測溫度在29°C左右時產(chǎn)能所需酶的活性最高, 能較好地維持 Na+依賴性通道的保護功能。所以試驗得出溫度(29±2)°C 的得到的受精卵量最多, 該結(jié)果比較合理。

3.3 水流速度及雌、雄生殖托比例對生殖細胞排放及受精過程的影響

Togashi等(2008)的研究發(fā)現(xiàn)自然狀態(tài)下雄生殖托排放的精子數(shù)目遠多于雌生殖托排放的卵細胞數(shù)目, 卵細胞的受精率與精子數(shù)目無明顯相關(guān)性。而本研究中增加雄生殖托的比例能夠提高受精率, 縮短促排時間, 其原因可能是雄生殖托釋放的雄性信息素濃度隨著雄生殖托數(shù)量增多而升高。高濃度的信息素使排卵過程提前, 并使排卵過程與精子排放過程的同步性增強。適當增加水流速度可以使雌、雄信息素在雌、雄生殖托之間充分傳遞(Pearson et al, 2006)。本研究將水流速度升至6cm/s時, 排卵量以及受精率都達到最高。而當水流速度高于6cm/s時, 排卵量以及卵細胞的受精率都明顯下降, 其原因可能是水流速度過高導致信息素的稀釋倍數(shù)過大, 從而雄性生物信息素對雌性生殖托的作用減弱, 以致排卵量減少及排卵過程滯后。Ladah等(2008)的研究也證明了這一點, 在自然海區(qū), 墨角目海藻一般在水流緩慢的退潮期排放生殖細胞, 生物信息素能充分傳遞但不會被大量稀釋, 能高效作用于生殖托并誘導生殖細胞排放。但Zou等(2005)在研究羊棲菜排放規(guī)律時發(fā)現(xiàn), 靜置處理組的排卵量比流水處理組的排卵量高,其原因可能為其雄生殖托釋放的信息素在水流作用下被稀釋。此外, 研究結(jié)果也表明脫落卵量與水流速度成正相關(guān)。目前馬尾藻人工育苗中幼孢子體附著率極低, 對采苗量影響極大, Zhang等(2012)的研究表明鼠尾藻在育苗過程中的自然附著率在 10%以下, 而本研究發(fā)現(xiàn)適當提高水流速度可加快受精卵脫落,進而提高附著率, 可增加人工育苗過程中的采苗量。在暫養(yǎng)條件基礎(chǔ)上, 改變溫度、鹽度、水流速度及雌、雄生殖托比例后, 卵細胞的受精率可達到(94.4±0.3)%, 具有實際應用價值。

王增福, 劉建國, 2007. 鼠尾藻(Sargassum thunbergii)有性生殖過程與育苗. 海洋與湖沼, 38(5): 453—457

盧虹玉, 楊小青, 謝恩義等, 2013a. 全緣馬尾藻的主要營養(yǎng)成分分析與評價. 食品研究與開發(fā), 34(7): 120—122

盧虹玉, 劉 義, 吉宏武等, 2013b. 全緣馬尾藻褐藻多酚的抗氧化和抗腫瘤細胞增殖作用研究. 現(xiàn)代食品科技, 29(4):702—705

湯超蓮, 2008. 全球氣候變暖背景下近50年華南大陸沿海SST變化特征. 山東: 中國海洋大學碩士學位論文, 7—8

孫宗紅, 麥惠欣, 劉志剛等, 2015. 溫度對全緣馬尾藻幼孢子體生長和生理組分的影響. 廣東海洋大學學報, 35(1):51—56

李健鵬, 趙素芬, 孫會強等, 2014. 鹽度對灰葉馬尾藻排卵及幼孢子體早期發(fā)育的影響. 熱帶海洋學報, 33(1): 97-104

楊 彬, 曲元凱, 謝恩義等, 2013. 莫氏馬尾藻有性繁殖和幼孢子體發(fā)育的形態(tài)學觀察. 水產(chǎn)養(yǎng)殖, 34(10): 30—34

肖 為, 陶葉杏, 谷毅鵬等, 2015. 全緣馬尾藻提取物對酵母膏誘導小鼠高尿酸血癥的拮抗效應. 食品工業(yè)科技,36(17): 339—342

張 婧, 2012. 瓦氏馬尾藻與銅藻的室內(nèi)人工培育. 上海: 上海海洋大學碩士學位論文, 13—14

張 婧, 嚴興洪, 章守宇, 2012. 銅藻受精卵的早期發(fā)生與幼孢子體發(fā)育觀察. 水產(chǎn)學報, 36(11): 1706—1716

歐澤奎, 劉東超, 麥銘雄等, 2016. 黑暗條件下連續(xù)性干出對全緣馬尾藻幼孢子體生長和生化成分的影響. 廣東海洋大學學報, 36(1): 44—50

趙素芬, 李海娟, 孫會強等, 2013. 光照強度對灰葉馬尾藻有性生殖和幼孢子體早期生長的影響. 上海海洋大學學報,22(4): 563—570

賈 檉, 楊 彬, 謝恩義等, 2012. 莫氏馬尾藻繁殖生物學初步研究. 水產(chǎn)科學, 31(10): 616—619

徐金根, 2013. 三種馬尾藻繁殖的初步研究. 上海: 上海海洋大學碩士學位論文, 19—20

黃苑媚, 劉志剛, 謝恩義等, 2014. 水流速率對全緣馬尾藻幼孢子體生長和生理活性的影響. 廣東海洋大學學報, 34(6):45—50

曾呈奎, 陸保仁, 2000. 中國海藻志-第三卷, 第二冊-褐藻門,墨角藻目. 北京: 科學出版社, 170—171

Agrawal S C, 2012. Factors controlling induction of reproduction in algae-review: the text. Folia Microbiologica, 57(5):387—407

Brawley S, 1992. Fertilization in natural populations of the dioecious brown alga Fucus ceranoides and the importance of the polyspermy block. Marine Biology, 113(1): 145—157

Fu G, Kinoshita N, Nagasato C et al, 2014. Fertilization of brown algae: Flagellar function in phototaxis and chemotaxis. In:Sawada H, Inoue N, Iwano M eds. Sexual Reproduction in Animals and Plants. Japan: Springer: 359—367

Inoh S, 1932. Embryological Studies on Sargassum and Cystohpyllum. Journal of the Faculty of Science, Hokkaido Imperial University. Ser. 5, Botany, 1(4): 125—133

Jin W H, Zhang W J, Wang J et al, 2014. A study of neuroprotective and antioxidant activities of heteropolysaccharides from six Sargassum species. International Journal of Biological Macromolecules, 67: 336—342

Kam Y L K, Ang P O, 2016. Phenology and experimental evaluation of temperature as a triggering factor for reproduction in Sargassum hemiphyllum. Journal of Applied Phycology, 28(4): 2459—2470

Kerrison P, Le H N, 2016. Environmental factors on egg liberation and germling production of Sargassum muticum.Journal of Applied Phycology, 28(1): 481—489

Ladah L B, Feddersen F, Pearson G A et al, 2008. Egg release and settlement patterns of dioecious and hermaphroditic fucoid algae during the tidal cycle. Marine Biology, 155(6):583—591

Liu W, Wu H Y, Liu M X et al, 2016. Improvement of the zygote utilization and reduction of the seedling loss in the early stage of seedling production of Sargassum thunbergii(Fucales, Phaeophyta). Chinese Journal of Oceanology and Limnology, 34(3): 492—497

Pang S J, Chen L T, Zhuang D G et al, 2005. Cultivation of the brown alga Hizikia fusiformis (Harvey) Okamura: enhanced seedling production in tumbled culture. Aquaculture,245(1—4): 321—329

Pang S J, Gao S Q, Sun J Z, 2006. Cultivation of the brown alga Hizikia fusiformis (Harvey) Okamura: controlled fertilization and early development of seedlings in raceway tanks in ambient light and temperature. Journal of Applied Phycology, 18(6): 723—731

Pang S J, Liu F, Shan T F et al, 2009. Cultivation of the brown alga Sargassum horneri: sexual reproduction and seedling production in tank culture under reduced solar irradiance in ambient temperature. Journal of Applied Phycology, 21(4):413—422

Pantke-B?cker S, Pohnert G, Fischer-Lui I et al, 1995. Synthesis and absolute configuration of desmarestene, the gamete-releasing and gamete-attracting pheromone of the brown algae Desmarestia aculeata and D. firma(Phaeophyceae). Tetrahedron, 51(29): 7927—7936

Pearson G A, Serr?o E A, 2006. Revisiting synchronous gamete release by fucoid algae in the intertidal zone: fertilization success and beyond? Integrative and Comparative Biology,46(5): 587—597

Togashi T, Bartelt J L, Cox P A, 2004. Simulation of gamete behaviors and the evolution of anisogamy: reproductive strategies of marine green algae. Ecological Research, 19(6):563—569

Togashi T, Nagisa M, Miyazaki T et al, 2008. Effects of gamete behavior and density on fertilization success in marine green algae: insights from three-dimensional numerical simulations.Aquatic Ecology, 42(3): 355—362

Wang X Y, Li B H, 2012. Sea surface temperature evolution in the western South China Sea since MIS 12 as evidenced by planktonic foraminiferal assemblages and Globigerinoides ruber Mg/Ca ratio. Science China Earth Sciences, 55(11):1827—1836

Zhang Q S, Tang Y Z, Liu S K et al, 2012. Zygote-derived seedling production of Sargassum thunbergii: focus on two frequently experienced constraints in tank culture of seaweed. Journal of Applied Phycology, 24(4): 707—714

Zou D H, Gao K S, 2005. Regulation of gamete release in the economic brown seaweed Hizikia fusiforme (Phaeophyta).Biotechnology Letters, 27(13): 915—918