腈水解酶在醫(yī)藥中間體合成方法研究

薛 誼

（江蘇省科學(xué)技術(shù)協(xié)會(huì)，紅太陽(yáng)集團(tuán)有限公司，江蘇 南京 210047）

在二十世紀(jì)六十年代全球第一個(gè)植物腈水解酶在大麥葉中被發(fā)現(xiàn)，隨后在惡臭假單胞菌中發(fā)現(xiàn)細(xì)菌腈水解酶。這半個(gè)世紀(jì)以來(lái)各種各樣的腈水解酶被不斷發(fā)現(xiàn)，例如細(xì)菌、絲狀真菌、植物等各種各樣不同的元素中。在微生物中腈水解酶發(fā)現(xiàn)最廣，而且在工業(yè)上操作簡(jiǎn)單，發(fā)酵的產(chǎn)量越來(lái)越大。腈水解酶按種類可分為：脂肪腈水解酶、芳香腈水解酶和芳基乙腈水解酶。腈水解酶具有多樣性，因此適用極其廣泛，無(wú)論在工業(yè)、農(nóng)業(yè)還是生物學(xué)中，都能應(yīng)用到腈水解酶。除了上述領(lǐng)域，腈水解酶在醫(yī)學(xué)中應(yīng)用也較多，利用腈水解酶能夠有效合成醫(yī)藥中間體，本文對(duì)合成方法進(jìn)行研究。首先分析了如何利用腈水解酶催化醫(yī)藥中間體，然后根據(jù)催化結(jié)果利用腈水解酶合成醫(yī)藥中間體。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)利用腈水解酶能夠極好地合成醫(yī)藥中間體，對(duì)醫(yī)學(xué)有重大貢獻(xiàn)[1]。

1 利用腈水解酶催化醫(yī)藥中間體

利用腈水解酶催化能夠有效催化醫(yī)藥中間體，雖然傳統(tǒng)方法都是利用野生菌游離細(xì)胞或其純化酶作為催化劑，但是隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，現(xiàn)代醫(yī)藥對(duì)催化劑的要求越來(lái)越高，睛水解酶作為一種生物催化劑，分為天然酶和基因工程酶兩種，這二者以不同的形式存在，來(lái)源也有很大的不同。近年來(lái)腈水解酶的生物催化技術(shù)發(fā)展越來(lái)越迅猛，利用腈水解酶催化醫(yī)藥中間體得到的產(chǎn)品藥性溫和，藥效極好。這些成就在眾多文獻(xiàn)都有所記載，而且相關(guān)學(xué)者對(duì)其的研究也越來(lái)越多。腈水解酶到醫(yī)藥中間體中主要的化合物有：毗嚨甲酸、扁桃酸及其衍生物、單睛單酸以及藥用氨基酸等[2]。

催化的酸分為煙酸、異煙酸和2-吡啶甲酸三種同分異構(gòu)體，這是人體內(nèi)部必需要用到的維生素，將煙酸其合成在藥物中間體中能夠有效治療各種皮膚病，異煙酸能夠緩解高血壓和冠心病的等癥狀，除了煙酸和異煙酸之外，還有2-吡啶甲酸，2-吡啶甲酸能夠促進(jìn)催化效果，進(jìn)而合成抗結(jié)核藥物的中間體，這不僅能降低糖尿病患者的血糖水平，也能防止心腦血管疾病的出現(xiàn)。三種同分異構(gòu)體的酸性物質(zhì)的作用如下表1所示[3]：

表1 不同酸的催化效果

利用腈水解酶催化醫(yī)藥中間體首先要將3-肼基吡啶轉(zhuǎn)化成鹽酸，再以游離細(xì)胞中的玫瑰紅球菌去催化，在環(huán)境溫度為250℃，pH酸堿度為8的環(huán)境下將催化后的試劑混合振動(dòng)，在42 h內(nèi)12次過(guò)濾底物，最后得到150 g/L～200 g/L的煙酸，除了紅球菌外，還有假單胞菌、諾卡氏菌、芽胞桿菌、鐮刀菌、曲霉菌、赤霉菌等各類不同菌屬，這些不同的菌種對(duì)于幫助煙酸的合成有很大的好處。催化效果極好，產(chǎn)物收率超過(guò)90%，藥性較高，沒(méi)有過(guò)多的副作用，因此市場(chǎng)前景也很廣闊。

2 利用腈水解酶合成醫(yī)藥中間體

在催化醫(yī)藥中間體后，要利用腈水解酶合成醫(yī)藥中間體，首先要使用腈水解酶對(duì)大腸桿菌中的基因進(jìn)行重組，然后對(duì)敏捷食酸菌的編碼基因進(jìn)行重組，需要特別指出的是，腈水解酶除了具有較強(qiáng)的選擇性外，也具有極高的水解特異性，能夠改造其中的蛋白質(zhì)，同時(shí)增強(qiáng)催化劑的穩(wěn)定性，保證細(xì)胞重復(fù)利用。以輕基乙睛為底物篩選得到野生酶，然后對(duì)合成體外的細(xì)胞進(jìn)行固定化操作，平均每1 g細(xì)胞催化劑產(chǎn)率要達(dá)到1010酸，固定化細(xì)胞要重復(fù)利用達(dá)到300批次以上，然后對(duì)初始以及最終的產(chǎn)率進(jìn)行計(jì)算。在后續(xù)過(guò)程也要不停的使用蛋白質(zhì)重組醫(yī)藥中間體，通過(guò)反復(fù)重組提高酶的活性[4]。

在合成煙酸后還要合成異煙酸，能夠合成異煙酸的菌種較少，目前比較常用的是利用游離細(xì)胞中的小球諾卡氏菌批次流加轉(zhuǎn)化合成異煙酸，在環(huán)境溫度為520℃，pH酸堿度為12的環(huán)境下將催化后的試劑混合振動(dòng)，在18 h內(nèi)分批進(jìn)行底物合成，每隔20 min增加200 mM底物，18 h后合成100 g/L～150 g/L的異煙酸熒光假單胞菌將細(xì)胞解酶合成異煙酸，需要特別指出的是細(xì)胞懸液酶中得到霉菌指數(shù)要在60%左右。合成異煙酸后可直接催化醫(yī)藥中間體，通過(guò)選擇性強(qiáng)的腈水解酶拆分外消旋扁桃酸，合成單一對(duì)映體扁桃酸，再利用正丁腈去催化細(xì)胞外的消旋扁桃睛從而生成偏桃酸[5]。

合成的醫(yī)藥中間體游離細(xì)胞與內(nèi)部細(xì)胞可以相互結(jié)合，具有較高的特異性，二者可互相催化，選擇性互相反應(yīng)，從而形成化學(xué)效應(yīng)，高立體選擇性腈水解酶確保了催化過(guò)程的魯棒性。這種合成后的醫(yī)藥中間體在醫(yī)藥領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用，例如頭抱菌素、血管緊張膚轉(zhuǎn)化酶抑制劑、抗肥胖藥物及抗腫瘤藥物等都會(huì)應(yīng)用到合成的醫(yī)藥中間體。合成過(guò)程如下圖1所示：

圖1 腈水解酶合成醫(yī)藥中間體過(guò)程

分析圖1可知，在利用腈水解酶合成醫(yī)藥中間體時(shí)，共分為6步，分別為：催化合成醫(yī)藥體、腈水解酶合成煙酸、重組基因、腈水解酶合成異煙酸、內(nèi)外細(xì)胞結(jié)合和判斷副作用6步，催化合成醫(yī)藥體為過(guò)程的基礎(chǔ)步驟，必須要對(duì)醫(yī)藥體中間體進(jìn)行催化，才能保證后續(xù)過(guò)程正常進(jìn)行；然后合成煙酸，通過(guò)合成的煙酸重組基因，以便于進(jìn)一步合成異煙酸，在合成異煙酸后將結(jié)合的醫(yī)藥中間體內(nèi)外細(xì)胞結(jié)合到一起，最后對(duì)合成的醫(yī)藥中間體的副作用進(jìn)行判斷。利用合水檢測(cè)法檢測(cè)是否有副作用，如果有副作用，那么合成的醫(yī)藥中間體不能使用，如果檢測(cè)結(jié)果通過(guò)，則證明醫(yī)藥中間體可以正常使用[6]。

3 結(jié)束語(yǔ)

通過(guò)本文的探討分析可以了解到腈水解酶在工業(yè)、農(nóng)業(yè)還是生物學(xué)中都有廣泛的應(yīng)用。近年來(lái)更是不斷滲入到醫(yī)學(xué)方面，在使用腈水解酶合成醫(yī)藥中間體的合成時(shí)，分析了如何利用腈水解酶催化醫(yī)藥中間體，根據(jù)催化結(jié)果合成醫(yī)藥中間體。通過(guò)研究證明將腈水解酶應(yīng)用到醫(yī)藥中，能夠有效合成醫(yī)藥中間體，提高醫(yī)療效果，合成的醫(yī)藥中間體具有藥性溫和，效果更好的特點(diǎn)。

[1] 龔勁松,李恒,陸震鳴,等.腈水解酶在醫(yī)藥中間體生物催化研究中的最新進(jìn)展[J].化學(xué)進(jìn)展,2015,27(4):448-458.

[2] Cantarella,劉艷,胡又佳.在間歇式和連續(xù)式攪拌膜反應(yīng)器中利用脫酰胺酶催化生產(chǎn)煙堿酸[J].中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志,2008(7):526-526.

[3] 聶雅潔,鄭仁朝,柳志強(qiáng),等.擬南芥腈水解酶催化合成普瑞巴林中間體(S)-3-氰基-5-甲基己酸[J].精細(xì)與專用化學(xué)品,2014, 22(5):19-23.

[4] 林志堅(jiān),鄭仁朝,樓億圓,等.草甘膦化學(xué)合成工藝及其中間體的生物法合成技術(shù)展望[J].農(nóng)藥,2009,48(8):547-551.

[5] 聶雅潔,鄭仁朝,柳志強(qiáng),等.擬南芥腈水解酶催化合成普瑞巴林中間體(S)-3-氰基-5-甲基己酸[J].精細(xì)與專用化學(xué)品,2014,22(5):19-23.

[6] 聶雅潔,鄭仁朝,柳志強(qiáng),等.擬南芥腈水解酶催化合成普瑞巴林中間體(S)-3-氰基-5-甲基己酸[J].精細(xì)與專用化學(xué)品,2014,22(5):19-23.