Pig-a基因突變?cè)囼?yàn)研究進(jìn)展

鄭丹丹，秦美蓉，王曉煒，王 平

(深圳市藥品檢驗(yàn)研究院，深圳市藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，深圳 518057)

致突變物對(duì)人類健康影響重大，其與腫瘤、動(dòng)脈粥樣硬化和糖尿病等基因相關(guān)疾病及遺傳疾病的發(fā)生密切相關(guān)。在藥物開發(fā)的早期階段，充分調(diào)查化學(xué)物質(zhì)的致突變性，準(zhǔn)確對(duì)其危害及風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行識(shí)別和評(píng)估至關(guān)重要。遺傳毒性試驗(yàn)的目的即是檢測(cè)化學(xué)物質(zhì)致突變性，對(duì)新型藥物、農(nóng)藥、香精及香料等的開發(fā)過程中化學(xué)物質(zhì)的危害識(shí)別和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估起重要作用。因此建立靈敏可靠的遺傳毒性試驗(yàn)方法是全面充分評(píng)價(jià)人用化學(xué)物質(zhì)致突變性的必要保障。國際人用藥物注冊(cè)技術(shù)協(xié)調(diào)會(huì)議(International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use,ICH)和經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(Organization for Economic Co-operation and Development，OECD)關(guān)于遺傳毒性試驗(yàn)的指導(dǎo)原則有明確的闡述，盡量按照包括多個(gè)遺傳終點(diǎn)、原核生物、真核生物、體內(nèi)試驗(yàn)、體外試驗(yàn)、體細(xì)胞、生殖細(xì)胞等幾個(gè)原則設(shè)置試驗(yàn)組合，盡可能全面地預(yù)測(cè)受試物的致突變性，ICH于2011年11月批準(zhǔn)了遺傳毒性研究指導(dǎo)原則的修訂案S2(R1)，修訂了遺傳毒性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)組合，更強(qiáng)調(diào)體內(nèi)試驗(yàn)在遺傳毒性檢測(cè)中的重要性[1]。

近年來，一種基于Pig-a基因的基因突變?cè)囼?yàn)成為研究熱點(diǎn)，該方法基本原理是嚙齒動(dòng)物暴露于受試物后，Pig-a基因突變導(dǎo)致細(xì)胞表面膜蛋白缺失，通過檢測(cè)膜蛋白缺失的細(xì)胞頻率，對(duì)化學(xué)物質(zhì)致突變性進(jìn)行定量分析。Pig-a基因突變?cè)囼?yàn)消耗血量少，與其他遺傳毒理學(xué)試驗(yàn)整合的潛力高，且能在普通的動(dòng)物品系中進(jìn)行，相對(duì)于使用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的檢測(cè)方法更節(jié)省時(shí)間、成本，同時(shí)能減少動(dòng)物使用，符合動(dòng)物福利及3R原則，是未來評(píng)價(jià)人用化學(xué)物質(zhì)致突變性的重要方法。2014年ICH M7指南已將該測(cè)定法描述為用于體外突變陽性結(jié)果后續(xù)試驗(yàn)的合適系統(tǒng)[2]。2015年5月該方法被OECD批準(zhǔn)納入OECD指導(dǎo)原則并開始起草工作，預(yù)計(jì)2020年正式生效[3]。本文就Pig-a基因突變?cè)囼?yàn)的原理、方法、應(yīng)用及展望等方面進(jìn)行綜述。

1 試驗(yàn)原理

1.1 Pig-a基因

磷脂酰肌醇聚糖A類(Pig-a)基因(人類和其他靈長類動(dòng)物為PIG-A；大小鼠為Pig-a)位于染色體Xp22.1上，全長約17 kb，共有6個(gè)外顯子[4]。對(duì)Pig-a基因的研究源于陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria,PNH)。PNH是一種獲得性造血干細(xì)胞缺陷性疾病，其特征在于溶血性貧血[5]。研究發(fā)現(xiàn)，在造血干細(xì)胞中，糖基磷脂酰肌醇(GPI)獲得性缺陷會(huì)導(dǎo)致PNH[6]。GPI用于錨定各類真核蛋白質(zhì)至細(xì)胞膜上，對(duì)膜表面蛋白的表達(dá)至關(guān)重要[7]。Nishimura等[8]分析了146例PNH患者，發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致GPI缺陷的基因突變類型均在Pig-a基因座內(nèi)。Rosse等[9]研究表明，在已檢測(cè)的PNH患者血細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)都有Pig-a基因突變導(dǎo)致GPI錨定蛋白(GPI-APs)部分或全部缺失的現(xiàn)象。這表明，Pig-a基因突變可能會(huì)導(dǎo)致GPI缺陷從而導(dǎo)致GPI-APs表達(dá)障礙，最終出現(xiàn)PNH癥狀。后證實(shí)，Pig-a基因參與GPI生物合成的第一步。GPI在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成，第一步合成是在N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)轉(zhuǎn)移酶的催化下，將GlcNAc從UDP-GlcNAc轉(zhuǎn)移到磷脂酰肌醇(PI)中，生成GlcNAc-PI[10]。GPI生物合成中的第一步需要Pig-a基因編碼GlcNAc轉(zhuǎn)移酶的催化亞基，同時(shí)還需要基因Pig-h和Pig-c的參與，上述任意一個(gè)基因的突變都能導(dǎo)致該反應(yīng)的完全缺陷[11]。

GPI整個(gè)合成過程中約有二十幾個(gè)基因參與，參與第一步合成的基因還有Pig-c、Pig-h等。理論上涉及GPI合成的任何一個(gè)基因突變都可能導(dǎo)致GPI缺陷，然而，所有其他基因都位于常染色體上，必須發(fā)生兩個(gè)等位基因的突變才能導(dǎo)致GPI缺陷，而這是非常罕見的。由于人類在胚胎發(fā)育中，兩條X染色體的一條發(fā)生了隨機(jī)滅活，因此X連鎖的Pig-a基因只需單一突變足以誘導(dǎo)GPI缺陷[12]。所以，GPI缺陷表型通常歸因于Pig-a基因突變。Miura等[13]對(duì)GPI缺陷型大鼠淋巴細(xì)胞中的Pig-a基因進(jìn)行了測(cè)序，并證明在這種情況下，GPI缺陷表型實(shí)際上等同于突變體基因型。此外Kawagoe等[14]還證實(shí)X染色體上基因的結(jié)構(gòu)、功能和位置存在高度的種間保守性。這意味著采用 Pig-a 基因突變?cè)囼?yàn)進(jìn)行化學(xué)物遺傳毒性評(píng)價(jià)，有利于將動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果外推于人。

1.2 Pig-a基因突變?cè)囼?yàn)

1999年，Araten等[15]首次提出了Pig-a基因可作為體內(nèi)基因突變?cè)囼?yàn)的報(bào)告基因。2008年Bryce和Miura等[16-17]使用Pig-a作為突變報(bào)告基因成功建立嚙齒動(dòng)物Pig-a基因突變?cè)囼?yàn)方法，并證明在陽性劑處理的嚙齒動(dòng)物中Pig-a基因突變表型的紅細(xì)胞增加。后在美國國立衛(wèi)生研究院及美國環(huán)境健康科學(xué)院(NIH-NIEHS)的資金支持下，日本環(huán)境誘變劑學(xué)會(huì)(J-EMS)，美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)和國際生命科學(xué)研究院健康與環(huán)境科學(xué)研究所(ILSI-HESI)等組織對(duì)方法進(jìn)行優(yōu)化，得到能分析更多總紅細(xì)胞(RBC)和網(wǎng)織紅細(xì)胞(RET)的先進(jìn)方法，增強(qiáng)了方法的靈敏度[18]。

遺傳毒性測(cè)試國際工作組(IWGT)Pig-a工作小組在2013年報(bào)告中提出體內(nèi)大鼠Pig-a測(cè)定法可在監(jiān)管毒理學(xué)中發(fā)揮重要作用，但也指出一些數(shù)據(jù)缺口。后各實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行多次Pig-a試驗(yàn)，填補(bǔ)了IWGT提出的數(shù)據(jù)缺口。Kenyon等[19]測(cè)試了可能通過干擾紅細(xì)胞生成而出現(xiàn)陽性反應(yīng)的化學(xué)物質(zhì)，結(jié)果表明再生造血不會(huì)干擾Pig-a基因突變的測(cè)定結(jié)果。Stankowski等[20]將Pig-a基因突變?cè)囼?yàn)、微核試驗(yàn)、染色體畸變?cè)囼?yàn)以及彗星試驗(yàn)整合到28 d大鼠毒性試驗(yàn)。Bemis等[21]通過區(qū)分遺傳毒性致癌物氨基甲酸乙酯和結(jié)構(gòu)相似的非遺傳毒性化學(xué)物氨基甲酸甲酯來評(píng)估大鼠Pig-a檢測(cè)法的特異性，結(jié)果表明Pig-a檢測(cè)法具有區(qū)分遺傳毒性和非遺傳毒性的價(jià)值。Labash等[22]通過對(duì)比雄性和雌性大鼠的自發(fā)突變頻率，以及比較使用N-乙基-N-亞硝基脲(ENU)誘導(dǎo)后兩種性別大鼠的反應(yīng)，證明雄性和雌性大鼠同樣適用于Pig-a檢測(cè)。Godin-Ethier等[23]對(duì)方法在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的重現(xiàn)性、變異性和血液儲(chǔ)存穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)估，結(jié)論是大鼠Pig-a測(cè)定法是可靠的。Roberts等[24]采用一次性給藥以及相同累積劑量重復(fù)給藥兩種方案評(píng)估了4-硝基喹啉-1-氧化物(4NQO)誘導(dǎo)Pig-a突變型的結(jié)果表明，重復(fù)給藥方案在Pig-a測(cè)定中產(chǎn)生更有效的反應(yīng)。

通過DNA測(cè)序分析驗(yàn)證突變體是“真的”Pig-a基因突變體，對(duì)于突變頻率的確定至關(guān)重要。該驗(yàn)證已在大鼠CD48缺陷的T細(xì)胞中，通過流式細(xì)胞術(shù)分選突變細(xì)胞和擴(kuò)增單細(xì)胞的Pig-a基因測(cè)序得以進(jìn)行[25]。Revollo等[26]將隨機(jī)DNA標(biāo)識(shí)符(mutation analysis with random DNA identifiers,MARDI)應(yīng)用于DMBA(dimethylbenz(a)anthracene)處理的大鼠的CD48缺陷型T細(xì)胞的異質(zhì)庫的Pig-a cDNA分析中，結(jié)果MARDI檢測(cè)到幾乎所有先前通過克隆分析鑒定的Pig-a突變。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 流式細(xì)胞術(shù)法

使用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)外周血Pig-a基因突變進(jìn)行檢測(cè)的方法目前主要有兩種，北美和歐洲最常用的方法是使用試劑盒In Vivo MutaFlow?(Litron Labs)，其原理是：首先通過分離液去除白細(xì)胞，然后用帶熒光標(biāo)記且能與GPI-APs結(jié)合的抗體(如大鼠為抗CD59抗體)孵育細(xì)胞。野生型紅細(xì)胞由于細(xì)胞膜表面GPI-APs正常表達(dá)，因此能夠與抗體結(jié)合而帶有熒光標(biāo)記，突變型細(xì)胞因表面缺乏GPI-APs不與抗體結(jié)合不帶有熒光標(biāo)記。使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，即可通過熒光信號(hào)的強(qiáng)弱區(qū)分識(shí)別野生型紅細(xì)胞及突變型紅細(xì)胞。同時(shí)使用帶有熒光的核酸染液進(jìn)行孵育，即可區(qū)分NCE(normochromatic erythrocyte)及RET(reticulocyte)。通過磁性分選來特異性地減少樣品中的野生型細(xì)胞，可有效評(píng)估更多的RBC(erythrocyte)和RET，減少測(cè)量時(shí)間，降低測(cè)量誤差[27]。另外，日本有實(shí)驗(yàn)室使用熒光抗體HIS49(大鼠)檢測(cè)紅細(xì)胞；熒光抗CD59抗體(大鼠)檢測(cè)GPI錨定標(biāo)記，同時(shí)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(CD71)作為RET的標(biāo)記。一項(xiàng)比較兩種方法的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生了類似的Pig-a突變頻率[28]。

流式細(xì)胞術(shù)法檢測(cè)只需要少量血量，對(duì)動(dòng)物只是微創(chuàng)，符合動(dòng)物福利的要求，且能進(jìn)行多次采血，可使用同一組動(dòng)物進(jìn)行長期研究。由于使用的是普通嚙齒動(dòng)物，相對(duì)于轉(zhuǎn)基因小鼠基因突變?cè)囼?yàn)以及Hprt基因突變?cè)囼?yàn)成本更低，檢測(cè)時(shí)間短，適用于常規(guī)檢測(cè)。采用流式細(xì)胞術(shù)法還可以將Pig-a基因突變?cè)囼?yàn)整合到28 d大鼠毒性試驗(yàn)中，節(jié)省動(dòng)物和成本，符合3R原則。與此同時(shí)，通過流式細(xì)胞術(shù)分選突變細(xì)胞和Pig-a基因測(cè)序能對(duì)突變體進(jìn)行確證，這對(duì)于突變頻率的確定至關(guān)重要。但流式細(xì)胞術(shù)法對(duì)適用Pig-a檢測(cè)的組織有一定的限制。例如，樣品必須制備單細(xì)胞懸液，并且細(xì)胞不能經(jīng)過任何可能改變細(xì)胞表面膜蛋白的處理(如蛋白水解消化)等。目前，這兩個(gè)要求限制了Pig-a測(cè)定法只能在造血組織中應(yīng)用。

2.2 有限稀釋克隆法

氣單胞菌溶素原是由細(xì)菌性病原體嗜水氣單胞菌分泌的毒素。氣單胞菌溶素原釋放后通過蛋白水解激活形成氣單胞菌溶素，后者結(jié)合敏感細(xì)胞后低聚，插入細(xì)胞膜并形成破壞滲透性屏障的離散通道從而殺死靶細(xì)胞[29]。Diep等[30]證明，對(duì)氣單胞菌溶素敏感的細(xì)胞共同特征是細(xì)胞表面都含有GPI錨。Brodsky等[31]發(fā)現(xiàn)PNH血細(xì)胞(紅細(xì)胞，淋巴細(xì)胞和粒細(xì)胞)對(duì)氣單胞菌溶素的細(xì)胞毒性作用具有抗性，且暴露于氣單胞菌溶液的PNH細(xì)胞的裂解百分比與通過流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定的樣品中CD59+細(xì)胞的百分比平行。Abrami等[32]發(fā)現(xiàn)氣單胞菌溶素原在細(xì)胞表面與GPI結(jié)合后被蛋白水解成氣單胞菌溶素，其最終形成跨膜孔并引起細(xì)胞死亡。2008年，Miura等[13]基于上述原理建立了通過使用氣單胞菌溶素原及cDNA測(cè)序?qū)Υ笫笃⒘馨蚑細(xì)胞Pig-a基因突變進(jìn)行檢測(cè)的方法，即有限稀釋克隆法。該法原理是：使用氣單胞菌溶素原作為選擇劑，氣單胞菌溶素原能與GPI APs結(jié)合水解產(chǎn)生氣單胞菌溶素，后者導(dǎo)致細(xì)胞膜破損，細(xì)胞死亡。而Pig-a基因突變細(xì)胞由于GPI APs表達(dá)缺陷，不與氣單胞菌溶素原結(jié)合，從而得以存活，在96孔板內(nèi)長成集落。

有限稀釋克隆法能夠直觀地鑒別突變細(xì)胞，獲得的突變細(xì)胞集落還可進(jìn)行更進(jìn)一步的研究。但該方法需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，較流式細(xì)胞術(shù)法耗時(shí)較長，且與其他試驗(yàn)的整合能力較差?，F(xiàn)使用該方法進(jìn)行Pig-a基因突變檢測(cè)的試驗(yàn)較少。

3 應(yīng)用進(jìn)展

2008年，HESI的遺傳毒理學(xué)技術(shù)工作小組成立了Pig-a工作小組，致力于方法的進(jìn)一步優(yōu)化。在NIH-NIEHS的基金支持下，由Litron Labs和ILSI-HESI的科學(xué)家聯(lián)合制定統(tǒng)一的實(shí)驗(yàn)方案，對(duì)Pig-a測(cè)定法進(jìn)行國際聯(lián)合驗(yàn)證。該驗(yàn)證計(jì)劃由美國國家毒理學(xué)研究中心、輝瑞、雅培、諾華和拜耳制藥等14個(gè)不同機(jī)構(gòu)組織的實(shí)驗(yàn)室參與，統(tǒng)一采用Litron Labs提供的試劑盒(大鼠品系和流式細(xì)胞儀由實(shí)驗(yàn)室自行決定)，檢測(cè)41個(gè)試劑，驗(yàn)證該方法的靈敏度和重復(fù)性。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)分四個(gè)階段[33-38]。第Ⅰ階段為參加方法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)室的信息收集，第Ⅱ階段為參加驗(yàn)證的14個(gè)實(shí)驗(yàn)室用相同劑量的ENU及試劑盒檢測(cè)突變表型RBCCD59-RETCD59-發(fā)生率，并與Litron Labs數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)[33]。第Ⅲ階段采用28天重復(fù)劑量設(shè)計(jì)，使用ENU[34], DMBA[35], N-甲基-N-亞硝基脲[36], BaP[37]和4-NQO[38]等試劑進(jìn)行試驗(yàn)，每個(gè)試劑至少有兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室參與驗(yàn)證。第Ⅳ階段主要是對(duì)弱致突變劑和非致突變劑進(jìn)行測(cè)試，增加實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)對(duì)弱致突變劑和非致突變劑的靈敏度以及結(jié)果可信度。驗(yàn)證第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ階段的報(bào)告現(xiàn)已發(fā)表，初步證明Pig-a基因突變?cè)囼?yàn)具有良好的靈敏度、可靠性和重現(xiàn)性，還建立了通過免疫磁性分離技術(shù)增加樣品可評(píng)估細(xì)胞量的方法[39]。第Ⅳ階段研究也已獲得進(jìn)展，現(xiàn)部分工作已被公布[25, 40-41]。國內(nèi)僅中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院的國家上海新藥安評(píng)中心參與該驗(yàn)證計(jì)劃，評(píng)價(jià)了ENU、三聚氰胺、5-氟尿嘧啶(5-FU)和4NQO四種不同遺傳毒性作用機(jī)制化合物在SD大鼠體內(nèi)微核試驗(yàn)和Pig-a基因突變?cè)囼?yàn)中的遺傳毒性，并作為國際聯(lián)合驗(yàn)證結(jié)果的一部分總結(jié)于IWGT對(duì)Pig-a試驗(yàn)的總結(jié)報(bào)告中[42]。

目前，Pig-a基因突變?cè)囼?yàn)還可在以下方面開展工作[43]：①進(jìn)一步確認(rèn)Pig-a基因突變型與GPI缺陷表型之間的關(guān)系；②分析甲基化/去甲基化對(duì)測(cè)定性能的影響；③對(duì)更多非致突變劑進(jìn)行測(cè)試，尤其是通過不同機(jī)制干擾紅細(xì)胞生成的試劑；④檢查長時(shí)間給藥(如90 d)對(duì)測(cè)定性能的影響；⑤使用大鼠以外(如人，小鼠，狗，豬等)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物建立方法；⑥建立使用其他血細(xì)胞(如T淋巴細(xì)胞和粒細(xì)胞)的方法；⑦探索Pig-a測(cè)定法在測(cè)量固體組織(例如肝臟)細(xì)胞突變的實(shí)用性；⑧開發(fā)體外細(xì)胞測(cè)定法；⑨探索測(cè)定法用于測(cè)量生殖細(xì)胞中的突變等。

4 展望

迄今為止，大鼠已作為Pig-a法一種關(guān)鍵的嚙齒動(dòng)物模型，用于監(jiān)管毒理學(xué)研究。然而，Pig-a基因突變?cè)囼?yàn)?zāi)芊裨谛∈竽Ｐ椭谐晒?yīng)用至關(guān)重要，因?yàn)樾∈笤诙纠韺W(xué)中也發(fā)揮著非常重要的作用。Phonethepswath等[44]將CD-1小鼠暴露于DMBA和ENU，結(jié)果顯示RET和RBC中檢測(cè)到明顯的Pig-a基因突變，結(jié)論是Pig-a檢測(cè)可以有效地應(yīng)用于小鼠。Bhalli等[45]使用不同品系的C57BL/6小鼠暴露于ENU進(jìn)行Pig-a檢測(cè)，結(jié)果顯示RET和RBC中檢測(cè)到明顯的Pig-a基因突變。后有研究使用小鼠Pig-a法測(cè)試了幾種多環(huán)芳烴(PAH)，其中DMBA和苯并[a]芘(benzopyrene，BaP)檢測(cè)到明顯的Pig-a基因突變。而BaP的誘變效應(yīng)在幾種品系小鼠不同暴露途徑下是顯著的，包括在MutaTM小鼠模型中灌胃給藥28 d；在Gptδ小鼠中單次灌胃給藥；在C57BL/6野生型和DNA修復(fù)缺陷型小鼠中腹腔注射3 d；在CD-1小鼠中灌胃給藥3 d[44,46-50]。這表明，對(duì)于典型的致突變劑PAHs DMBA和BaP，小鼠Pig-a基因突變測(cè)定能夠揭示其遺傳毒性潛力。目前基于小鼠進(jìn)行的Pig-a檢測(cè)數(shù)據(jù)相對(duì)較少，需要使用更多致突變劑、弱致突變劑及非致突變劑進(jìn)行試驗(yàn)來更進(jìn)一步表征Pig-a檢測(cè)法在小鼠中的靈敏度。

Pig-a基因在哺乳動(dòng)物中具有高度的保守性，也為人群中開展Pig-a基因突變檢查以及轉(zhuǎn)化毒理學(xué)研究提供了可能。Dobrovolsky等[51]研究表明PIG-A測(cè)定可用于檢測(cè)人體內(nèi)的體細(xì)胞突變。Dertinger等[52]研究表明可使用基于嚙齒動(dòng)物的標(biāo)記和分析方案對(duì)人類PIG-A突變表型細(xì)胞頻率進(jìn)行有效和可靠的評(píng)估。Cao等[53]對(duì)人類的自發(fā)突變頻率(MF)、男女性MF對(duì)比、 MF和年齡之間的相關(guān)性、MF在吸煙者和非吸煙者之間的差異以及個(gè)體差異等進(jìn)行了研究，為人類PIG-A測(cè)定法的建立提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

此外，檢測(cè)生殖細(xì)胞中的突變可能會(huì)成為Pig-a測(cè)定法重要的應(yīng)用方向之一。Ji等[54]應(yīng)用Pig-a測(cè)定法對(duì)大鼠附睪精子進(jìn)行生殖細(xì)胞誘變性評(píng)估，結(jié)果和預(yù)期頻率之間達(dá)到良好的一致性，認(rèn)為大鼠表皮精子Pig-a檢測(cè)是評(píng)估生殖細(xì)胞致突變性的有希望的方法。

5 小結(jié)

GPI生物合成途徑在大多數(shù)哺乳動(dòng)物物種中是保守的，包括小鼠、大鼠、猴以及人類等。在人類和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中評(píng)估Pig-a基因突變的能力，意味著可在動(dòng)物模型中測(cè)試人類對(duì)潛在致突變劑的反應(yīng)。此外，人類PIG-A測(cè)定可能在臨床環(huán)境中具有價(jià)值，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中進(jìn)行的Pig-a測(cè)定可為體內(nèi)內(nèi)源性突變提供參考。例如，Pig-a和PIG-A測(cè)定可用于監(jiān)測(cè)基因毒性化合物的長期毒性[55]，有助于評(píng)估繼發(fā)性惡性腫瘤發(fā)生的可能性。此外，PIG-A測(cè)定還可用于流行病學(xué)研究，用于監(jiān)測(cè)暴露于潛在不利環(huán)境中的人群的健康狀況(突變累積)。

雖然Pig-a測(cè)定目前在組織覆蓋方面存在局限性，且直接證明紅細(xì)胞反應(yīng)的突變基礎(chǔ)非常困難。但是，由于Pig-a測(cè)定法具有與其他試驗(yàn)整合潛力高，較高的臨床參考價(jià)值，對(duì)致突變劑反應(yīng)敏感，成本相對(duì)較低，測(cè)定終點(diǎn)為內(nèi)源性哺乳動(dòng)物基因表型突變等優(yōu)點(diǎn)，筆者認(rèn)為Pig-a測(cè)定法未來將成為體內(nèi)遺傳毒理學(xué)檢測(cè)的重要方法。