金烏賊(Sepia esculenta)繁殖模式的分子學(xué)鑒定*

汪金海 韓 松, 鄭小東①

(1. 中國(guó)海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 青島 266003; 2. 天津耀華中學(xué) 天津 300040)

金烏賊(Sepia esculenta), 俗稱(chēng)烏魚(yú)、墨魚(yú), 隸屬于軟體動(dòng)物門(mén)(Mollusca)、頭足綱(Cephalopoda)、烏賊目(Sepiida), 自日本海到菲律賓群島的 40—100m淺海區(qū)域均有分布(Okutani, 2005)。在我國(guó), 金烏賊廣泛分布于黃海、渤海、東海以及南海海域, 在海洋漁業(yè)中占有重要地位。目前有關(guān)金烏賊的形態(tài)學(xué)(鄭小東等, 2002; 韓松等, 2010)、胚胎發(fā)育(李嘉泳,1965)、人工繁育與營(yíng)養(yǎng)(鄭小東等, 2003; 趙厚鈞等,2004)、增殖放流(郝振林等, 2008)以及遺傳多樣性(Zheng et al, 2007, 2009)等方面已開(kāi)展了諸多研究,但是有關(guān)繁殖方式、交配模式等繁殖行為學(xué)研究鮮有報(bào)道。

近年來(lái), 由于近海環(huán)境惡化和過(guò)度捕撈造成我國(guó)沿海金烏賊資源量銳減。有效維持甚至提高人工繁育群體的遺傳多樣性水平, 避免后代因奠基者效應(yīng)引發(fā)自交衰退, 是水產(chǎn)工作者亟需解決的課題。交配期是頭足類(lèi)繁殖行為的重要時(shí)期, 時(shí)間相對(duì)短暫, 卻具有復(fù)雜的求偶、交配和繁殖策略, 體現(xiàn)了無(wú)脊椎動(dòng)物交配系統(tǒng)和性別決定體系的進(jìn)化趨勢(shì)(Hanlon et al,1996)。動(dòng)物的一雌多雄交配體系, 又稱(chēng)多父本婚配(polyandry), 能夠?yàn)樽哟峁┲T多的遺傳效益(Neff et al, 2005), 顯著影響有效種群數(shù)量(Karl, 2008), 對(duì)于母本的諸多益處主要表現(xiàn)在精子充足, 由于精子競(jìng)爭(zhēng)而產(chǎn)生更優(yōu)質(zhì)后代、獲得更優(yōu)基因以及保障子代具有較高變異以適應(yīng)環(huán)境變化等(Uller et al, 2008)。Sugg等(1994)證實(shí)多雄交配模式使參與繁殖的有效雄性數(shù)量達(dá)到最大化, 從而減緩遺傳變異衰退速度,保持物種遺傳多樣性。Martinez等(2000)研究表明大西洋鮭的多雄交配模式顯著增加了有效群體大小, 防止了近交的快速積累。多父本婚配對(duì)種群遺傳多樣性的積極貢獻(xiàn)在更多海洋貝類(lèi)中得到證實(shí)(Paterson et al,2001; Brante et al, 2011; Lombardo et al, 2012; Xue et al,2014; 楊智鵬等, 2015)。由此可見(jiàn), 動(dòng)物的繁殖策略及方式在維護(hù)種群數(shù)量起到不可替代的作用。

鑒于此, 本文進(jìn)行了金烏賊室內(nèi)繁育, 觀察繁殖行為, 同時(shí)檢測(cè)精子多態(tài)性, 并通過(guò)微衛(wèi)星 DNA標(biāo)記技術(shù)對(duì)親體和幼體進(jìn)行親權(quán)鑒定, 旨在確定金烏賊的繁殖模式, 在人工繁育中有效利用多父本交配的遺傳規(guī)律為漁業(yè)管理提供理論支持, 緩解由于過(guò)度捕撈帶來(lái)的資源枯竭。

1 材料與方法

1.1 成體及幼體樣本

2009 年 5—7 月, 在青島海域(35°N, 119°E)捕獲金烏賊親體 22只, 室內(nèi)圓形水泥池中暫養(yǎng)促熟, 使其交配產(chǎn)卵, 根據(jù)形態(tài)學(xué)判定混養(yǎng)群體中雌性共有 4只(依照死亡先后順序編號(hào)為F1, F2, F8和F18; F1和F2采捕后不久死亡, 未產(chǎn)卵), 雄性18只, 共獲得受精卵1000余粒。受精卵于20—24°C水溫下培育, 經(jīng)30d孵化獲得金烏賊幼體, 隨機(jī)選取87只幼體作為子一代, 將幼體置于 95%酒精中固定, 以備 DNA提取用于親子鑒定。

1.2 精莢采集

從F2個(gè)體口膜下方納精囊處(圖1b)取出粘連在上面的精莢 46個(gè), 分別擠壓精莢, 將其中的精團(tuán)放入1.5mL離心管, 提取DNA。

圖1 金烏賊交配Fig.1 Mating behavior of S. esculenta注: a. 頭對(duì)頭交配; b. 雌體口膜下方納精囊(黑色箭頭示)

1.3 DNA提取和擴(kuò)增

采用CTAB法(Winnepenninckx et al, 1993)從0.1g金烏賊成體腕肌肉提取DNA; 幼體DNA采用Chelex法(Li Q et al, 2003)提取; 精莢DNA首先使用含1%二硫蘇糖醇(DTT)和PK酶的SDS緩沖液消化(Carter et al,2000), 再按照 CTAB法提取 DNA。微衛(wèi)星引物選取Zheng等(2007)的 8個(gè)位點(diǎn)(編號(hào)為 DQ656584,DQ656585, DQ656587—DQ656591, DQ656594)。PCR產(chǎn)物用 6%變性 PAGE電泳, 銀染顯色, 冰醋酸固定,烘干以讀取數(shù)據(jù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

精團(tuán)DNA用8對(duì)微衛(wèi)星引物進(jìn)行擴(kuò)增, PCR反應(yīng)產(chǎn)物通過(guò)PAGE電泳展現(xiàn)。最后對(duì)比得出與雌性交配的雄性的微衛(wèi)星片段長(zhǎng)度, 一個(gè)位點(diǎn)如果發(fā)現(xiàn)二個(gè)以上不同長(zhǎng)度的微衛(wèi)星片段, 那么就有至少2個(gè)雄性金烏賊參與了雌性金烏賊的交配, 從而確定金烏賊的交配方式上是否存在一雌多雄。

同時(shí), 通過(guò)相同的引物對(duì)金烏賊親本和幼體DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)PAGE展現(xiàn),比對(duì)幼體和親本微衛(wèi)星 DNA片段長(zhǎng)度確定親本, 從而判定在受精過(guò)程中是否存在一雌多雄現(xiàn)象。

以分子量標(biāo)記物Marker (10bp DNA Ladder)為標(biāo)準(zhǔn), 利用Labwork4.5軟件(Kumar et al, 2004)完成擴(kuò)增片段大小和基因型讀取。

2 結(jié)果與分析

2.1 親權(quán)鑒定

根據(jù)繁殖行為學(xué)觀察得知, 其中 42個(gè)幼體的母本是F8個(gè)體。通過(guò)對(duì)8個(gè)位點(diǎn)的微衛(wèi)星片段長(zhǎng)度對(duì)比, 發(fā)現(xiàn)其潛在的父本是 M4和 M5(表 1)。32個(gè)幼體是由M4受精的, 占總幼體數(shù)的76.2%, 另外10個(gè)幼體是由M5受精的, 占總幼體數(shù)的23.8%(圖 2), 兩個(gè)雄性均在交配結(jié)束后死亡。另外45個(gè)幼體的母本是F18。通過(guò)對(duì)各個(gè)位點(diǎn)的微衛(wèi)星片段長(zhǎng)度進(jìn)行對(duì)比,發(fā)現(xiàn)潛在父本是M12和M13(表 1)。28個(gè)幼體是由M12受精的, 占總幼體數(shù)的62.2%; 另外17個(gè)幼體是由M13受精的, 占總幼體數(shù)的37.8%(圖2), 兩個(gè)雄性均在交配結(jié)束后死亡。F18產(chǎn)卵孵化出的幼體中, 在Secu75、Secu113兩個(gè)位點(diǎn), 還發(fā)現(xiàn)除M12和M13以外的其他等位基因(“？”表示, 占總幼體數(shù)的2%), 表明可能還存在其他潛在的父本, 由此確定金烏賊在受精過(guò)程中存在一雌多雄現(xiàn)象(圖2)。

圖2 幼體來(lái)自不同受精雄性及在總數(shù)中所占比例Fig.2 The rates of offsprings fathered by alternative males

表1 金烏賊潛在父本在8個(gè)位點(diǎn)基因型Tab.1 The genotypes of putative possible males for 8 loci in the population of S. esculenta

2.2 精子DNA微衛(wèi)星分析

采用8個(gè)微衛(wèi)星DNA位點(diǎn)對(duì)精莢DNA進(jìn)行PCR反應(yīng), 發(fā)現(xiàn)每個(gè)位點(diǎn)存在3個(gè)等位基因, 表明F8個(gè)體與多個(gè)雄性交配, 每次交配的精子會(huì)儲(chǔ)存在納精囊中, 確定金烏賊在交配方式上存在一雌多雄現(xiàn)象。

3 討論

3.1 金烏賊繁殖模式

一雌多雄的交配現(xiàn)象在頭足類(lèi)比較常見(jiàn), 如槍魷類(lèi)的 Loligo bleekeri, L. vulgaris, L. reynaudi, L.pealeii通常與多個(gè)雄性進(jìn)行交配, 導(dǎo)致多重親子關(guān)系(Buresch et al, 2001; Shaw et al, 2004; Iwata et al,2005)。在無(wú)針烏賊Sepiella japonica中也發(fā)現(xiàn)了雌性和多個(gè)雄性進(jìn)行交配的現(xiàn)象(Wada et al, 2006)。雖然Wada等(2005)證實(shí)金烏賊在繁殖期, 雄性和雌性都與兩個(gè)及兩個(gè)以上的異性交配, 存在“多夫多妻制”,但其實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)自行為學(xué)觀察, 而本實(shí)驗(yàn)通過(guò) DNA分子標(biāo)記技術(shù)從親子鑒定和精子多態(tài)性檢測(cè)兩方面相互驗(yàn)證了金烏賊的交配模式。由精子多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果可知, 雌性獲得的精子來(lái)自于非單一雄性個(gè)體,F18產(chǎn)卵孵化出的幼體中, 在 Secu75、Secu113兩個(gè)位點(diǎn), 還發(fā)現(xiàn)了除M12、M13以外的其他等位基因(表1), 可能還存在第三個(gè)潛在的父本, 這與 Naud等(2005)從精子多態(tài)性角度揭示了澳洲烏賊S.apama與2—5個(gè)雄性個(gè)體交配的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合, 也說(shuō)明了從精子探索其交配模式的可行性。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中, 我們觀察到金烏賊“頭對(duì)頭”交配方式(圖 1a), 交配過(guò)程中靜止不動(dòng), 持續(xù)時(shí)間大約2min 43s, Arakawa(1960)等人也觀察到金烏賊以“頭對(duì)頭”方式觸腕相互纏繞交配, 整個(gè)過(guò)程持續(xù)超過(guò) 2min, 除此之外, “頭對(duì)頭”交配方式在無(wú)針烏賊S. japonica (Wada et al, 2006)和烏賊S. officinalis (Hanlon et al, 1999)中也可見(jiàn)到, 但后者交配可持續(xù) 10min。實(shí)驗(yàn)記錄時(shí), 我們根據(jù)父本死亡時(shí)間先后順序編號(hào), M4和 M5是 F8子代的父本,M12和M13是F18子代的父本, M4、M5和M12、M13分別是緊緊相鄰的參與交配受精的雄性, 觀察發(fā)現(xiàn)M4、M5; M12、M13的死亡時(shí)間臨近(M4和M12的死亡時(shí)間分別早于 M5和 M13), 由此推測(cè)雌性金烏賊接受交配的時(shí)間短暫并且集中。

3.2 精子競(jìng)爭(zhēng)行為

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 相對(duì)于M5和M13, M4 (76.2%子代的父本)和M12 (62.2%子代的父本)(圖2)擁有更多的子代, 暗示參與受精的精子大部分來(lái)自于 M4和M12,這可能與精子競(jìng)爭(zhēng)行為有關(guān)。所謂“精子競(jìng)爭(zhēng)”,即兩個(gè)及兩個(gè)以上的雄性的精子爭(zhēng)取和同一卵子受精(Siva-Jothy, 2002), 精子競(jìng)爭(zhēng)行為與很多生物學(xué)因素相關(guān)聯(lián), 如: 繁殖行為、進(jìn)化、行為生理學(xué), 其實(shí)質(zhì)上是一種行為學(xué)現(xiàn)象, 是一種用來(lái)保證自己精子高受精率的繁殖策略(Hanlon et al, 1998)。精子替代是金烏賊的主要精子競(jìng)爭(zhēng)行為, Wada等(2005)室內(nèi)觀察到金烏賊交配前使用第三對(duì)腕刮去雌性口膜納精囊處精子的行為, 但不同于 S. officinalis (Boal, 1997;Hanlon et al, 1999)和 S. apama (Hall et al, 2002)通過(guò)漏斗噴水沖洗殘留的精子。S. japonica也習(xí)慣在受精之前用右四腕移除口膜附近的精子, 但其移除時(shí)間比其他烏賊要短(Wada et al, 2006)。盡管精子移除能夠有效的降低精子競(jìng)爭(zhēng), 但還是存在大量未除凈的精團(tuán), 表明精子移除是不徹底的(Wada et al, 2005),物種選擇完全或部分移除精子依靠生物和生態(tài)變量,比如納精囊的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)和與雌性的交配時(shí)間(Simmons et al, 1998), 金烏賊的精子移除之所以時(shí)間短、不完全, 很可能與其爭(zhēng)取更多的交配時(shí)間、避免競(jìng)爭(zhēng)者打斷交配有關(guān)。

當(dāng)前實(shí)驗(yàn)雖沒(méi)能觀察到雄性移除精子的行為,但交配完的雄性沒(méi)有馬上離開(kāi), 而是逗留在雌性旁邊, 直到雌性產(chǎn)完卵后才離開(kāi), 這屬于交配后對(duì)雌性的臨時(shí)保護(hù), 有利于阻止其他雄性接近, 同時(shí)在保護(hù)期間通過(guò)多次重復(fù)交配增加自身精子儲(chǔ)存在雌體的概率, 有效提高受精率(Hall et al, 2002)。雖然有關(guān)昆蟲(chóng)精子替代的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 最后與雌性交配的雄性是絕大多數(shù)后代的父本, 即“后進(jìn)先出”原則(Waage, 1979; Simmons et al, 1998), 但是烏賊類(lèi)精子替代效應(yīng)尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)中, 雖然 M4(M12)先于M5(M13)與 F8(F18)完成交配, 但前者擁有更多的子代(圖 2), 這并不遵循“后進(jìn)先出”原則, 其主要原因可能是雄性在轉(zhuǎn)移精子至雌性納精囊處, 即刻成功完成受精, 大大降低后來(lái)競(jìng)爭(zhēng)者的影響(Wada et al,2005)。除了常見(jiàn)的精子替代行為, Norman等(1999)還觀察到一種很有趣的精子競(jìng)爭(zhēng)現(xiàn)象, 個(gè)體小的雄性澳洲烏賊偽裝成雌性, 一方面避免參與交配雄性的攻擊, 另一方面可以趁外來(lái)競(jìng)爭(zhēng)者來(lái)襲時(shí)趁機(jī)與個(gè)體較大的雌性交配, 以獲得有效的交配機(jī)會(huì)。

3.3 雌性選擇行為

雌性的選擇行為主要包括對(duì)雄性和精子的選擇,雌性烏賊通過(guò)嗅覺(jué)暗示來(lái)選擇雄性個(gè)體, 或用噴水、噴墨離開(kāi)的方式直接拒絕想要接近的雄性(Boal,1997; Boal et al, 1999)。本實(shí)驗(yàn)中, 雌性金烏賊選取參與受精的精子均來(lái)自納精囊(圖 1), 這與雌性更傾向于利用納精囊精子有關(guān)(Naud et al, 2005; Wada et al,2005)。Naud等(2005)指出澳洲烏賊利用納精囊精子(首先被利用)的頻率是體內(nèi)受精囊精子的 4倍, 這一選擇與這兩個(gè)儲(chǔ)精點(diǎn)的結(jié)構(gòu)和位置有關(guān), 納精囊位分布于口腔邊緣, 較容易利用, 而體內(nèi)受精囊內(nèi)的精子利用時(shí)須通過(guò)孔射出體外, 但當(dāng)納精囊精子的數(shù)量較低時(shí), 受精囊內(nèi)的精子將會(huì)被利用。另外, 雌性隱秘選擇也具有重要作用(Xue et al, 2014)。

4 結(jié)論

本研究首次通過(guò) DNA微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù), 從分子水平上探索了金烏賊的繁殖模式。精子多態(tài)性和親權(quán)鑒定結(jié)果顯示, 金烏賊的交配模式存在一雌多雄。無(wú)論是精子競(jìng)爭(zhēng)還是雌性選擇行為, 都是為了豐富金烏賊多雄的交配模式, 其目的是能獲得高質(zhì)量的可育子代, 從而保證種群的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和遺傳多樣性。因此, 金烏賊存在一雌多雄的交配模式對(duì)保持種群的基因多樣性具有促進(jìn)作用, 較高的等位基因遺傳多樣性對(duì)種群結(jié)構(gòu)和數(shù)量必將起到積極作用(Buresch et al, 2001)。同時(shí), 高頻率的多重親子關(guān)系能夠有效增加種群的規(guī)模和數(shù)量, 為數(shù)量處于變動(dòng)中的種群保持一個(gè)高水平的基因多樣性水平(Zane et al, 1999)。金烏賊種群由于漁業(yè)壓力和環(huán)境因素的影響, 其種群數(shù)量處于不斷的變動(dòng)中, 一雌多雄的繁殖模式是對(duì)進(jìn)化、環(huán)境壓力的適應(yīng), 對(duì)于確保種群數(shù)量和多樣性水平起到關(guān)鍵作用。此外，金烏賊種群中是否存在多雌多雄繁育行為，需要進(jìn)一步觀察和驗(yàn)證。

致謝 青島膠南市海洋與漁業(yè)局王承彬副局長(zhǎng)在實(shí)驗(yàn)場(chǎng)地方面提供了便利, 中國(guó)科學(xué)院海洋研究所薛東秀博士對(duì)本文提出了寶貴意見(jiàn)和建議, 中國(guó)海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院錢(qián)耀森碩士參與了部分實(shí)驗(yàn)工作,謹(jǐn)致謝忱。

李嘉泳, 1965. 金烏賊(Sepia esculenta Hoyle)在我國(guó)黃渤海的結(jié)群生殖洄游和發(fā)育. 見(jiàn): 太平洋西部漁業(yè)研究委員會(huì)第六次全體會(huì)議論文集. 北京: 科學(xué)出版社, 61—92

楊智鵬, 于 紅, 于瑞海等, 2015. 中國(guó)沿海脈紅螺群體遺傳多樣性及其遺傳結(jié)構(gòu). 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 39(10): 1443—1449

鄭小東, 王如才, 2002. 中國(guó)沿海九種頭足類(lèi)齒舌的形態(tài)學(xué).水產(chǎn)學(xué)報(bào), 26(5): 417—422

鄭小東, 楊建敏, 王海艷等, 2003. 金烏賊墨汁營(yíng)養(yǎng)成分分析及評(píng)價(jià). 動(dòng)物學(xué)雜志, 38(4): 32—35

趙厚鈞, 魏邦福, 胡 明等, 2004. 金烏賊受精卵孵化及不同材料附著基附卵效果的初步研究. 海洋湖沼通報(bào), 11(3):64—68

郝振林, 張秀梅, 張沛東等, 2008. 金烏賊熒光標(biāo)志方法的研究. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 32(4): 577—583

韓 松, 鄭小東, 李 琪等, 2010. 金烏賊(Sepia esculenta)精子超微結(jié)構(gòu)和低溫?fù)p傷電鏡觀察. 海洋與湖沼, 41(4):483—488

Arakawa K, 1960. Miscellaneous notes on Mollusca (2): mating and spawning habits of some marine Molluscs. Venus, 21(1):72—78

Boal J G, 1997. Female choice of males in cuttlefish (Mollusca:Cephalopoda). Behaviour, 134(13—14): 975—988

Boal J G, Hylton R A, Gonzalez S A et al, 1999. Effects of crowding on the social behavior of cuttlefish (Sepia officinalis). Contemporary Topics in Laboratory Animal Science, 38(1): 49—55

Brante A, Fernández M, Viard F, 2011. Microsatellite evidence for sperm storage and multiple paternity in the marine gastropod Crepidula coquimbensis. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 396(2): 83—88

Buresch K M, Hanlon R T, Maxwell M R et al, 2001.Microsatellite DNA markers indicate a high frequency of multiple paternity within individual field-collected egg capsules of the squid Loligo pealeii. Marine Ecology Progress Series, 210: 161—165

Carter K L, Robertson B C, Kempenaers B, 2000. A differential DNA extraction method for sperm on the perivitelline membrane of avian eggs. Molecular Ecology, 9(12):2149—2150

Hall K, Hanlon R, 2002. Principal features of the mating system of a large spawning aggregation of the giant Australian cuttlefish Sepia apama (Mollusca: Cephalopoda). Marine Biology, 140(3): 533—545

Hanlon R T, Ament S A, Gabr H, 1999. Behavioral aspects of sperm competition in cuttlefish, Sepia officinalis (Sepioidea:Cephalopoda). Marine Biology, 134(4): 719—728

Hanlon R T, Messenger J B, 1996. Cephalopod Behaviour.Cambridge: Cambridge University Press, 4—8

Iwata Y, Munehara H, Sakurai Y, 2005. Dependence of paternity rates on alternative reproductive behaviors in the squid Loligo bleekeri. Marine Ecology Progress Series, 298: 219—228

Karl S A, 2008. The effect of multiple paternity on the genetically effective size of a population. Molecular Ecology,17(18): 3973—3977

Kumar S, Tamura K, Nei M, 2004. Integrated software for Molecular Evolutionary Genetics Analysis and sequence alignment. Briefings in Bioinformatics, 5: 150—163

Li Q, Park C, Kijima A, 2003. Allelic transmission of microsatellites and application to kinship analysis in newly hatched Pacific abalone larvae. Fisheries Science, 69(5):883—889

Lombardo R C, Takeshita F, Abe S et al, 2012. Mate choice by males and paternity distribution in offspring of triple-mated females in Neptunea arthritica (Gastropoda: Buccinidae).Journal of Molluscan Studies, 78(3): 283—289

Martinez J L, Moran P, Perez J et al, 2000. Multiple paternity increases effective size of southern Atlantic salmon populations. Molecular Ecology, 9(3): 293—298

Naud M J, Shaw P W, Hanlon R T et al, 2005. Evidence for biased use of sperm sources in wild female giant cuttlefish(Sepia apama). Proceedings of the Royal Society B:Biological Sciences, 272(1567): 1047—1051

Neff B D, Pitcher T E, 2005. Genetic quality and sexual selection:an integrated framework for good genes and compatible genes. Molecular Ecology, 14(1): 19—38

Norman M D, Finn J, Tregenza T, 1999. Female impersonation as an alternative reproductive strategy in giant cuttlefish.Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences,266(1426): 1347—1349

Okutani T, 2005. Cuttlefishes and Squids of the World. Tokyo:National Cooperative Association of Squid Processors, 253

Paterson I G, Partridge V, Buckland-Nicks J, 2001. Multiple paternity in Littorina obtusata (Gastropoda, Littorinidae)revealed by microsatellite analyses. The Biological Bulletin,200(3): 261—267

Shaw P W, Sauer W H H, 2004. Multiple paternity and complex fertilization dynamics in the squid Loligo vulgaris reynaudii.Marine Ecology Progress Series, 270: 173—179

Simmons L W, Siva-Jothy M T, 1998. Sperm Competition in Insects: Mechanisms and the Potential for Selection. London:Academic Press, 341—434

Siva-Jothy M T, 2002. Sperm competition and its evolutionary consequences in the insects. Nature, 417(6885): 122

Sugg D W, Chesser R K, 1994. Effective population sizes with multiple paternity. Genetics, 137(4): 1147—1155

Uller T, Olsson M, 2008. Multiple paternity in reptiles: patterns and processes. Molecular Ecology, 17(11): 2566—2580

Waage J K, 1979. Dual function of the damselfly penis: sperm removal and transfer. Science, 203(4383): 916—918

Wada T, Takegaki T, Mori T et al, 2005. Sperm displacement behavior of the cuttlefish Sepia esculenta (Cephalopoda:Sepiidae). Journal of Ethology, 23(2): 85—92

Wada T, Takegaki T, Mori T et al, 2006. Reproductive behavior of the Japanese spineless cuttlefish Sepiella japonica. Venus,65(3): 221—228

Winnepenninckx B, Backeljau T, De Wachter R, 1993. Extraction of high molecular weight DNA from molluscs. Trends in Genetics, 9(12): 407

Xue D X, Zhang T, Liu J X, 2014. Microsatellite evidence for high frequency of multiple paternity in the marine gastropod Rapana venosa. PLoS One, 9(1): e86508

Zane L, Nelson W S, Jones A G et al, 1999. Microsatellite assessment of multiple paternity in natural populations of a live-bearing fish, Gambusia holbrooki. Journal of Evolutionary Biology, 12(1): 61—69

Zheng X D, Ikeda M, Barinova A et al, 2007. Isolation and characterization of microsatellite DNA loci from the golden cuttlefish, Sepia esculenta Hoyle (Cephalopoda). Molecular Ecology Resources, 7(1): 40—42

Zheng X D, Ikeda M, Kong L F et al, 2009. Genetic diversity and population structure of the golden cuttlefish, Sepia esculenta(Cephalopoda: Sepiidae) indicated by microsatellite DNA variations. Marine Ecology, 30(4): 448—454