甘露聚糖結(jié)合凝集素相關(guān)絲氨酸蛋白酶3的研究現(xiàn)狀

魏 敏 邢國(guó)蘭

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院,鄭州 450052)

補(bǔ)體系統(tǒng)是人體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，通過酶級(jí)聯(lián)激活而活化，其活化中間產(chǎn)物最終組裝形成的攻膜復(fù)合物可發(fā)揮調(diào)理吞噬、化學(xué)趨化、介導(dǎo)細(xì)胞溶解、清除免疫復(fù)合物以及凋亡細(xì)胞等功能，在固有免疫和適應(yīng)性免疫之間起著十分重要的連接作用。人體可通過三條不同前端通路途徑激活補(bǔ)體：①經(jīng)典途徑(Classic pathway，CP)：補(bǔ)體C1分子亞單位C1q可通過結(jié)合抗原抗體復(fù)合物而相繼活化C1r和C1s，C1s通過依次酶解C4、C2形成C3轉(zhuǎn)化酶C4b2a；②旁路途徑(Alternative pathway，AP)：正常情況下，血液中的C3存在持續(xù)而緩慢的低程度自發(fā)水解，當(dāng)有病原體入侵，血液中自發(fā)裂解產(chǎn)生的C3b結(jié)合于病原體表面并與B因子結(jié)合形成C3bB，D因子可酶切B因子而生成C3轉(zhuǎn)化酶C3bBb；③凝集素途徑(Lectin pathway，LP)：血漿中存在的特定的模式識(shí)別分子(Pattern recognition molecule，PRM)可識(shí)別病原體表面的特殊抗原物質(zhì)，通過級(jí)聯(lián)活化甘露糖結(jié)合凝集素相關(guān)絲氨酸蛋白酶(MASPs)以及C4、C2形成C3轉(zhuǎn)化酶C4b2a。 MASPs家族共包括五種蛋白成分：絲氨酸蛋白酶MASP1、MASP2、MASP3以及無酶活性的MAp44和MAp19。其中，MASP1和MASP2是參與凝集素途徑活化的關(guān)鍵因子。MASP3于2001年首次發(fā)現(xiàn)[1]。此前人們普遍認(rèn)為，MASP3通過與MASP1/2競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合凝集素途徑的模式識(shí)別分子(PRMs)而負(fù)性調(diào)節(jié)補(bǔ)體凝集素途徑的活化。近期有研究顯示，MASP3參與D因子的活化[2,3]，而D因子為補(bǔ)體旁路途徑活化的關(guān)鍵酶。通過活化D因子，MASP3可能參與補(bǔ)體旁路途徑的活化。

補(bǔ)體是人體抵抗外來抗原侵害的重要成分，但其過度活化以及調(diào)節(jié)異?？蓪?dǎo)致各種免疫相關(guān)疾病。其中旁路途徑不僅可以直接起始補(bǔ)體活化，并且可以在其他兩條途徑活化過程中起到反饋放大作用，其異?；罨蛘{(diào)節(jié)異常參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展，如C3腎小球病、非典型溶血尿毒綜合征、IgA腎病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。目前已有研究人員通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探索以MASP3為靶點(diǎn)在治療旁路途徑異常相關(guān)疾病中的作用，這也將為此類疾病提供新的治療途徑。

1 MASP3分子的基因位點(diǎn)、蛋白結(jié)構(gòu)及組織學(xué)分布

MASP3、MASP1以及MAp44共同由MASP1/3基因編碼[4]，是通過對(duì)mRNA 前體的選擇性剪接而翻譯得到的不同蛋白產(chǎn)物。人類MASP1/3基因位于3號(hào)染色體長(zhǎng)臂的27～28位點(diǎn)[5]，長(zhǎng)約50 kb，共包含18個(gè)外顯子。外顯子1～8以及10～11編碼MASP1和MASP3共同擁有的N端五個(gè)結(jié)構(gòu)域，12號(hào)外顯子單獨(dú)編碼MASP3的連接區(qū)和蛋白酶結(jié)構(gòu)域，而13～18號(hào)外顯子共同編碼MASP1的連接區(qū)和蛋白酶結(jié)構(gòu)域。MAp44是由MASP1/3編碼的另一個(gè)不具有酶活性的蛋白分子，其前4個(gè)結(jié)構(gòu)域和MASP1/3相同，其后是單獨(dú)由外顯子9編碼的17個(gè)氨基酸殘基，無蛋白酶結(jié)構(gòu)域。

MASP3蛋白全長(zhǎng)共728個(gè)氨基酸殘基(包括19個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的前導(dǎo)肽)，共有七個(gè)糖基化位點(diǎn)，其酶原形式的分子量大小為81 873 Da，而Western blot結(jié)果顯示的蛋白條帶大小約為94 kD[6]。MASP3和MASP1蛋白分子都是由一條肽鏈構(gòu)成，其分子結(jié)構(gòu)與MASP2以及C1r和C1s相類似。蛋白的N端由五個(gè)相連結(jié)構(gòu)域(CUB1-EGF-CUB2-CCP1-CCP2)構(gòu)成A鏈，其作用是鈣依賴性地與凝集素途徑模式識(shí)別分子結(jié)合形成復(fù)合物，蛋白的C端為絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域單獨(dú)構(gòu)成的B鏈，其上包含有酶活化位點(diǎn)。A鏈和B鏈之間為連接區(qū)。當(dāng)MASPs蛋白活化時(shí)，A鏈和B鏈從酶活化位點(diǎn)處斷開，但仍通過鏈間的二硫鍵相連。

在人體，MASP1/2主要表達(dá)于肝臟，在小腸內(nèi)也有一定水平的表達(dá)，在其他器官內(nèi)均無表達(dá)或低表達(dá)。MASP3蛋白表達(dá)的組織分布和MASP1/2并不完全一樣。MASP3除了在肝臟高表達(dá)外，在結(jié)腸內(nèi)也有較高水平的表達(dá)，并且在多種組織內(nèi)都有一定水平的表達(dá)，如胰腺、心臟、肺以及腎和脾等[7]。MASP3在血漿中的平均濃度約為5.2 μg/ml[8]。

2 MASP3的活化和生物學(xué)功能研究進(jìn)展

2.1MASP3在血漿中的存在形式以及活化機(jī)制 在鈣離子存在的情況下，MASPs蛋白單體以CUB1-EGF-CUB2結(jié)構(gòu)域形成同源二聚體并與凝集素途徑的模式識(shí)別分子(PRM)結(jié)合形成復(fù)合物而存在于血循環(huán)中。目前發(fā)現(xiàn)的凝集素途徑的模式識(shí)別分子包括有甘露糖結(jié)合凝集素(Mannose-binding lectin，MBL)、纖維蛋白膠凝素-1,2,3(Ficolin-1,2,3)以及膠原凝集素-10和11(Collectin-10,11)[9-11]。正常狀態(tài)下，一個(gè)模式識(shí)別分子寡聚體只結(jié)合一種MASP蛋白[12]，但也有研究表明血漿中存在有高度寡聚體化的識(shí)別分子可以同時(shí)結(jié)合兩種不同的MASPs蛋白的同源二聚體[13]。目前關(guān)于MASP1和MASP2以及補(bǔ)體凝集素途徑的活化機(jī)制已了解較為清楚，PRM與病原微生物表面抗原結(jié)構(gòu)結(jié)合使局部PRM/MASPs復(fù)合物的濃度增高，使得相鄰復(fù)合物上的MASP1和MASP2酶原分子能夠彼此靠近得以活化成為活性酶，從而引起凝集素途徑的活化[14]。其中，MASP1首先自活化并起始MASP2的活化，MASP2最終通過裂解C4和C2形成與經(jīng)典途徑相同的C3轉(zhuǎn)化酶C4b2a。MASP1也參與酶解C2，但無活化C4的活性[15-17]。關(guān)于MASP3的活化機(jī)制人們尚未完全研究清楚。MASP3無自活化活性[18]，體外研究表明，MAPS1可以活化MASP3[16]；此外，Iwaki等[19]研究顯示，MASP1/3基因敲除小鼠以及MASP2基因敲除小鼠的血清活化MASP3蛋白的能力均較野生型小鼠減低，提示MASP1和MASP2可能參與體內(nèi)MASP3的活化。C1 inhibitor是補(bǔ)體活化的負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白，對(duì)C1r、C1s以及MASP1/2的活性均有抑制作用，但MASP3與C1 inhibitor無結(jié)合活性[18]，且目前尚未發(fā)現(xiàn)血漿中有其他的MASP3的特異性抑制物。MASP3在血漿中的活化以及其活性調(diào)節(jié)機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

2.2MASP3的生物學(xué)功能

2.2.1MASP3與D因子活化 MASP3和MASP1由相同基因編碼，且同為補(bǔ)體凝集素途徑的絲氨酸蛋白酶成分。然而與MASP1和MASP2不同的是，MASP3不參與C2、C4和C3的活化[18]。雖然既往研究表明MASP3可通過與MASP1/2競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合模式識(shí)別受體而負(fù)性調(diào)節(jié)凝集素途徑的活化[1,20]，但人們猜測(cè)這并非MASP3的主要功能。

直至2010年，Takahashi等[21]研究發(fā)現(xiàn)MASP1/3基因敲除小鼠(MASP1/3-/-，同時(shí)缺失MASP1和MASP3的表達(dá))的血清無活化補(bǔ)體旁路途徑的活性，且從該小鼠血清中分離得到的D因子經(jīng)檢測(cè)為無活性的前體形式，由此他們推測(cè)MASP1和MASP3可能和D因子的活化有關(guān)。而D因子為補(bǔ)體旁路途徑活化的關(guān)鍵酶，通過酶切B因子而形成旁路途徑的C3轉(zhuǎn)化酶C3bBb，從而他們將補(bǔ)體凝集素途徑和旁路途徑的活化聯(lián)系起來。隨后，Iwaki等[19]在對(duì)MASP3活化和功能的研究中證實(shí)了MASP3在體外可活化D因子前體，他們甚至發(fā)現(xiàn)酶原形式的MASP3也同樣有此活性，這進(jìn)一步說明MASP3可能是D因子的活化酶。

然而，Ruseva等[22]再次對(duì)MASP1/3-/-小鼠進(jìn)行檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，小鼠血清旁路途徑仍有低水平的活化，而非如Takahashi等[21]所描述的完全缺失。此外，在因MASP1/3基因突變導(dǎo)致的無正常MASP1和MASP3表達(dá)的3MC綜合征(Malpuech，Michels and Mingarelli-Carnevale syndrome)患者血清中，Degn等[13]仍檢測(cè)了一定水平的補(bǔ)體旁路途徑活化的活性，由此他們推測(cè)該患者體內(nèi)存在旁路途徑活化所必需的成熟D因子，而MASP1或MASP3也并非旁路途徑活化所必需的關(guān)鍵酶。然而令人意外的是，Takahashi等[23,24]在該病人血清中僅檢測(cè)到了D因子前體。為什么MASP1/3-/-小鼠和MASP1/3基因突變的患者血清中只檢測(cè)到D因子前體的情況下仍有一定水平的旁路途徑活化活性？Degn等[25]給出了如下解釋：一是循環(huán)中其他可活化D因子的酶可能起到了一定的代償作用，使得在缺乏MASP1和MASP3的情況下仍有小部分D因子得以活化，但并未達(dá)到檢測(cè)水平；另一種可能是前體D因子也有較低的B因子活化作用，使得在缺乏成熟D因子的情況下血清仍有較低的旁路途徑活性。但是，關(guān)于MASP3在補(bǔ)體旁路途徑活化過程中的作用人們?nèi)詿o定論。

為了進(jìn)一步研究清楚MASPs在D因子活化過程中所起的作用，Oroszlan等[3]對(duì)MASPs家族的三種蛋白酶進(jìn)行了蛋白活性測(cè)定以及酶活性抑制實(shí)驗(yàn)。他們發(fā)現(xiàn)，成熟的重組MASP1、MASP2及MASP3在體外均有D因子活化活性，而相應(yīng)酶原形式的MASPs均無此活性。與此同時(shí)，他們通過在血漿中加入重組D因子前體證明了正常人體血漿有活化D因子的活性。當(dāng)在血漿中加入足量MASP1或MASP2特異性拮抗劑后，血漿的D因子活化功能未受影響，因此他們排除了MASP1和MASP2作為D因子活化酶的可能。而當(dāng)加入足量的MASP3特異性抑制劑后，正常人體血漿活化D因子的活性消失，所加入的D因子仍以前體形式存在。由此他們得出結(jié)論：MASP3是正常生理狀態(tài)下血液中唯一的D因子活化酶。而此實(shí)驗(yàn)中另一個(gè)有趣的發(fā)現(xiàn)是，當(dāng)他們使用血清代替血漿標(biāo)本，盡管加入了足量的MASP3抑制劑，血清中仍可以檢測(cè)到低水平的D因子活化活性。對(duì)此他們給出解釋：血液凝固過程中激活的凝血酶也有活化D因子的功能。這一發(fā)現(xiàn)也支持了人們此前的推論：3MC患者血清中檢測(cè)到的旁路途可能是由其他可以活化D因子的酶導(dǎo)致，如活化的凝血酶。

綜上所述，MASP3具有D因子活化活性，且為正常生理狀態(tài)下血液中D因子活化的關(guān)鍵酶，其對(duì)于人體正常水平的旁路途徑活性具有至關(guān)重要的作用。但關(guān)于MASP3活化D因子的具體機(jī)制以及D因子前體是否也具有一定水平的旁路途徑活化活性目前尚未研究清楚。而在病理狀態(tài)下，血液中異?；罨哪浮⒗w溶酶等其他具有D因子活化活性的酶可能也起到一定的D因子活化作用。

2.2.2MASP3與人體發(fā)育 MASP1/3基因突變可導(dǎo)致常染色體隱性遺傳病——3MC綜合征[26,27]。該病患者主要的臨床表現(xiàn)包括有智力發(fā)育障礙，身材矮小以及典型的顱面部、臍腹部和骶尾部發(fā)育異常等。通過對(duì)6位3MC綜合征患者進(jìn)行基因檢測(cè)，并結(jié)合之前研究結(jié)果，Atik等[28]指出，目前發(fā)現(xiàn)的MASP1/3基因的10個(gè)突變位點(diǎn)中，有7個(gè)突變是位于MASP3的特異性編碼區(qū)域，對(duì)MASP1和MAp44無影響。另外三個(gè)位點(diǎn)位于三種蛋白的共同編碼區(qū)。由此可見，MASP3除了具有補(bǔ)體活化活性，可能在人體發(fā)育過程中也起著重要的作用，而其具體的作用及機(jī)制仍有待探索。

3 MASP3在旁路途徑異常相關(guān)疾病動(dòng)物模型中的研究進(jìn)展

補(bǔ)體旁路途徑活化和調(diào)節(jié)異常是導(dǎo)致多種疾病發(fā)生和發(fā)展的重要原因。而D因子是旁路途徑活化的關(guān)鍵酶，自Takahashi等[21]發(fā)現(xiàn)MASP3可能參與D因子活化以來，人們開始思考是否可以通過阻斷D因子的活化進(jìn)而抑制旁路途徑的激活，從而減輕相關(guān)疾病中旁路途徑活性異常所導(dǎo)致的靶組織器官損傷。

2010年，Banda等[29]通過注射藥物誘發(fā)MASP1/3-/-小鼠出現(xiàn)膠原抗體誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(CAIA)，他們發(fā)現(xiàn)MASP1/3-/-小鼠的疾病活動(dòng)性、關(guān)節(jié)局部C3沉積以及組織損傷程度均輕于野生型小鼠，他們也再次驗(yàn)證了在MASP1/3-/-小鼠體內(nèi)D因子是無活性的酶原形式。由此他們認(rèn)為MASP1或MASP3可以為旁路途徑異常相關(guān)疾病提供新的治療靶點(diǎn)。然而，研究人員從H因子基因敲除(CfH-/-)所致的C3腎小球病小鼠模型的研究中得到了相反的結(jié)論。H因子是補(bǔ)體旁路途徑的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，該系小鼠因缺乏H因子導(dǎo)致旁路途徑活化調(diào)節(jié)異常而致病。 Ruseva等[22]通過CfH-/-小鼠和上述MASP1/3-/-小鼠雜交得到了CfH-/-MASP1/3-/-小鼠，他們?cè)贑fH-/-MASP1/3-/-小鼠血清中同樣僅檢測(cè)到了前體D因子的存在，但令他們意外的是，缺失MASP1和MASP3并未減輕CfH-/-小鼠的病情，CfH-/-MASP1/3-/-小鼠仍存在旁路途徑的異?；罨Ｒ虼怂麄兺茰y(cè)，在因缺乏H因子而導(dǎo)致的補(bǔ)體旁路途徑活化異常的病理狀態(tài)下，旁路途徑的活化并不依賴于MASP1或MASP3。

針對(duì)在CAIA和CfH-/-兩種不同疾病模型中所得出的相悖結(jié)論，Degn等[25]認(rèn)為這可能是兩種疾病不同的發(fā)病機(jī)制所致，CAIA是由于旁路途徑的異常激活所導(dǎo)致，而CfH-/-小鼠是旁路途徑活性調(diào)節(jié)異常所導(dǎo)致。當(dāng)調(diào)節(jié)功能正常時(shí)，MASP1和MASP3缺失所導(dǎo)致的旁路途徑活性減低使得CAIA病情減輕。在CfH-/-小鼠模型中，MASP1和MASP3缺失雖只導(dǎo)致低水平的旁路途徑活化，但在補(bǔ)體負(fù)性調(diào)節(jié)功能受損情況下，旁路途徑仍可以通過反饋放大機(jī)制達(dá)到足夠的活化水平從而導(dǎo)致疾病發(fā)生。而在最近，另一項(xiàng)應(yīng)用小干擾RNA(Small interfering RNA，siRNA)治療CAIA小鼠模型的研究發(fā)現(xiàn)：當(dāng)給患病小鼠全身或局部應(yīng)用MASP1/3 siRNA時(shí)，小鼠的MASP1和MASP3的mRNA以及蛋白表達(dá)水平都有所減低，而小鼠的病情較對(duì)照組也明顯減輕，由此他們認(rèn)為，MASP1/3可以作為一個(gè)新的治療靶點(diǎn)應(yīng)用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療[30]。

綜上所述，關(guān)于MASP3活化D因子的功能的研究進(jìn)展，現(xiàn)已證明MASP3有活化D因子活性，而在血漿中抑制MASP1活性并不能阻斷D因子的活化，目前人們普遍接受的觀點(diǎn)為MASP3是生理狀態(tài)下D因子的主要活化酶。但由于以上所述的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所應(yīng)用的小鼠均為MASP1/3-/-小鼠，小鼠體內(nèi)同時(shí)缺乏MASP1和MASP3的表達(dá)，故僅憑以上的動(dòng)物疾病模型的構(gòu)建無法排除MASP1在其中可能起到的作用(MASP1可能參與MASP3的活化)。綜上，若想明確MASP3在補(bǔ)體旁路途徑中的作用以及是否可以作為靶點(diǎn)應(yīng)用于治療，最好能夠構(gòu)建MASP3-/-小鼠以排除MASP1蛋白的干擾。

4 小結(jié)

MASP3是補(bǔ)體凝集素途徑相關(guān)絲氨酸蛋白酶之一，其作為D因子活化酶這一新的生物學(xué)功能的發(fā)現(xiàn)將旁路途徑和凝集素途徑的活化緊密聯(lián)系起來。已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明阻斷MASP1/3基因的表達(dá)可以有效減輕關(guān)節(jié)炎小鼠模型的臨床癥狀，但對(duì)于H因子缺乏所導(dǎo)致的旁路途徑調(diào)節(jié)異常卻效果甚微。目前，關(guān)于MASP3的自身活化、酶活性調(diào)控以及其活化D因子的具體機(jī)制的研究仍十分有限。深入研究MASP3的功能活性以及其在補(bǔ)體旁路途徑異常相關(guān)疾病中的作用將有助于我們深入了解此類疾病的發(fā)病機(jī)制以及探索新的治療途徑。

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