雙光子活體成像技術(shù)及其在免疫學(xué)中的應(yīng)用①

張 記 吳玉章

(陸軍軍醫(yī)大學(xué)全軍免疫學(xué)研究所，重慶 400038)

機(jī)體免疫系統(tǒng)具有防御、監(jiān)視及自穩(wěn)功能,其功能異常會(huì)導(dǎo)致傳染性疾病、自身免疫性疾病及惡性腫瘤等重大疾病的發(fā)生。機(jī)體的免疫應(yīng)答是通過(guò)一系列免疫細(xì)胞與免疫分子間的相互作用實(shí)現(xiàn)的。幾乎所有免疫細(xì)胞都是可移動(dòng)的；信息在細(xì)胞的接觸中快速地傳遞,免疫細(xì)胞在不同組織器官之間遷移[1]。 免疫應(yīng)答相關(guān)分子的表達(dá)、空間轉(zhuǎn)位及相互作用等功能信息也是瞬息萬(wàn)變的,在不同微環(huán)境中的功能具有時(shí)效性與差異性。因此，免疫細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、遷移及相互接觸等動(dòng)態(tài)信息的獲取，對(duì)免疫應(yīng)答與免疫治療過(guò)程的直觀呈現(xiàn)及機(jī)理的系統(tǒng)性解析非常重要[2]。

顯微成像與流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù)使免疫學(xué)家已獲得了大量免疫分子的結(jié)構(gòu)與功能信息，鑒定了很多重要的免疫細(xì)胞類型及其功能，極大地推動(dòng)了免疫學(xué)的研究進(jìn)程。但這些基于體外實(shí)驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)，不能真實(shí)反映生物活體的精細(xì)結(jié)構(gòu)、生理及病理環(huán)境。由體外研究獲得的功能信息,需要在活體內(nèi)驗(yàn)證。其次，基于靜態(tài)節(jié)點(diǎn)的研究方法只適合對(duì)免疫系統(tǒng)一個(gè)狀態(tài)的判斷,無(wú)法確定各狀態(tài)環(huán)節(jié)之間的銜接與發(fā)展。

1 雙光子活體成像實(shí)驗(yàn)技術(shù)

分子成像技術(shù)及方法的發(fā)展,尤其是雙光子掃描顯微鏡的出現(xiàn)與改進(jìn)，為活體狀態(tài)下免疫反應(yīng)的動(dòng)態(tài)過(guò)程研究提供了可能。雙光子掃描顯微鏡技術(shù)具備以下4方面能力[3]：①高時(shí)空分辨率的三維成像；②多分子與細(xì)胞事件的并行檢測(cè)；③長(zhǎng)時(shí)程動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)；④從亞微米到厘米的跨層次多尺度的系統(tǒng)性觀察?；谏鲜黾夹g(shù)，免疫應(yīng)答過(guò)程中多種類免疫細(xì)胞的遷移、募集與相互接觸的可視化成為可能。

1.1雙光子成像的原理及特點(diǎn) 1931年雙光子理論首先提出[4]：熒光分子在足夠短的時(shí)間內(nèi)遇上2個(gè)或多個(gè)光子，熒光分子就能同時(shí)吸收2個(gè)或多個(gè)光子。其物理學(xué)原理是：在單光子激發(fā)過(guò)程中，基態(tài)熒光分子在激光照射下吸收一個(gè)高能光子使分子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，隨后到達(dá)亞穩(wěn)態(tài)，最后從亞穩(wěn)態(tài)返回基態(tài)并發(fā)射出較長(zhǎng)波長(zhǎng)的熒光光子。單光子熒光激發(fā)過(guò)程只吸收一個(gè)光子，是一個(gè)線性吸收過(guò)程。在多光子激發(fā)過(guò)程中，熒光分子同時(shí)吸收多個(gè)光子實(shí)現(xiàn)基態(tài)到激發(fā)態(tài)的躍遷，從亞穩(wěn)態(tài)返回基態(tài)并發(fā)射出一個(gè)波長(zhǎng)大于激發(fā)光波長(zhǎng)1/n(雙光子n=2)的光子。雙光子熒光激發(fā)需要同時(shí)吸收2個(gè)光子，其躍遷概率跟激光功率成平方關(guān)系，所以雙光子吸收是一個(gè)非線性過(guò)程，只有在高光子密度情況下才會(huì)發(fā)生顯著的雙光子吸收過(guò)程。

基于以上原理，傳統(tǒng)的單光子激光共聚焦顯微鏡的局限性是：①單光子激發(fā)過(guò)程是線性激發(fā)，焦平面附近會(huì)產(chǎn)生熒光，導(dǎo)致成像時(shí)有較高的背景熒光，從而影響成像質(zhì)量。②單光子激發(fā)過(guò)程一般是用高光子能量的可見(jiàn)光波段激發(fā)，熒光染料會(huì)產(chǎn)生毒素，導(dǎo)致光漂白與光毒性，損傷活體細(xì)胞，限制了其在活體組織中的使用。③為獲得高分辨率的成像，必須保證共聚焦的針孔足夠小；但孔徑減小會(huì)阻擋掉大部分熒光。

而雙光子熒光激發(fā)是一個(gè)非線性過(guò)程，通常雙光子激光顯微鏡選擇近紅外光作為激發(fā)光，其特點(diǎn)如下[5]：①光損傷小。使用紅外波長(zhǎng)(長(zhǎng)波長(zhǎng))的脈沖飛秒激光作為光源激發(fā)，能顯著降低光損傷與光毒性；故雙光子顯微鏡對(duì)活體細(xì)胞及組織的光損傷很小，適合于長(zhǎng)時(shí)程的觀察研究。②組織內(nèi)源性吸收少。生物組織對(duì)近紅外波段的內(nèi)源性吸收較少，是探測(cè)活體組織成像的理想光學(xué)窗口。③穿透能力強(qiáng)。近紅外光作為激發(fā)光，比單光子激發(fā)波長(zhǎng)要長(zhǎng)；在生物組織中，長(zhǎng)波長(zhǎng)的光比短波長(zhǎng)的光受散射影響要小，從而容易穿透樣品；因而雙光子激光顯微鏡能達(dá)到更大的成像深度(200～1 000 μm)，可以對(duì)生物樣品進(jìn)行深層的研究。④分辨率高。雙光子吸收截面很小，只在焦平面很小的區(qū)域內(nèi)激發(fā)出熒光，局限于焦點(diǎn)處的體積很小的范圍內(nèi)。⑤光漂白小。漂白區(qū)域很小，焦點(diǎn)以外不發(fā)生漂白現(xiàn)象。⑥熒光收集效率高。與單光子共聚焦成像相比，雙光子成像不需要針孔，提高了熒光收集效率，直接導(dǎo)致圖像對(duì)比度提高。⑦適合多標(biāo)記測(cè)量。許多染料熒光探針的多光子激發(fā)光譜比單光子激發(fā)譜要寬，因此就可以利用單一波長(zhǎng)的激發(fā)光同時(shí)激發(fā)多種染料，從而得到同一生命現(xiàn)象中的不同信息，便于相互對(duì)照補(bǔ)充。

1.2動(dòng)物活體成像的實(shí)驗(yàn)體系 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物長(zhǎng)時(shí)程的活體成像，除硬件設(shè)備雙光子顯微鏡外，其他必要的技術(shù)條件是：①熒光標(biāo)記技術(shù)；②待觀察組織的暴露及固定技術(shù)。待觀察組織首先必須直接暴露在顯微鏡鏡頭下，這需要相應(yīng)的外科手術(shù)。其次，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的長(zhǎng)時(shí)程成像，要求觀察視野必須是高度靜止的，不能受到動(dòng)物心跳與呼吸的影響?；谝陨弦螅铙w成像的基本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原則是[6]：根據(jù)待觀察組織的解剖學(xué)位置、組織內(nèi)觀察深度、待觀察細(xì)胞種類、待觀察細(xì)胞運(yùn)動(dòng)速度、分辨率需求等因素選擇合適的激光顯微鏡、熒光搭配方案及合理的暴露手術(shù)。

1.2.1活體成像實(shí)驗(yàn)的熒光標(biāo)記 光學(xué)分子探針主要包括化學(xué)小分子探針、納米顆粒及遺傳編碼型分子探針等[6]。常用的分子探針是化學(xué)探針與遺傳編碼的熒光蛋白?；瘜W(xué)小分子探針由于其體積小且對(duì)生物分子功能的干擾小,在生命科學(xué)研究中發(fā)揮著重要作用。相對(duì)而言,基于熒光蛋白的遺傳編碼型分子探針,由于其準(zhǔn)確的亞細(xì)胞定位能力、良好的生物相容性及光學(xué)信號(hào)不會(huì)隨細(xì)胞分裂而減少等特點(diǎn),使活體內(nèi)數(shù)天至數(shù)月長(zhǎng)時(shí)程、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)分子事件成為可能。不同熒光的搭配使用，是實(shí)現(xiàn)活體內(nèi)多分子事件同步光學(xué)觀察的基礎(chǔ)。長(zhǎng)期示蹤活細(xì)胞的熒光一般是CFSE(綠色)與 CMTMR(橙色)[4]。其他常用的遺傳編碼的蛋白標(biāo)簽有藍(lán)色熒光蛋白(BFP)、青色熒光蛋白(ECFP)、綠色熒光蛋白(EGFP)、黃色熒光蛋白(EYFP)及紅色熒光蛋白(DsRed)等[7]。

1.2.2活體成像實(shí)驗(yàn)組織暴露的外科手術(shù) 皮膚等組織的觀察，不需要或只需要很小的暴露手術(shù)即可實(shí)現(xiàn)。但對(duì)淋巴結(jié)、腦組織、乳腺組織、真皮組織，尤其是腹腔內(nèi)的組織(如肝臟、腸組織、胰腺組織等)則需要進(jìn)行較大的外科暴露手術(shù)，并需要利用金屬環(huán)、金屬支架等進(jìn)行固定，這個(gè)過(guò)程稱為開窗[8]。在進(jìn)行開窗的外科手術(shù)中，不能有感染及炎癥出現(xiàn)，否則手術(shù)感染導(dǎo)致的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。開窗是非常具有挑戰(zhàn)性的外科手術(shù)，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程對(duì)動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境、顯微成像實(shí)驗(yàn)室環(huán)境均有很高要求。當(dāng)實(shí)驗(yàn)需要長(zhǎng)達(dá)數(shù)天、數(shù)周觀察的時(shí)候，上述操作的要求則更為嚴(yán)苛[9]。針對(duì)上述組織，不同實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)了多種開窗方案并取得了一定成功[10]。但手術(shù)中動(dòng)物死亡、流血、窗口脫落、感染及組織輕微抖動(dòng)等問(wèn)題的出現(xiàn)，使成像實(shí)驗(yàn)的失敗率很高。另一方面，動(dòng)物在顯微鏡下觀察需要定制合適的載物臺(tái)，保證動(dòng)物在觀察時(shí)間內(nèi)始終處于麻醉狀態(tài)。為了保證活體成像觀察數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性及長(zhǎng)時(shí)程觀察的動(dòng)物生理機(jī)能處于正常水平，還需要保證載物臺(tái)的溫度等其他細(xì)節(jié)。

2 雙光子活體成像技術(shù)在免疫學(xué)中的應(yīng)用

免疫應(yīng)答的基本過(guò)程是:抗原呈遞細(xì)胞在外周捕獲抗原后運(yùn)動(dòng)到淋巴結(jié)，在淋巴結(jié)與T、B淋巴細(xì)胞接觸；活化的淋巴細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)并到達(dá)效應(yīng)器官發(fā)揮其免疫效應(yīng)。2002年3篇發(fā)表在Science 的研究將雙光子活體成像技術(shù)引入了免疫學(xué)領(lǐng)域。加州大學(xué)埃文斯分校的Cahalan團(tuán)隊(duì)研究了活體內(nèi)淋巴結(jié)中T細(xì)胞與DC 細(xì)胞的相互作用過(guò)程[11]；NIH的Germain團(tuán)隊(duì)成像了活體中淋巴結(jié)內(nèi)的T、B淋巴細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性及其抗原應(yīng)答過(guò)程[12]；加州大學(xué)伯克利分校的Robey團(tuán)隊(duì)則在活體內(nèi)可視化了淋巴細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中胸腺細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞的相互作用[13]。在過(guò)去的16年中，活體成像技術(shù)應(yīng)用到了免疫學(xué)的諸多領(lǐng)域:從淋巴細(xì)胞的發(fā)育到免疫細(xì)胞的活化，從免疫細(xì)胞間的相互作用到效應(yīng)免疫細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷。觀察對(duì)象從各級(jí)淋巴器官(骨髓、淋巴結(jié)、脾臟、胸腺等)到免疫細(xì)胞發(fā)揮效應(yīng)的各個(gè)器官(皮膚、肝臟、腦、肺等)；從機(jī)體的穩(wěn)態(tài)維持，到感染性疾病、自身免疫性疾病，從腫瘤免疫微環(huán)境的組成到免疫相關(guān)藥物的效應(yīng)機(jī)制。多種器官的開窗手術(shù)方法得到建立，多種免疫細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)細(xì)節(jié)及功能相關(guān)性得到揭示。免疫應(yīng)答過(guò)程中多個(gè)新的關(guān)鍵性發(fā)現(xiàn)，加深或修正了我們對(duì)免疫學(xué)的理解?，F(xiàn)從技術(shù)運(yùn)用的角度，以具體的研究實(shí)例為依據(jù)，概括總結(jié)本技術(shù)在解決免疫學(xué)相關(guān)科學(xué)問(wèn)題中的應(yīng)用。

2.1可視化免疫細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)規(guī)律，揭示其運(yùn)動(dòng)相關(guān)功能 CD4輔助性T細(xì)胞在控制胞內(nèi)寄生蟲感染中起著核心作用，但病原體特異性CD4 T細(xì)胞有效檢測(cè)到感染細(xì)胞的過(guò)程尚不清楚。Filipe-Santos等[14]利用Lys-EGFP工具鼠及表達(dá)DsRed熒光的利什曼原蟲感染模型，通過(guò)運(yùn)用活體成像技術(shù)，描繪了感染部位CD4 T細(xì)胞的抗原識(shí)別動(dòng)態(tài)圖譜。研究者發(fā)現(xiàn)，活化的CD4 T細(xì)胞進(jìn)入發(fā)炎組織與抗原特異性無(wú)關(guān)，病原體特異性T細(xì)胞傾向于在真皮感染位置減速并聚集；CD4 T細(xì)胞的抗原識(shí)別是異質(zhì)性的，其與吞噬細(xì)胞既有穩(wěn)定接觸也有動(dòng)態(tài)接觸；并非所有感染細(xì)胞都會(huì)引起病原體特異性CD4 T細(xì)胞的阻滯或減速；感染細(xì)胞的密集成簇造成移動(dòng)的CD4 T細(xì)胞很難接近。

Th17細(xì)胞與自身免疫性神經(jīng)炎癥的神經(jīng)損傷相關(guān)，Siffrin等[15]利用雙光子活體成像追蹤了疾病特異性Th17在其動(dòng)物模型EAE發(fā)病過(guò)程中的運(yùn)動(dòng)規(guī)律。他們發(fā)現(xiàn)疾病特異性Th17細(xì)胞與神經(jīng)元細(xì)胞在病變位點(diǎn)存在持續(xù)的直接相互作用，并誘導(dǎo)發(fā)生嚴(yán)重神經(jīng)損傷的早期信號(hào)。此發(fā)現(xiàn)突出了Th17細(xì)胞效應(yīng)功能在神經(jīng)元功能失常中的中心作用。

效應(yīng)CD8 T細(xì)胞(CD8 TE)在嗜肝病毒感染中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在小鼠HBV感染的模型中，Guidotti等[16]利用雙光子成像技術(shù)追蹤了CD8 TE細(xì)胞歸巢到肝臟、識(shí)別抗原及展開其效應(yīng)功能的過(guò)程。他們發(fā)現(xiàn)，循環(huán)CD8 TE“停泊”在血小板滯留的肝竇中；在滯留的早期，CD8 TE主動(dòng)沿著肝血竇爬行，穿過(guò)內(nèi)皮窗孔并延長(zhǎng)胞質(zhì)突起而探測(cè)血竇下方肝細(xì)胞存在的抗原；而肝細(xì)胞的抗原識(shí)別則通過(guò)滲出非依賴的方式引起CD8 TE的效應(yīng)功能。

Liew等[17]利用活體成像技術(shù)，在肝臟無(wú)菌損傷模型中追蹤iNKT細(xì)胞從損傷發(fā)生到損傷恢復(fù)整個(gè)過(guò)程的運(yùn)動(dòng)規(guī)律。其發(fā)現(xiàn)，iNKT在自身抗原驅(qū)動(dòng)下，相當(dāng)于損傷感知的檢測(cè)器與調(diào)節(jié)器：iNKT對(duì)無(wú)菌損傷的反應(yīng)分為排斥、滯留及浸潤(rùn)3個(gè)明顯的階段?！把策墶钡膇NKT細(xì)胞最初排斥在肝損傷位點(diǎn)，隨后被損傷位點(diǎn)通過(guò)自身抗原與細(xì)胞因子捕獲，最后環(huán)繞在損傷位點(diǎn)。自身抗原對(duì)iNKT的活化產(chǎn)生IL-4，而非IFN-γ，促進(jìn)肝細(xì)胞增殖，改善損傷愈合。與此類似，Wang等[18]則利用活體成像技術(shù)追蹤肝損傷與修復(fù)過(guò)程中的中性粒細(xì)胞的時(shí)空運(yùn)動(dòng)軌跡、可視化中性粒細(xì)胞的功能與命運(yùn)。他們發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞在無(wú)菌肝損傷模型中會(huì)穿透損傷位點(diǎn)，在“拆除”損傷血管及新血管再生中扮演關(guān)鍵角色。在完成上述任務(wù)后，其不是在損傷位點(diǎn)死亡或被吞噬；相反，許多中性粒細(xì)胞再次進(jìn)入脈管，執(zhí)行預(yù)先“安排”的運(yùn)動(dòng)過(guò)程：在肺內(nèi)逗留一段時(shí)間后上調(diào)CXCR4，最后進(jìn)入骨髓并在骨髓內(nèi)凋亡。

在腫瘤免疫中，浸潤(rùn)在實(shí)體瘤中的CTL與NK細(xì)胞是最重要的殺傷細(xì)胞，但兩者浸潤(rùn)、清除腫瘤細(xì)胞的動(dòng)力學(xué)過(guò)程未知。Boissonnas等[19]利用活細(xì)胞成像技術(shù)對(duì)CTL的運(yùn)動(dòng)規(guī)律進(jìn)行追蹤，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的抗原表達(dá)決定CTL在腫瘤內(nèi)的運(yùn)行規(guī)律及深層浸潤(rùn)?；罨腃TL 以極快的速度遷移，在距離表達(dá)同源抗原的腫瘤細(xì)胞很近的位置停止運(yùn)動(dòng)，而在腫瘤細(xì)胞死亡的區(qū)域CTL重新遷移。沿著血管遷移的CTL傾向于采用一種細(xì)長(zhǎng)形態(tài)。當(dāng)腫瘤細(xì)胞表達(dá)同源抗原時(shí)，CTL也會(huì)遷移到腫瘤深處；在無(wú)同源抗原的區(qū)域，CTL的浸潤(rùn)限制在腫瘤表面區(qū)域，并且既不停止運(yùn)動(dòng)也不殺傷細(xì)胞。Breart等[20]進(jìn)一步在CTL過(guò)繼轉(zhuǎn)移導(dǎo)致腫瘤消退的模型中發(fā)現(xiàn)，過(guò)繼轉(zhuǎn)移的CTL導(dǎo)致腫瘤消退主要是通過(guò)CTL對(duì)單個(gè)腫瘤細(xì)胞直接作用，僅有極小的旁觀效應(yīng)。令人吃驚的是，單個(gè)CTL殺傷一個(gè)靶細(xì)胞需要很長(zhǎng)時(shí)間，平均需要6 h。Deguine等[21]則利用本技術(shù)發(fā)現(xiàn)NK 細(xì)胞與CTL在腫瘤消退階段具有完全不同的與靶細(xì)胞接觸的動(dòng)力學(xué)特征。他們發(fā)現(xiàn)，NKG2D配體驅(qū)動(dòng)NK細(xì)胞在浸潤(rùn)腫瘤的活化與運(yùn)動(dòng)特征。在腫瘤收縮過(guò)程中，NK 細(xì)胞具有與其靶標(biāo)動(dòng)態(tài)接觸的過(guò)程；與NK細(xì)胞相反，CTL 與表達(dá)其抗原的腫瘤細(xì)胞則形成穩(wěn)定的接觸。

2.2可視化免疫細(xì)胞之間的相互作用，揭示其時(shí)空關(guān)系 活體成像技術(shù)的主要優(yōu)勢(shì)是能觀察分子與細(xì)胞在空間上的關(guān)系及時(shí)間上的聯(lián)系，得到完整的動(dòng)態(tài)過(guò)程。在免疫應(yīng)答啟動(dòng)過(guò)程中，二級(jí)淋巴器官中存在著多種免疫細(xì)胞之間的相互作用，多是通過(guò)細(xì)胞間的相互接觸實(shí)現(xiàn)的；其接觸特征、接觸時(shí)間的長(zhǎng)短、運(yùn)動(dòng)的速度等參數(shù)與整個(gè)免疫應(yīng)答的質(zhì)量及結(jié)局密切相關(guān)。其他技術(shù)只能觀察到各時(shí)間點(diǎn)上的橫斷面，且非是嚴(yán)格的同一位置。各時(shí)間點(diǎn)之間的關(guān)系、各位置之間的聯(lián)系，是通過(guò)邏輯推理完成的，其中難免沒(méi)有謬誤。因此，活體成像是研究免疫細(xì)胞間相互作用的利器，是其他技術(shù)無(wú)法替代的。

在病毒感染的免疫應(yīng)答啟動(dòng)過(guò)程中，樹突狀細(xì)胞(DC)亞群、輔助性CD4 T與效應(yīng)性CD8 T細(xì)胞在淋巴結(jié)內(nèi)發(fā)生著復(fù)雜的、動(dòng)態(tài)的相互接觸及相互作用，最終實(shí)現(xiàn)CD8 T細(xì)胞的克隆擴(kuò)增、分化及記憶反應(yīng)。雙光子活體成像技術(shù)在揭示此類涉及時(shí)空轉(zhuǎn)換過(guò)程的免疫應(yīng)答機(jī)理中具有天然的優(yōu)勢(shì)。Eickhoff等[22]利用活體成像顯微鏡的淋巴結(jié)大視野成像發(fā)現(xiàn)，淋巴結(jié)內(nèi)的CD4 T與CD8 T的初始啟動(dòng)在空間上是分開的；并且依賴于不同的DC亞群及不同的抗原呈遞模式。在另一項(xiàng)研究中，Hor等[23]則發(fā)現(xiàn)了CD4 T與CD8 T的活化在時(shí)間上的不同步性。在免疫應(yīng)答早期，CD4 T 與遷移來(lái)的皮膚DC成簇而發(fā)生相互接觸，而CD8 T則不與遷移來(lái)的DC相互接觸，其活化是延遲的；而在免疫應(yīng)答后期，CD8 T與淋巴結(jié)定植的XCR1+DC成簇，并進(jìn)而與已致敏的CD4 T發(fā)生相互接觸，完成CD4 T對(duì)CD8 T活化的輔助。兩項(xiàng)研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，XCR1+DC亞群是實(shí)現(xiàn)CD4 T 輔助CD8 T 應(yīng)答的關(guān)鍵平臺(tái)。類似的，B細(xì)胞與Tfh細(xì)胞在淋巴結(jié)生發(fā)中心的相互作用決定了體液免疫的質(zhì)量。清華大學(xué)祁海團(tuán)隊(duì)[24]利用雙光子活體成像技術(shù)揭示了影響兩者相互作用的分子Ephrin-B1介導(dǎo)的機(jī)制。他們發(fā)現(xiàn)，生發(fā)中心B細(xì)胞高表達(dá)Ephrin-B1分子；Ephrin-B1以接觸依賴的方式通過(guò)Tfh細(xì)胞上表達(dá)的EphB6受體排斥Tfh細(xì)胞，抑制抗原特異的Tfh-B細(xì)胞黏附互作，進(jìn)而限制Tfh細(xì)胞在生發(fā)中心的停留時(shí)間。于是，在無(wú)Ephrin-B1的生發(fā)中心里，盡管有過(guò)量Tfh細(xì)胞，也無(wú)法產(chǎn)生足夠的漿細(xì)胞。

本技術(shù)還能夠揭示效應(yīng)器官中免疫細(xì)胞運(yùn)動(dòng)之間的聯(lián)系。趨化因子在病毒感染過(guò)程中招募活化的效應(yīng)T細(xì)胞進(jìn)入感染部位，但其招募T細(xì)胞的機(jī)制未知。Lim等[25]發(fā)現(xiàn)，氣管中性粒細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)軌跡“指導(dǎo)”了流感特異性CD8 T細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)。他們借助于雙光子成像技術(shù)，觀察了流感病毒感染氣管的中性粒細(xì)胞及CD8 T細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的動(dòng)態(tài)軌跡，發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞遷移留下持久的、富含CXCL12的痕跡，CD8 T 細(xì)胞沿著此軌跡到達(dá)感染部位。Bartholo-maus等[26]則利用此技術(shù)成像了中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變中效應(yīng)CD8 T細(xì)胞與大腦結(jié)構(gòu)之間的相互作用過(guò)程。中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織通常既不允許細(xì)胞通過(guò)，也不允許血液中大多數(shù)分子通過(guò)，其特化的血管能有效屏蔽血液循環(huán)。研究者在EAE大鼠模型中，成像了從CD8 T到達(dá)到腦組織到出現(xiàn)疾病癥狀，整個(gè)過(guò)程中CD8 T細(xì)胞與大腦結(jié)構(gòu)之間的相互作用：CD8 T細(xì)胞到達(dá)軟腦膜血管后停止運(yùn)動(dòng)并開始監(jiān)視腔面，且其偏好于逆血流方向爬行，對(duì)外腔血管表面及其下方軟腦膜進(jìn)行持續(xù)掃描；在此處CD8 T細(xì)胞遇到呈遞外源性抗原與髓鞘抗原的吞噬細(xì)胞；此接觸刺激效應(yīng)T細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子，為其組織侵襲及炎癥浸潤(rùn)提供觸發(fā)信號(hào)。

2.3探究免疫應(yīng)答分子細(xì)胞機(jī)制的有力工具 現(xiàn)代科學(xué)的證明邏輯非常強(qiáng)調(diào)“眼見(jiàn)為實(shí)”?；铙w雙光子成像技術(shù)所獲取的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)屬于直接證據(jù)，其邏輯強(qiáng)度強(qiáng)于其他間接證據(jù)。雙光子成像技術(shù)結(jié)合基因敲除小鼠等手段，在闡述基礎(chǔ)免疫現(xiàn)象的細(xì)胞機(jī)理方面、在解析免疫相關(guān)疾病的分子機(jī)制方面及在探究免疫相關(guān)藥物的工作機(jī)理方面，均有著重要的應(yīng)用。

2.3.1解析基礎(chǔ)免疫現(xiàn)象 睪丸、毛囊及胎盤均是免疫抑制微環(huán)境，多種機(jī)制共同阻止免疫攻擊，保證了此處異體移植物的長(zhǎng)期存活。與上述器官不同，骨髓內(nèi)的微環(huán)境是存在免疫反應(yīng)的，但此處異源性移植的存活效率依然等同于同源移植，此處免疫豁免的機(jī)理不得而知。Fujisaki等[27]利用高分辨活體成像技術(shù)揭開了其機(jī)理。他們發(fā)現(xiàn)活體中造血干細(xì)胞與Treg 細(xì)胞存在明顯的共定位：二者聚集在顱蓋骨及小梁骨骨髓的骨內(nèi)膜表面，形成一種局部區(qū)域，此區(qū)域成為應(yīng)付免疫攻擊的“避難所”。

Sap基因敲除小鼠及其對(duì)應(yīng)的人類疾病均具有明顯的生發(fā)中心形成缺陷現(xiàn)象，但機(jī)制未知。祁海等[28]利用雙光子活體成像技術(shù)發(fā)現(xiàn)：Sap缺陷不破壞CD4 T與抗原遞呈細(xì)胞DC的穩(wěn)定接觸能力，但破壞CD4 T 與其同源B細(xì)胞的穩(wěn)定接觸能力，導(dǎo)致抗原特異性B細(xì)胞不能接收到適當(dāng)水平的T細(xì)胞輔助；而Sap缺陷T細(xì)胞由于缺乏與B細(xì)胞穩(wěn)定的相互作用，造成其不能有效招募并保留在新生的生發(fā)中心，進(jìn)而不能維持生發(fā)中心反應(yīng)。這為Sap缺乏導(dǎo)致生發(fā)中心缺陷提供了合理的分子解釋。

在黏膜免疫領(lǐng)域，雙光子成像技術(shù)也有重要應(yīng)用。腸道固有層DC(LP-DC)分為兩個(gè)亞群，一群是傾向誘導(dǎo)耐受，另一群偏好誘導(dǎo)炎癥，但兩者捕獲腸道抗原的機(jī)制知之甚少。Mcdole等[29]用一種破壞性極小的腸道組織活體成像方法，可視化了腸道杯狀細(xì)胞傳送抗原的過(guò)程。他們發(fā)現(xiàn)：小腸杯狀細(xì)胞在穩(wěn)態(tài)下，可作為從腸腔傳送低分子量、可溶性抗原到其底面的LP-DC的通道，并偏好于把抗原遞送給耐受DC,而非炎癥DC。此發(fā)現(xiàn)突出了杯狀細(xì)胞在腸道免疫自穩(wěn)中的重要功能。

2.3.2闡述免疫病理的分子細(xì)胞機(jī)制 全身感染或炎癥會(huì)導(dǎo)致學(xué)習(xí)及認(rèn)知功能受損，其機(jī)制知之甚少。Garre等[30]用雙鏈RNA類似物poly(I∶C) 模擬病毒感染的免疫激活，用雙光子顯微鏡長(zhǎng)時(shí)程對(duì)小鼠主要運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)第V層錐體神經(jīng)元突觸后樹突棘成像。他們發(fā)現(xiàn)，外周免疫激活導(dǎo)致樹突棘丟失，損害學(xué)習(xí)依賴性樹突棘的形成。并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，上述觀察到的皮層突觸的改變是由外周單核細(xì)胞通過(guò)TNF-α依賴機(jī)制破壞運(yùn)動(dòng)及學(xué)習(xí)相關(guān)樹突棘的可塑性產(chǎn)生，而非通過(guò)中樞神經(jīng)系統(tǒng)小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生。免疫復(fù)合物沉積導(dǎo)致的組織損傷是諸多自身免疫病發(fā)病的基礎(chǔ)。中性粒細(xì)胞是最早招募到復(fù)合物沉積位點(diǎn)的細(xì)胞，在塑造組織免疫應(yīng)答中扮演關(guān)鍵作用，但其與發(fā)病過(guò)程的關(guān)系并不清楚。Miyabe等[31]利用多光子活體成像技術(shù)及多種基因敲除小鼠，對(duì)免疫復(fù)合物誘導(dǎo)的小鼠關(guān)節(jié)炎成像，揭開了整個(gè)復(fù)雜過(guò)程的細(xì)節(jié)及相關(guān)機(jī)理：補(bǔ)體 C5a直接致使中性粒細(xì)胞黏附在關(guān)節(jié)內(nèi)膜并啟動(dòng)炎癥，且其受體C5aR是中性粒細(xì)胞黏附的關(guān)鍵分子；此黏附進(jìn)而導(dǎo)致關(guān)節(jié)內(nèi)皮β2 整合素依賴的中性粒細(xì)胞捕獲，并造成中性粒細(xì)胞爬行方向的改變。進(jìn)一步，BLT1介導(dǎo)第一批中性粒細(xì)胞滲出血管，隨后CCR1促進(jìn)中性粒細(xì)胞在關(guān)節(jié)內(nèi)皮爬行，而CXCR2則放大晚期中性粒細(xì)胞的招募及其在關(guān)節(jié)內(nèi)的存活。

2.3.3探究免疫相關(guān)藥物的效應(yīng)機(jī)理 CD20單抗能有效治療B細(xì)胞腫瘤，但其導(dǎo)致B細(xì)胞清除的細(xì)節(jié)并不清楚。Montalvao等[32]利用活體成像技術(shù)發(fā)現(xiàn)肝臟是B細(xì)胞清除的主要位置，枯否細(xì)胞(KC)介導(dǎo)肝臟血竇內(nèi)循環(huán)B細(xì)胞的瞬時(shí)捕獲及吞噬。此發(fā)現(xiàn)解釋了B細(xì)胞數(shù)量在二級(jí)淋巴結(jié)下降的原因。

PD-1抗體(aPD-1)在多種實(shí)體瘤中的有效性已得到證實(shí)。但aPD-1總體應(yīng)答率低，如何提高aPD-1效果與應(yīng)答范圍極其重要。對(duì)aPD-1效應(yīng)機(jī)制的解析有利于進(jìn)一步提高藥物效果。Arlauckas等[33]利用活體成像技術(shù)，亞細(xì)胞分辨率揭示aPD-1的實(shí)時(shí)命運(yùn)與活性狀態(tài)。其發(fā)現(xiàn)aPD-1在注射后的早期，能有效結(jié)合PD-1陽(yáng)性腫瘤浸潤(rùn)C(jī)D8 T，但此結(jié)合非常短暫，幾分鐘后aPD-1被PD-1陽(yáng)性腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞捕獲。他們進(jìn)一步展示，巨噬細(xì)胞捕獲aPD-1 依賴于藥物Fc結(jié)構(gòu)域多糖及宿主髓樣細(xì)胞Fcγ受體。在注射aPD-1之前阻斷Fcγ受體，可以很大程度延長(zhǎng)aPD-1與腫瘤浸潤(rùn)C(jī)D8 T的結(jié)合時(shí)間，進(jìn)而增強(qiáng)aPD-1的治療效果。

2.4發(fā)現(xiàn)新現(xiàn)象，修訂舊觀點(diǎn) 活體成像技術(shù)的長(zhǎng)時(shí)程、大視野觀察可以發(fā)現(xiàn)諸多細(xì)胞層次上有趣現(xiàn)象?；铙w成像技術(shù)發(fā)現(xiàn)了中性粒細(xì)胞成群“蜂擁”密集招募于感染位點(diǎn)的現(xiàn)象[34]。中性粒細(xì)胞從血液招募到損傷位點(diǎn)是早期固有免疫應(yīng)答的特征之一。中性粒細(xì)胞滲出血管后，展現(xiàn)出極度協(xié)調(diào)的趨化性，并出現(xiàn)“成簇”現(xiàn)象，其特征類似于昆蟲的密集“蜂擁”行為。Lammermann等[35]利用雙光子顯微鏡技術(shù)揭示了上述局部死亡細(xì)胞信號(hào)長(zhǎng)距離傳播的分子機(jī)制；并發(fā)現(xiàn)中心粒細(xì)胞密集成群行為協(xié)同膠原纖維等形成一個(gè)有邊緣的、緊密的傷口“密封”，此“密封”實(shí)現(xiàn)了把感染部位從周圍正常組織區(qū)分出來(lái)的效果。

祁海團(tuán)隊(duì)在淋巴結(jié)生發(fā)中心發(fā)現(xiàn)了T-B 細(xì)胞“糾纏”現(xiàn)象[36]。利用雙光子顯微活體成像技術(shù)，他們發(fā)現(xiàn)生發(fā)中心里T-B細(xì)胞互作與其他組織部位不同，每次互作時(shí)間很短，但胞膜接觸面積很大，使T細(xì)胞可以通過(guò)這種接觸面迅速向B細(xì)胞胞吐傳遞預(yù)先已經(jīng)準(zhǔn)備好的促增殖、促存活的輔助信號(hào)。通過(guò)這種“糾纏”般短暫而頻繁的接觸，T細(xì)胞可以更容易鑒別哪些B細(xì)胞是高親和力的，使這些B細(xì)胞積攢更多輔助信號(hào)。他們還發(fā)現(xiàn)，B細(xì)胞表達(dá)ICOSL配體，通過(guò)刺激T細(xì)胞的ICOS受體促進(jìn)T細(xì)胞鈣響應(yīng)，進(jìn)而增大糾纏互作中T-B細(xì)胞的接觸面積及T細(xì)胞通過(guò)胞吐傳遞輔助信號(hào)的效率。

Woodruff等[37]則在流感疫苗接種中發(fā)現(xiàn)了淋巴結(jié)定植DC(LN-DC)的跨節(jié)點(diǎn)遷移現(xiàn)象。在疫苗接種中，LN-DC的合適刺激與接種免疫的有效性密切相關(guān)。利用小鼠的滅活流感疫苗模型結(jié)合全淋巴結(jié)成像方法，其觀察到LN-DC在疫苗接種幾分鐘內(nèi)產(chǎn)生跨淋巴結(jié)節(jié)點(diǎn)的復(fù)位，進(jìn)入到特異抗原收集位點(diǎn)。LN-DC在到達(dá)特異抗原收集位點(diǎn)后獲取病毒抗原，啟動(dòng)病毒特異性CD4 T 細(xì)胞活化；并可以在缺少皮膚DC的情況下，導(dǎo)致生發(fā)中心形成及產(chǎn)生B細(xì)胞記憶。此揭示了LN-DC在快速定位病毒抗原、驅(qū)動(dòng)T細(xì)胞群體早期活化中的重要地位。

華中科技大學(xué)張智紅團(tuán)隊(duì)則利用長(zhǎng)時(shí)程活體成像發(fā)現(xiàn)了實(shí)體瘤微環(huán)境中的“免疫抑制環(huán)”現(xiàn)象[38]。該團(tuán)隊(duì)利用多色熒光活體成像技術(shù)觀察了黑色素瘤聯(lián)合免疫治療中的關(guān)鍵細(xì)胞事件。他們發(fā)現(xiàn)，Treg 細(xì)胞在實(shí)體腫瘤周圍形成一個(gè)免疫抑制環(huán)；聯(lián)合免疫治療能減輕免疫抑制、引起浸潤(rùn)的內(nèi)源性免疫細(xì)胞瞬間活化、促進(jìn)CTL聚集并加速DC浸潤(rùn)。

Gabanyi等[39]發(fā)現(xiàn)了腸道內(nèi)肌肉層巨噬細(xì)胞的快速活化現(xiàn)象。小腸組織中存在著多種類型巨噬細(xì)胞，固有層巨噬細(xì)胞是靠近小腸壁的一群細(xì)胞，而肌層巨噬細(xì)胞則位于小腸組織的深層部位。利用多光子活體顯微鏡及多種熒光報(bào)告小鼠，他們觀察到兩群巨噬細(xì)胞不僅形態(tài)與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)方面存在差異，其周圍小腸神經(jīng)元分布也存在差異。肌層巨噬細(xì)胞與活化的神經(jīng)元密切相關(guān)，其表面受體對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生的去甲腎上腺素信號(hào)產(chǎn)生應(yīng)答。利用本技術(shù)可以動(dòng)態(tài)觀察的特點(diǎn)，他們還發(fā)現(xiàn)肌層巨噬細(xì)胞能在感染后1～2 h內(nèi)激活，明顯快于完全依賴免疫系統(tǒng)的應(yīng)答過(guò)程。

活體成像技術(shù)修訂了CTL殺傷靶細(xì)胞的部分認(rèn)知。體外實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明T 細(xì)胞能快速有效的殺傷靶細(xì)胞，但Halle等[40]則發(fā)現(xiàn)活體內(nèi)CTL對(duì)病毒感染細(xì)胞的殺傷效率并非如此高。他們?cè)谛∈蟛《靖腥灸Ｐ椭欣秒p光子活體成像，通過(guò)實(shí)時(shí)成像及數(shù)學(xué)模型分析定量了CTL介導(dǎo)的殺傷效率：平均1個(gè)CTL 1 d時(shí)間殺傷1～16個(gè)病毒感染細(xì)胞；而病毒誘導(dǎo)MHCⅠ分子下調(diào)后，CTL則不能破壞其靶細(xì)胞。他們還發(fā)現(xiàn)CTL在殺傷過(guò)程中不與靶細(xì)胞形成穩(wěn)定突觸，且每個(gè)CTL 在功能上具有強(qiáng)烈的異質(zhì)性。

3 小結(jié)與展望

雖然雙光子熒光顯微成像技術(shù)有著諸多優(yōu)點(diǎn)，但過(guò)高的平臺(tái)要求及技術(shù)要求，使其沒(méi)有像共聚焦顯微鏡那樣得到非常普遍的應(yīng)用，可謂是一個(gè)貴族技術(shù)。首先，其需要昂貴的顯微鏡配置平臺(tái)，通常需要1～2臺(tái)雙光子顯微鏡及1臺(tái)共聚焦顯微鏡相配合。其次，需要根據(jù)待成像免疫器官及疾病器官的不同，設(shè)計(jì)、定制個(gè)性化的載物臺(tái)及固定裝置。第三，需要多種熒光報(bào)告工具小鼠。第四，需要長(zhǎng)時(shí)間的工具鼠與基因敲除小鼠的雜交。第五，需要強(qiáng)調(diào)的是，雙光子活體成像技術(shù)作為一種影像學(xué)技術(shù)，其仍需與其他技術(shù)聯(lián)合才能完整地完成科學(xué)問(wèn)題的證明。

在免疫學(xué)領(lǐng)域，到目前為止全球僅有十余家實(shí)驗(yàn)室可以穩(wěn)定使用本技術(shù)高效產(chǎn)出。但隨著技術(shù)的逐步積累，雙光子活體成像技術(shù)會(huì)得到進(jìn)一步的普及。雙光子活體成像技術(shù)動(dòng)態(tài)可視化的特點(diǎn)，必將使其在現(xiàn)代生命科學(xué)的諸多領(lǐng)域具有更為廣泛而深入的應(yīng)用。

致謝：感謝華中科技大學(xué)張智紅教授及其團(tuán)隊(duì)的技術(shù)培訓(xùn)。