TRPC6、α-actinin-4在阿霉素腎病大鼠腎組織的表達差異及意義

杜 宇，史應(yīng)進，張艷輝，賈妮亞，范俊英，王彩麗*

（包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 包頭 014010）

足細胞是維持腎小球基底膜（GBM）結(jié)構(gòu)和功能正常的主要細胞之一。而TRPC6、α-actinin-4又是維持足細胞正常結(jié)構(gòu)和功能的主要蛋白，因為足細胞不可再生的特性，它的損傷導(dǎo)致并增加了蛋白尿的發(fā)生[1]，進一步加劇腎小球的硬化，。阿霉素有非常強烈的細胞毒性作用，可以直接對腎細胞產(chǎn)生損傷，其機制可能是從DNA水平干預(yù)了足突細胞蛋白的合成，從而破壞足突細胞的結(jié)構(gòu)，改變了足突細胞形態(tài)[2]。因此目前被公認的能較好模擬人類腎小球疾病的動物模型就是阿霉素腎病大鼠模型，該模型的病理類型為微小病變（MCD）和局灶節(jié)段性腎小球硬化（FSGS）。本文通過分析TRPC6、α-actinin-4在大鼠正常腎組織和阿霉素腎病大鼠不同病理類型腎組織的表達差異，以探討該分子在蛋白尿發(fā)生中的可能作用及相互關(guān)系。

1 材料余方法

1.1 材料

健康雄性SD大鼠30只，體重200 g左右（內(nèi)蒙古大學(xué)動物中心提供，合格證號：SCX（蒙）2002-0001）。鹽酸阿霉素（山西普德制藥10 mg/支）。兔抗鼠α-actinin-4多克隆抗體：兔抗鼠TRPC6多克隆抗體（濃縮型）100 ug/mL MAB1682美國Chemicon公司。SP試劑盒（北京博奧森）。DAB顯色系統(tǒng)（福州邁新）。

1.2 模型建立及分組

實驗大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨即分為3組：正常對照組（n=10）、微小病變組（MCD組，n=10）、局灶節(jié)段性腎小球硬化組（FSGS組，n=10）。MCD組測定24小時尿蛋白定量、血清白蛋白、總膽固醇、肌酐，在非麻醉狀態(tài)下尾靜脈一次性注射鹽酸阿霉素7.5 mg/kg，并于注射后第7天和第14天分別測定24小時尿蛋白定量、血清白蛋白、總膽固醇、肌酐，第14天處死對大鼠的腎組織制備成蠟塊備用。FSGS組大鼠測定24小時尿蛋白定量、血清白蛋白、總膽固醇、肌酐，在非麻醉狀態(tài)下第7天尾靜脈注射阿霉素5 mg/kg，第14天尾靜脈注射阿霉素2.5 mg/kg，注射后28天和56天分別測定24小時尿蛋白定量、血清白蛋白、總膽固醇、肌酐，第56天處死對大鼠的腎組織制備成蠟塊備用。

1.3 免疫組化

石蠟切片脫蠟水化，采用SP法免疫組化試劑盒，檢測TRPC6、α-actinin-4。

1.4 影響采集

用Olympus DP72攝象頭及DP-BSW采集圖像，利用Image Pro Plus 6.0（IPP6.0）圖像分析軟件，分別測定每個腎小球中TRPC6、α-actinin-4陽性面積占其整個腎小球面積的比。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，多組間的比較采用單因素方差分析，計量資料以“±s”表示。

2 結(jié) 果

2.1 TRPC6

TRPC6在微小病變表達水平較對照組顯著增多（P＜0.01），在局灶節(jié)段性腎小球硬化腎小球內(nèi)的的表達水平較對照組顯著增多（P＜0.01），TRPC6在局灶節(jié)段性腎小球硬化組中增多較微小病變組更加顯著（P＜0.01）。

表1 TRPC6在不同病理類型大鼠腎小球的表達對比（n，%）

2.2 α-actinin-4

α-actinin-4在微小病變組表達增加（P＜0.01），而在局灶節(jié)段性腎小球硬化組表達與對照組無明顯差異。見表2。

表2 α-actinin-4在不同病理類型大鼠腎小球的表達對比（n，%）

2.3 TRPC6，α-actinin-4的表達

對照組TRPC6，α-actinin-4兩者的表達無差異（P＞0.05），而腎小球內(nèi)者的表達呈負相關(guān)（R=-0.633，P＜0.01），隨著TRPC6的表達增加，α-actinin-4的表達減弱。見表3、圖1。

表3 TRPC6、α-actinin-4的表達相關(guān)性

圖1 TRPC6與α-actinin-4表達相關(guān)趨勢圖

3 討 論

足細胞是一種增殖能力及其有限的終末分化細胞，具有穩(wěn)定的表型[3]，它是維持GBM結(jié)構(gòu)和功能正常的主要細胞之一。因為足細胞不可再生的特性，它的損傷導(dǎo)致并增加了蛋白尿的發(fā)生[4]，進一步加劇腎小球的硬化[5-6]。

足細胞正常功能及結(jié)構(gòu)需要幾個主要蛋白的相互作用[7]，而當足細胞受損時，足細胞的足突間裂孔隔膜（SD）功能和結(jié)構(gòu)會發(fā)生改變，這些主要結(jié)構(gòu)蛋白的改變引起了其結(jié)構(gòu)以及功能失調(diào)，從而造成腎小球足細胞的功能和結(jié)構(gòu)的改變，蛋白從改變的足細胞中漏出引起了蛋白尿。進一步的研究顯示[8-9]，TRPC6編碼的蛋白與足細胞的骨架蛋白actin（肌動蛋白）有著非常緊密的聯(lián)系。在體外培養(yǎng)成熟的足細胞，當其發(fā)生TRPC6蛋白的過度表達，actin纖維就會發(fā)生大量的解聚，從而使裂孔隔膜結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。TRPC6基因突變可使足細胞內(nèi)鈣離子增加從而引起增殖減少、細胞凋亡進而減少足細胞的數(shù)量。

目前關(guān)于TRPC6，α-actinin-4的相關(guān)性研究還很少，國外未見相關(guān)報道，國內(nèi)僅孫希峰[10]等做過兩者的相關(guān)性研究。本研究顯示，在對照組TRPC6，α-actinin-4兩者的表達無差異（P＞0.05），而發(fā)生病變的腎小球內(nèi)兩者的表達呈負相關(guān)（R=-0.633，P＜0.01）隨著TRPC6的表達增加α-actinin-4的表達減弱，與孫希峰等人的研究結(jié)果相似，這可能與TRPC6高表達通過使細胞內(nèi)鈣離子濃度升高、直接影響肌動蛋白支架以及組成機械敏感性鈣離子通道引起足細胞的損傷和脫落，致使足細胞數(shù)量減少，而α-actinin-4做為足細胞的骨架蛋白從而表達數(shù)量減少以及TRPC6蛋白過度表達時，actin纖維大量解聚，裂孔隔膜結(jié)構(gòu)松散而導(dǎo)致α-actinin-4表達下降。

TRPC6與α-actinin-4作為重要的構(gòu)成足細胞蛋白分子其作用機制目前仍未背完全闡明，而探討不同病理類型兩者的表達差異進一步探討TRPC6和α-actinin-4的相關(guān)性，以及其在足細胞損傷中的作用，希望給臨床診斷、治療效果及預(yù)后的判斷提供有價值、無創(chuàng)的工具。期望早期對TRPC6、α-actinin-4的活性進行干預(yù)來減少對蛋白尿患者足細胞的損傷，延緩腎衰竭的進展。

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[2] 張麗芬,黃文政,朱小棣,等.阿霉素腎病腎小球硬化動物模型的研究[J].中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志,2005,6(4):195-199.

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