3D細(xì)胞培養(yǎng)在阿爾茨海默病研究中的應(yīng)用

康美美，王 蓉(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，北京市老年病醫(yī)療研究中心，北京腦重大疾病研究院阿爾茨海默病研究所，神經(jīng)變性病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100053)

近些年來，由于傳統(tǒng)2D細(xì)胞培養(yǎng)和動物模型的局限性，3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)區(qū)別于二者的優(yōu)勢逐漸得到各國研究學(xué)者的關(guān)注。在腫瘤和藥物高通量篩選方面3D細(xì)胞培養(yǎng)模型已經(jīng)取得了初步的成果。但是在阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)的研究當(dāng)中，此項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用才剛剛開始。本文希望通過介紹3D細(xì)胞培養(yǎng)近些年在AD方面的應(yīng)用，給AD研究學(xué)者一些啟發(fā)。

1 細(xì)胞培養(yǎng)

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)簡介

自從1885年德國學(xué)者Willhelm Roux從雞胚中成功分離出細(xì)胞以來，組織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)開始萌芽[1]；Harrison[2]和Carrel等[3]分別于1907年和1912年開始研究離體細(xì)胞培養(yǎng)方法，現(xiàn)代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)誕生。經(jīng)過一百多年的發(fā)展，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)、組織工程、再生醫(yī)學(xué)和工業(yè)實(shí)踐當(dāng)中。

細(xì)胞培養(yǎng)(cell culture)指的是從體內(nèi)組織取出細(xì)胞，并為其提供一個(gè)無菌、具有適當(dāng)溫度及酸堿度的環(huán)境，給予充分營養(yǎng)，使其生長繁殖并維持其結(jié)構(gòu)和功能的一種培養(yǎng)技術(shù)。從體內(nèi)取出的細(xì)胞進(jìn)行首次培養(yǎng)的過程稱為原代培養(yǎng)(primary culture)；原代培養(yǎng)的細(xì)胞生長到一定程度，受環(huán)境影響，需要轉(zhuǎn)移到另一個(gè)新的容器，稱為傳代培養(yǎng)(subculture)。

1.2 傳統(tǒng)2D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的優(yōu)勢與劣勢

2D細(xì)胞培養(yǎng)模型一直是細(xì)胞水平的體外研究的主要手段。2D細(xì)胞培養(yǎng)是將離體的細(xì)胞粘附在塑料培養(yǎng)板或玻璃板上，在添加營養(yǎng)物質(zhì)和細(xì)胞因子的培養(yǎng)基中單層培養(yǎng)。因2D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)簡潔及高效的特點(diǎn)，得到了生物學(xué)家和臨床工作者的認(rèn)同。

然而，2D培養(yǎng)技術(shù)按時(shí)傳代的要求限制了細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)；且因?yàn)槠桨甯街脑?，?xì)胞的形態(tài)、細(xì)胞內(nèi)部骨架和核形狀發(fā)生改變，進(jìn)而反過來影響基因和蛋白質(zhì)變化[4]。其次，2D培養(yǎng)技術(shù)的單層細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使得培養(yǎng)物有時(shí)不能準(zhǔn)確再現(xiàn)動物的生理或病理過程[5]。

2 三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

2.1 3D細(xì)胞培養(yǎng)

目前，在體研究主要依賴于構(gòu)建動物模型，細(xì)胞水平則主要基于二維培養(yǎng)條件下的實(shí)驗(yàn)研究。然而，經(jīng)歷了100多年的變化之后，研究人員發(fā)現(xiàn)在體外進(jìn)行二維培養(yǎng)的細(xì)胞會逐漸改變甚至喪失其原有的性狀和形態(tài)，結(jié)構(gòu)與功能等方面也與在體環(huán)境不同[6]；動物模型則因?yàn)楹臅r(shí)長、操作復(fù)雜以及價(jià)格昂貴等因素限制了大規(guī)模開展實(shí)驗(yàn)。由于二維細(xì)胞培養(yǎng)模型和動物模型應(yīng)用的局限性，以及其他類似組織工程的相關(guān)學(xué)科的發(fā)展，三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)(three-dimensional cell culture，TDCC)應(yīng)運(yùn)而生。

三維細(xì)胞培養(yǎng)不同于二維單層培養(yǎng)的核心是細(xì)胞與培養(yǎng)環(huán)境間相互作用，它指將三維結(jié)構(gòu)不同材料的載體與不同種類細(xì)胞在體外進(jìn)行共培養(yǎng)，使細(xì)胞在支架上進(jìn)行空間立體型生長、分化和遷移，并形成具有一定組織特異性的三維復(fù)合結(jié)構(gòu)[7]。三維細(xì)胞培養(yǎng)較之二維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可通過改善胞間交流、作用力及構(gòu)建各種營養(yǎng)因子濃度梯度更大程度地模擬體內(nèi)環(huán)境，使細(xì)胞形成類似體內(nèi)的組織結(jié)構(gòu)，發(fā)揮其功能。此外，三維細(xì)胞培養(yǎng)還具有直觀性可控性特點(diǎn)，可以將簡單的體外二維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與組織器官及生物體聯(lián)系起來，在體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)之間架起一座橋梁[8]。3D細(xì)胞培養(yǎng)在腫瘤[9]和藥物篩選[10-11]方面已取得廣泛應(yīng)用，在神經(jīng)退行性疾病方面，3D細(xì)胞培養(yǎng)模型的優(yōu)勢也逐漸吸引了各國研究學(xué)者的關(guān)注。

2.2 3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)支架材料

按照來源不同，可以將支架材料分為天然材料、合成材料及新型復(fù)合材料三大類[12 - 13]。

天然材料指自然界生長或者形成的材料，大部分為細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)[14]，主要包含蛋白、多糖和蛋白聚糖等物質(zhì)，在細(xì)胞骨架、細(xì)胞形態(tài)、遷移、分化、增殖等各項(xiàng)生理功能生命活動中扮演重要作用。常見的天然材料有：膠原(collagen)、透明質(zhì)酸(hyaluronic，HA)、纖維蛋白(fibrin)等。

合成材料包括人工高分子材料和人工合成無機(jī)材料兩類。前者是以石油天然氣等為原材料合成的高分子聚合物材料，常見的有聚乳酸(poly lactic acid，PLA)、聚羥基乙酸(poly glycolic acid，PGA)以及它們之間的各種共聚物。人工合成無機(jī)材料則是指醫(yī)用碳素材料、生物玻璃、陶瓷、合金等無機(jī)材料。合成材料降解產(chǎn)物為水和二氧化碳，毒性作用小且機(jī)械性能可控，是良好的3D支架材料。

天然支架材料和合成支架材料都廣泛應(yīng)用于3D細(xì)胞培養(yǎng)中，但是單一材料或多或少都存在缺陷以及局限性，研究者們又開發(fā)了新型復(fù)合材料。新型復(fù)合材料是將幾種不同的材料通過物理或化學(xué)方法按照不同比例合成的新材料，可以彼此互補(bǔ)，揚(yáng)長避短，使得細(xì)胞可以在最接近生物環(huán)境中增殖分化。常見的天然材料復(fù)合的有膠原/纖維蛋白、絲素蛋白/殼聚糖、透明質(zhì)酸/絲素蛋白等，天然材料與合成材料復(fù)合的有聚己內(nèi)酯/殼聚糖、聚乳酸/絲素蛋白等。

3 3D細(xì)胞培養(yǎng)在阿爾茨海默病中的應(yīng)用

阿爾茨海默病(AD)又稱老年性癡呆，是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。該病起病隱匿，呈漸進(jìn)性發(fā)展，主要臨床表現(xiàn)為記憶減退、認(rèn)知能力下降，以及其他神經(jīng)精神癥狀及行為障礙，最終導(dǎo)致生活不能自理[15-17]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，65歲以上人群AD發(fā)病率為5.14%左右[18]。我國自20世紀(jì)80年代進(jìn)入“人口老齡化社會”，到2025年老年人口將達(dá)到2.8億。2016年文獻(xiàn)估計(jì)，我國AD患者人數(shù)已達(dá)800萬[19]，到20世紀(jì)中葉，AD患者將接近2000萬[20]。AD已經(jīng)嚴(yán)重威脅人類健康，給患者、家庭以及社會都帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。但是該病發(fā)病機(jī)制尚未明確，又缺乏長期有效的治療措施，使得AD的研究一直是全球?qū)W者研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)。

AD發(fā)病機(jī)制兩大假說分別為“β-淀粉樣肽(amyloid β-protein，Aβ)異常沉積”、“tau蛋白過度磷酸化”兩大假說[21 - 24]。前者認(rèn)為，位于人體第21條染色體上的β-淀粉樣前體蛋白(β-amyloid precursor protein，APP)基因，正常情況下，Aβ生成與降解平衡。當(dāng)APP基因突變或某些原因?qū)е翧PP代謝異常時(shí)，它被體內(nèi)的β和γ分泌酶切割，Aβ生成增多，或者降解減少，造成Aβ大量沉積，形成老年斑(senile plaques，SPs)。寡聚肽的Aβ具有神經(jīng)毒性，可以引發(fā)復(fù)雜的級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致神經(jīng)元的死亡。而“tau蛋白假說”則認(rèn)為，正常情況下體內(nèi)tau蛋白磷酸化和去磷酸化處于動態(tài)平衡，當(dāng)tau蛋白磷酸化速度大于去磷酸化速度時(shí)，體內(nèi)tau蛋白含量增加，進(jìn)而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。有文獻(xiàn)報(bào)道，AD發(fā)病過程中，存在Aβ在其毒性基礎(chǔ)上演變成為tau蛋白的過度磷酸化以及神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFTs)的級聯(lián)反應(yīng)[25]。筆者將就阿爾茨海默病在普通2D細(xì)胞培養(yǎng)模型下無法凸顯，但在3D細(xì)胞培養(yǎng)模型中表現(xiàn)出的優(yōu)勢做簡單介紹。

3.1 促進(jìn)細(xì)胞分化

大腦的神秘之處就在于其復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，單一研究某種特定細(xì)胞而不考慮各種分化細(xì)胞間的相互影響是很片面的。運(yùn)用3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，形成復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，可能會給阿爾茨海默病的研究帶來新的機(jī)會。Puschmann等[26]報(bào)告了一種新型電紡絲聚氨酯納米纖維3D細(xì)胞培養(yǎng)模型，可以用于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的體外支持，供神經(jīng)元在各個(gè)方向生長，進(jìn)而形成比其他培養(yǎng)體系更復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)；Park等[27]建立了一種基于3D培養(yǎng)的微流控芯片的體外腦模型，不但形成了更加接近在體狀態(tài)的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，并且與靜態(tài)條件相比，Aβ處理后的神經(jīng)球蛋白生存能力顯著下降，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)破壞也明顯。

3.2 再現(xiàn)2D培養(yǎng)模型中無法出現(xiàn)的病理過程

AD最顯著的兩大病理特征即為Aβ沉積形成的老年斑和tau蛋白過度磷酸化形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)，兩者之間是否存在關(guān)系，這其中又涉及了哪些信號通路，一直都是研究人員關(guān)注的熱點(diǎn)問題。Zhang等[28]發(fā)現(xiàn)只有在3D培養(yǎng)條件下，才可以觀察到神經(jīng)細(xì)胞在Aβ寡聚體誘導(dǎo)下，磷酸化的p21激活激酶(pPAK)等其他相關(guān)蛋白再分配的病理變化，該過程在傳統(tǒng)的2D細(xì)胞培養(yǎng)中是觀察不到的；Choi等[29 - 33]利用ReNcell VM細(xì)胞系(ReN細(xì)胞)表達(dá)APP、PSEN1突變，產(chǎn)生FAD ReN細(xì)胞系，再通過3D細(xì)胞培養(yǎng)方法，得到一個(gè)可以加速神經(jīng)元細(xì)胞分化并形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的細(xì)胞模型，成功再現(xiàn)了Aβ積聚并驅(qū)動tau蛋白胞外聚集的病理過程；Labour等[34]開發(fā)了一個(gè)3D隔室細(xì)胞培養(yǎng)模型，當(dāng)Aβ聚集體被仿生膠原基質(zhì)隔開的時(shí)候，聚集體對細(xì)胞并無毒性，但是當(dāng)基質(zhì)孔隙被打開，聚集體與分化的大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞系(PC12)細(xì)胞接觸，顯示細(xì)胞毒性，誘導(dǎo)神經(jīng)退行性過程，作者也進(jìn)一步指出，該模型可用于研究神經(jīng)突觸聚集體誘導(dǎo)神經(jīng)元死亡或神經(jīng)突營養(yǎng)不良的信號通路，探究AD發(fā)病的分子機(jī)制。

4 結(jié)論及展望

3D細(xì)胞培養(yǎng)模型作為一個(gè)強(qiáng)有力的體外模型，自誕生之日起就不斷取得了很多令人欣慰的成就，尤其在腫瘤及高通量藥物篩選方面。但不可否認(rèn)的是，目前的3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)仍有待提高。越來越多科研人員正在將3D細(xì)胞培養(yǎng)模型運(yùn)用到AD的研究中，并取得初步成果。如何更好地發(fā)揮這項(xiàng)技術(shù)的優(yōu)勢并應(yīng)用到其他神經(jīng)退行性疾病當(dāng)中去，仍然需要生命科學(xué)、材料科學(xué)、組織工程學(xué)等各學(xué)科的專家協(xié)作努力。

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