金黃色葡萄球菌小菌落突變株所致相關感染的研究進展

宋 娟

小菌落突變株（small colony variants，SCV）是一種具有獨特表型 （生長率低、菌落形態(tài)不規(guī)則以及生化特性異常）及致病特征，且生長緩慢的細菌亞群。自1910年Jacobsen首次在傷寒埃伯澤菌株中發(fā)現SCV現象以來，人們陸續(xù)發(fā)現許多細菌如表皮葡萄球菌、銅綠假單胞菌、洋蔥伯克霍爾德菌、羊布魯桿菌、大腸埃希菌及淋病奈瑟菌等都具有形成這種SCV的能力。1957年，Jensen[1]首次報道了金黃色葡萄球菌SCV（金葡菌，SASCV）。20世紀90年代中期，人們在研究中發(fā)現臨床許多慢性和復發(fā)性感染與SASCV的獨特表型關系密切[2]，此后國外學者們對SASCV的研究越來越廣泛深入，但國內的研究極少。本文對SASCV的形成機制、臨床相關感染、診斷和治療進行闡述。

1 SASCV形成機制

目前研究認為，SASCV臨床分離株多數是由于呼吸作用時合成能量不足所致，主要表現為與呼吸鏈相關的兩種特異營養(yǎng)缺陷類型，即電子傳遞鏈缺陷型和胸腺嘧啶脫氧核苷合成缺陷型。前者又分為甲萘醌營養(yǎng)缺陷型和血紅素營養(yǎng)缺陷型，主要表現為甲萘醌或血紅素缺陷。該類SASCV的產生與氨基糖苷類抗菌藥物的使用密切相關。不論體內外，在氨基糖苷類藥物存在的情況下，金葡菌形成SCV的概率均顯著提高。胸腺嘧啶脫氧核苷（TD）合成缺陷型SASCV（TDSASCV）是金葡菌對外源胸腺嘧啶脫氧核苷吸收受阻所致，主要見于長期應用甲氧芐啶-磺胺甲唑（SXT）等磺胺類藥物的病例，該類藥能夠阻止四氫葉酸的合成，而后者是胸腺嘧啶核苷酸合成酶的一個輔基。此外，還存在其他類型如CO2營養(yǎng)缺陷型和營養(yǎng)缺陷不明的SASCV分離株。而SASCV臨床分離株有時可表現為多種營養(yǎng)缺陷共存。

因SASCV與其親本株可同時出現，而SASCV可以快速回復成野生株表型，且這種轉化在體內外均可進行，故近年來人們又提出SCV的發(fā)生與金葡菌發(fā)生基因突變有關。目前，已經報道多種基因（ctaA、menB、menD、hemA、hemB、hemH、mutS、fusA、thyA）的突變均能導致金葡菌出現SASCV表型[3]。

2 SASCV相關臨床感染性疾病

早期研究發(fā)現，一些非特異性吞噬細胞如內皮細胞、上皮細胞、成纖維細胞、造骨細胞、角質化細胞可有效吞噬金葡菌。被吞噬的為正常金葡菌時，內吞作用可迅速破壞裂解細菌胞體。近年研究發(fā)現[4]，SASCV比相應的野生株更能持續(xù)存活于細胞中，同時細胞對SCV的內吞作用可使SCV免受宿主防御系統(tǒng)和抗菌藥物的攻擊。而當宿主細胞形成應激的保護性環(huán)境時，SCV就會引起隱性或復發(fā)性感染。迄今為止，SASCV對慢性感染疾病的重要意義已達成共識，臨床上已報道與SASCV有關的感染多種多樣，主要見于以下幾大類疾病。

2.1 髖假體關節(jié)感染

髖假體關節(jié)感染（PJI）是全髖關節(jié)置換術后一個嚴重并發(fā)癥。金葡菌是最重要的感染病原菌之一，尤其是耐甲氧西林金葡菌（MRSA）為PJI治療失敗的因素之一。有研究發(fā)現，持續(xù)和復發(fā)性的假體關節(jié)感染多與SASCV密切相關。Sendi等[5]在一項為期4年的研究中發(fā)現， 83例PJI患者中有5例（6%）在關節(jié)抽吸物和術中組織標本中培養(yǎng)出SASCV。這些患者在檢出SCV之前存在血流感染史、長期抗生素應用史、髖關節(jié)翻修術等情況。此外，值得注意的是，1例患者外周組織的透射電鏡圖像顯示在成纖維細胞內可見細菌。由于該例患者的SASCV是從滑膜組織標本中培養(yǎng)出來的，故研究者推測這些細胞內的細菌很有可能是SASCV，支持了上述假說，即SCV在細胞內隱藏，逃離宿主防御系統(tǒng)和抗生素的攻擊，從而導致復發(fā)性感染。Tande等[6]研究了113例葡萄球菌感染的PJI病例，發(fā)現38例與SCV有關，其中SASCV10例（26.3%），其他為表皮葡萄球菌SCV23例，頭狀葡萄球菌SCV2例和路鄧葡萄球菌SCV3例。與沒有SCV檢出的PJI患者相比，SCV患者有較長的假體關節(jié)植入史，與上一次手術間隔時間較長，且PJI的臨床癥狀持續(xù)存在。大部分患者以前因PJI做過手術，而更多的SCV患者在過去6個月內至少接受了120 d 的抗生素治療。該研究還指出，金葡菌PJI患者出現治療失敗的可能性會是非金葡菌感染患者的4倍，但PJI治療失敗是否為SCV感染所致沒有發(fā)現不同。Sendi等[5]則指出，不管是SCV還是正常金葡菌所致的持續(xù)PJI，在基于MIC值選擇抗菌藥物治療的同時，建議盡快（6～8周以內）移除外來裝置。

2.2 慢性骨感染

慢性骨感染具有經久不愈的骨內死腔、深達骨質感染、時發(fā)時愈的慢性竇道及大量炎性瘢痕形成的特點，治療不易徹底、反復遷延不愈、根治困難。1995年，Proctor等[2]自5例慢性骨和/或關節(jié)感染患者的組織標本中培養(yǎng)出了SASCV，且營

養(yǎng)缺陷類型各不相同，涉及甲萘醌、血紅素和CO2營養(yǎng)缺陷型。臨床數據顯示，這些患者對抗生素治療方案反應不佳，故認為葡萄球菌慢性骨感染與SCV的形成密切相關。就骨感染而言，局部慶大霉素治療經常被使用，而von Eiff 等[7]在慢性骨髓炎患者局部慶大霉素治療暴露的位置發(fā)現了甲萘醌或血紅素營養(yǎng)缺陷型SASCV的生長，隨后又通過體外慶大霉素的誘導試驗誘導出了SCV，從而提出甲萘醌或血紅素營養(yǎng)缺陷型 SASCV的出現可能與氨基糖苷類抗菌藥物的使用有關。他們還發(fā)現，盡管SASCV體外慶大霉素的藥敏試驗判讀為敏感，但其MIC值卻高于親代菌株32倍以上，提示SASCV對氨基糖苷類的敏感性在降低，Baltch等[8]和 Maduka-Ezeh等[9]研究也證實了這一點。對慢性骨髓炎患者SASCV存在位置的研究，Kalinka等[10]指出金葡菌可以通過表達黏附素黏附在骨基質上，或進入成骨細胞內，在感染的急性期借助骨組織的庇護逃避機體免疫系統(tǒng)和外來抗菌藥物的攻擊，之后再逐漸形成SCV啟動新的感染。Lew等[11]認為SASCV存在于死骨碎片內，指出慢性骨髓炎患者因血供不足極易形成死骨碎片，金葡菌躲藏在死骨碎片里，抗菌藥物或機體免疫系統(tǒng)很難作用到死骨碎片中的細菌，這種情況迫切需要外科手術來清除感染。而Archer等[12]和Mitchell等[13]在研究中指出，死骨碎片可能是金葡菌生物膜形成的最佳基礎。形成生物膜的細菌表現出更強的耐藥性，其感染易慢性化并難以控制，進而促進了SCV的發(fā)展。

2.3 囊性纖維化呼吸道感染

囊性纖維化（CF）是一種外分泌腺功能紊亂的遺傳性疾病， 好發(fā)于歐美白色人種，可累及呼吸、消化、內分泌、生殖等多個系統(tǒng)。其中反復急進性的肺部感染為其主要的致死原因。CF患者的呼吸道提供了一個獨特的生態(tài)環(huán)境：嗜中性粒細胞的吞噬、缺氧、與同時感染的微生物競爭，以及抗生素選擇壓力，這就導致了各種形式的細菌適應，包括SCV的出現[14]。Sparham等[15]最早在CF患者痰標本中檢出TD-SASCV，并提出TDSASCV感染可能與SXT的治療有關。隨后Gilligan等[16]在對200例CF患者進行的研究中發(fā)現有20例（10%）培養(yǎng)出了TD-SASCV，這些患者均有長期的SXT治療史（至少30.9個月），且所有TDSASCV菌株的體外藥敏試驗顯示對SXT都耐藥。Kahl等[17]在對28例金葡菌呼吸道感染的CF患者進行分析時發(fā)現，有19例患者長達31個月都分離出SCV，提示SCV比同源的正常金葡菌更能持續(xù)地存在于真核細胞內。研究亦發(fā)現大多數的SCV都是胸苷依賴型或血紅素-胸苷依賴型，SXT的使用與TD-SASCV的出現之間存在關聯關系。而Besier等[18]、Schneider等[19]和Wolter等[20]在研究中除發(fā)現CF呼吸道感染患者SASCV流行率高，大多數SCV為胸苷依賴型，且與SXT長期使用相關外，均指出相比正常金葡菌感染，SCV感染的患者年齡較大，且多與銅綠假單胞菌合并感染，患者的肺功能也會有更大的下降。Green等[21]還對SCV出現與CF患者阿奇霉素長期使用的關聯性進行了為期6個月的研究。開始時260例CF患者中4.1%發(fā)現了SASCV，6個月后金葡菌對大環(huán)內酯類抗菌藥物的耐藥率顯著增加。但并沒有新的SCV出現，結果似乎提示二者并無關聯。然而，以往的研究中SXT誘導和選擇出TD-SASCV多在使用SXT 1年之后，6個月的阿奇霉素治療似乎對于SCV的出現來說太短了，可能需要進一步延長觀察時間。迄今為止，還沒有任何關于大環(huán)內酯類藥物治療與SCV出現的關聯報道。

2.4 其他感染

2.4.1 心臟相關植入物的感染 與心臟相關的外來異物主要指植入電子裝置[（如永久性心臟起搏器、左心心室輔助裝置（LVAD）]和各種人工瓣膜，隨著這些植入物的使用增加，引發(fā)的感染亦呈上升趨勢。盡管葡萄球菌是導致這些感染最常見的的病原體，但目前關于SASCV引發(fā)相關感染報道并不多，主要見于起搏器相關感染[22]和LVAD

相關感染[23]，而近期關于金葡菌引發(fā)人工瓣膜感染性心內膜炎的多中心報道并沒有提到SCV的流行[24]。因金葡菌容易黏附在醫(yī)療植入物或組織表面形成生物膜而致生物膜相關性疾病，故無論是何種金葡菌感染，盡快手術移除感染的外來裝置才是控制感染的關鍵所在。

2.4.2 皮膚、黏膜和軟組織感染 關于葡萄球菌SCV可能是皮膚或黏膜感染病原菌的研究近年來亦有報道。von Eiff等[25]在28個月的時間內反復從1例毛囊角化病（一種基因性皮膚?。┗颊叩钠つw標本中檢出SASCV，且發(fā)現，分離出的SASCV能被體外培養(yǎng)的HaCaT細胞（一種角質形成細胞）吞噬且持續(xù)存在，抗菌藥物很難清除。另一例疝修補術患者，術后13個月出現了皮下膿腫破潰，竇道形成等慢性肉芽腫性炎癥表現，病原學培養(yǎng)出一種甲萘醌-血紅素營養(yǎng)缺陷型SASCV[26]。1例AIDS患者因車禍導致偏癱后反復發(fā)作髖部膿腫，病原學檢出了MRSA-SCV，在采取肌內注射治療髖部膿腫2個月后，仍從血培養(yǎng)、膿腫液培養(yǎng)中檢出SCV。最后患者死亡，尸檢標本也檢出SCV，最終確定為TD-SASCV菌株[27]。von Eiff等[28]對125例AIDS患者進行了鼻腔黏膜金葡菌攜帶情況的調查，發(fā)現32%患者（40例）鼻腔攜帶金葡菌。盡管40例中只有3例（2.4%）是SASCV，但研究指出AIDS患者鼻腔內SCV的定植極有可能是嚴重感染的來源，這有待進一步研究。

3 SASCV感染的診斷

對于普通臨床實驗室而言，SCV不尋常的生理、代謝和形態(tài)特征的鑒別具有難度，不但難以識別，而且更難復原和存儲。但是，發(fā)現和報告SCV對于臨床醫(yī)師來說非常重要。因為它們是一種慢性感染的指示，作為特定治療依據。對SASCV感染診斷可從以下幾方面入手。

3.1 選擇高質量標本

對于CF患者來說，可使用合格痰標本進行培養(yǎng)；對于其他相關感染，建議送檢關節(jié)抽出物、術中組織樣本、活檢標本或液體標本等，應杜絕拭子標本。如果假體裝置或骨骼被移除，對其進行超聲震蕩處理則能提高SCV的檢出率[29]。

3.2 培養(yǎng)和鑒定

仔細處理標本和選擇合適的瓊脂平皿進行培養(yǎng)是SCV診斷的先決條件。葡萄球菌SCV在哥倫比亞血平皿上空氣和二氧化碳環(huán)境中均能生長，使用葡萄球菌選擇性培養(yǎng)基或顯色培養(yǎng)基反而不生長或生長不良，故首選哥倫比亞血平皿。SCV通常在24 h以后，大約48～72 h才能在固體培養(yǎng)基上肉眼可見。其菌落細小，約為親代正常菌株的1/10，多呈針尖樣（TD-SCV可表現出一種不同尋常的“荷包蛋”樣菌落），無色素或色素生成明顯減少，缺失或β-溶血能力下降，容易被誤認為是生長緩慢的棒狀桿菌或非溶血性的鏈球菌。此外，它們經常與親代菌株混合生長，表型并不穩(wěn)定，極易恢復正常表型。由于SCV生長緩慢，代謝變化大，經典生化反應缺失或減少，過氧化氫酶、凝固因子、凝血酶反應或其他用于識別的反應也被延遲或缺如，因此，所有基于生化過程的鑒定方法在SCV中都不可靠，目前主要依靠PCR和基因測序技術。已被證實為金葡菌識別的分子指標如nuc、clfA、eap、coa、sodM等也能很好地識別SASCV[30]。對于正常的葡萄球菌表型，16S rRNA特別是rpoB基因序列，對于最終確定種和亞種非常有用。然而，鑒定葡萄球菌SCV，必須考慮已知公共序列數據庫的局限性[31]。

3.3 藥敏試驗

由于SCV的低生長率和低代謝率，各種常規(guī)方法檢測其對抗生素的敏感性存在困難或不能完成。因此，盡管傳統(tǒng)的方法（瓊脂擴散法或E 試驗）可以提供SCV對抗生素敏感與否的證據，但應保證細菌必須在瓊脂平皿上生長足夠的時間（3～5 d），更要謹慎地評估其MIC數據。因SCV是在細胞內環(huán)境中被誘導和選擇的，故一些體外細胞培養(yǎng)模型被用來進一步研究SCV在細胞內的抗藥性[32]。綜合起來，這些模型結果顯示，所有抗菌藥物在細胞內對正常菌株的活性都比對SCV菌株高，提示在宿主細胞內，SCV對藥物治療具有更高的耐受性，臨床在治療SCV感染時要充分考慮到這些因素。

4 SASCV感染的治療

目前對葡萄球菌SCV感染的最佳治療方法尚不清楚，但臨床在選擇治療方案時應綜合考慮以下問題：①SCV營養(yǎng)缺陷的類型；②SCV在宿主細胞內的位置；③SCV和∕或親代菌株藥敏試驗的結果。此外，還必須考慮各感染部位的藥動學 /藥效學（PK/PD）數據等[33]。而理想的抗SCV藥物，不但要具有能夠穿透細胞膜進入SCV所在宿主細胞內的能力，還能在胞內保持殺滅這種緩慢生長表型細菌的抗菌活性。利福平是能夠滿足這些要求的抗葡萄球菌藥物，但利福平單藥使用將很快出現高水平耐藥，故建議聯合其他一種或多種敏感的抗生素共同治療SCV。Baltch等[8]的報道指出，將達托霉素、利福平及慶大霉素三者合用或達托霉素-利福平或慶大霉素-利福平二者配伍使用對清除人單核細胞源性巨噬細胞內的SASCV效果最為明顯。Sendi等[5]則將左氧氟沙星與利福平聯合使用，成功治愈了5例由SASCV引起的髖關節(jié)假體感染患者。而對于MRSA-SCV感染，糖肽類藥物萬古霉素原則上應是首選，但Garcia 等[34]指出萬古霉素不能殺死SCV ，Lenhard等[35]的實驗研究也表明萬古霉素有利于SCV亞群的形成。因此，在已證實或可能發(fā)生MRSA-SCV的持續(xù)感染時，建議使用具有抗MRSA活性的其他替代藥物。

總之，SASCV所致的慢性感染極為棘手，給微生物室和臨床均帶來了嚴峻的挑戰(zhàn)。實驗室人員要加強學習，不斷提高對SCV菌株的分離、鑒定及藥敏能力；臨床醫(yī)師不但要對已發(fā)生的SASCV感染采取積極的治療（如盡快移除感染的植入裝置、選擇敏感抗菌藥物持續(xù)治療等），還要對潛在的感染進行有效的預防，從而減少SASCV感染的發(fā)生。