外泌體在缺血性腦卒中的研究進(jìn)展

李佳帥，朱路文，葉濤，李宏玉，梁碧瑩，唐強(qiáng)

1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱市150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江哈爾濱市150001

腦卒中是一種發(fā)病機(jī)制復(fù)雜的腦血管疾病。全球每年約有1500萬人患有腦卒中，約有500萬人死亡，是造成死亡的第二大病因，也是長期致殘的主要原因，其中缺血性腦卒中約占腦卒中總數(shù)的80%[1]。

盡管已有大量研究開展了諸多臨床試驗(yàn)，但目前仍然缺乏安全、高效的治療方法。因此，尋找治療缺血性腦卒中的新療法，是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的重要任務(wù)。越來越多的研究顯示，外泌體不僅有望成為缺血性腦卒中診斷新的生物標(biāo)志物，同時具備良好的治療潛能。

1 外泌體概述

外泌體是細(xì)胞通過“內(nèi)吞—融合—外排”等一系列生物學(xué)機(jī)制產(chǎn)生并主動向胞外分泌的直徑約為40～100 nm的囊泡樣小體，本質(zhì)是脂質(zhì)雙分子層[2]。它可由多種細(xì)胞分泌產(chǎn)生，如肥大細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)和腫瘤細(xì)胞等。這些細(xì)胞分泌的外泌體廣泛存在于人體體液中，可以在大多數(shù)體液如外周血、唾液、尿液、羊水、腹水和腦脊液等中檢測到[3]。

1983年，Johnstone首次在綿羊的網(wǎng)織紅細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)外泌體，起初它被認(rèn)為是一種“細(xì)胞垃圾袋”，用來清除細(xì)胞不需要的蛋白質(zhì)[4]。直到Raposo等[5]發(fā)現(xiàn)Β細(xì)胞分泌的外泌體可促進(jìn)T細(xì)胞的增殖分化，甚至可以抑制腫瘤的生長發(fā)育，人們才重新認(rèn)識到外泌體的功能。

外泌體中包含多種蛋白質(zhì)、脂類和遺傳物質(zhì)，是細(xì)胞間物質(zhì)傳遞和信息交流的一種重要方式，在神經(jīng)再生、血管新生、免疫應(yīng)答、抗原呈遞以及RNA和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等方面具有生物學(xué)功能。有研究顯示，外泌體還具有穿過血腦屏障的能力[6]。

因此，外泌體逐漸成為近年來生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的一大熱點(diǎn)，并且在缺血性腦卒中的診斷和治療方面顯示出極大的潛能。

2 外泌體在細(xì)胞間通信中的作用

在外泌體眾多的生理功能中，介導(dǎo)細(xì)胞之間的通信最為重要。細(xì)胞間通信的協(xié)調(diào)對于體內(nèi)各種系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)的調(diào)控具有重要意義，尤其是對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)[7]。

細(xì)胞間的通信大致可分為直接接觸和間接接觸兩種方式，其通信機(jī)制包括細(xì)胞黏附、縫隙連接，以及生物活性分子的釋放，如神經(jīng)遞質(zhì)和生長因子[8]。研究顯示，細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)運(yùn)輸生物活性分子越來越成為細(xì)胞間通信的通用機(jī)制。外泌體作為一種EVs小體，能運(yùn)輸RNA，包括mRNA、微小RNA(microRNA，miRNA)、tRNA，以及蛋白質(zhì)等多種物質(zhì)。外泌體不僅是細(xì)胞間物質(zhì)和信息的運(yùn)輸載體，還可對其所攜帶的各種生物分子進(jìn)行“分揀”，嚴(yán)格地調(diào)控著信息分子的傳遞，對細(xì)胞具有靶向調(diào)節(jié)作用[9]。研究表明，外泌體中所含RNA是調(diào)節(jié)受體細(xì)胞活動的主要物質(zhì)[10]。同時，外泌體還可水平轉(zhuǎn)移miRNA至受體細(xì)胞。

miRNA是長度約22個核苷酸的非編碼單鏈RNA，在轉(zhuǎn)錄后可對基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，是細(xì)胞間交流的主要調(diào)節(jié)物質(zhì)，可作為信號分子直接傳達(dá)遺傳信息，調(diào)節(jié)細(xì)胞功能，介導(dǎo)大腦中的細(xì)胞間信號，而不需要細(xì)胞間的直接接觸[11]。外泌體具有通過遞送RNA信號來建立細(xì)胞間通信的能力，這無疑又為細(xì)胞間通信機(jī)制的研究增加了一個新的方向，因此，由外泌體所介導(dǎo)的一種新的細(xì)胞間通信機(jī)制已逐漸引起研究者的廣泛關(guān)注。

外泌體作為細(xì)胞間通信介質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)是，可以將信息分子遞送到多個受體細(xì)胞，其所含miRNA通過外泌體的轉(zhuǎn)移，可以在受體細(xì)胞中改變基因表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞功能。盡管外泌體是介導(dǎo)細(xì)胞間通信的一種新機(jī)制已經(jīng)被提出，但其中信號傳導(dǎo)的具體細(xì)節(jié)尚不清楚，miRNA等小分子對受體細(xì)胞靶向調(diào)節(jié)的具體機(jī)制仍未知。

另外，外泌體中所含內(nèi)容物如何分配及如何觸發(fā)在不同細(xì)胞中釋放的機(jī)制也是亟待探索的問題。對這些問題的解答或許可以為我們在藥物運(yùn)輸、基因治療等方面開啟全新的視角[12]。

3 外泌體源性miRNA有望成為缺血性腦卒中診療新的生物標(biāo)志物

傳統(tǒng)上將生物標(biāo)志物定義為可用于檢測疾病的發(fā)生、發(fā)展或評估治療有效性的生物學(xué)特征[13]，對于診斷缺血性腦卒中后嚴(yán)重程度和預(yù)后具有重要意義。

目前，已發(fā)現(xiàn)氧化損傷、炎癥反應(yīng)、血栓形成和腦損傷等多種相關(guān)生物標(biāo)志物，但這些標(biāo)志物在臨床應(yīng)用中具有一定的局限性[14]。因此找到更為有效、可靠的生物標(biāo)志物是缺血性腦卒中相關(guān)研究的一大挑戰(zhàn)。

近年來，研究者開始關(guān)注外泌體源性miRNA作為新的生物標(biāo)志物的潛在優(yōu)勢，旨在探索疾病中新的病理生理機(jī)制[15]。有研究顯示，外泌體源性miRNA適合作為生物標(biāo)志物，它廣泛分布于各種體液中，而且能夠被外泌體膜結(jié)構(gòu)保護(hù)而避免被分解，具有較長的半衰期，從而可以在體液循環(huán)和血清中穩(wěn)定檢測到[16]，同時也保證了獲得方法的無創(chuàng)或較小創(chuàng)傷。作為非侵入疾病診斷方法，不僅可以提高疾病的早期診斷率，還可減輕病患疼痛[17]。外泌體源性miRNA作為生物標(biāo)志物用于診斷和預(yù)后具有很大的潛能。

有研究報(bào)道，外泌體中多個miRNA在缺血性腦卒中發(fā)生后表達(dá)水平均有改變，提示外泌體源性miRNA可能是該病進(jìn)程中的一個關(guān)鍵因素，有望成為與缺血性腦卒中診斷、治療和預(yù)后相關(guān)的新的生物標(biāo)志物[18]。

Mirzaei等[19]研究報(bào)道，缺血性腦卒中發(fā)生后，80余個miRNA表達(dá)水平發(fā)生變化，其中可在血液中檢測到變化的循環(huán)miRNA有60余個。Yang等[20]比較缺血性腦卒中患者和健康者的miRNA水平后發(fā)現(xiàn)，患者體內(nèi)miRNA-107(miR-107)、miR-128b和miR-153的表達(dá)水平分別為健康者的2.78、2.13和1.83倍，并指出，這些差異顯著的miRNA可作為缺血性腦卒中診斷的生物標(biāo)志物。有學(xué)者通過研究急性缺血性腦卒中(acute ischemic stroke,AIS)患者血清外泌體的濃度和血清外泌體中miR-9和miR-124(兩種腦特異性miRNA)的水平變化，發(fā)現(xiàn)AIS患者血清外泌體的濃度和血清外泌體中miR-9和miR-124的水平明顯高于對照組，且miR-9，miR-124的水平與美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表(National Institutes Health Stroke Scale,NIHSS)評分、梗死體積以及血清白細(xì)胞介素-6濃度呈正相關(guān)[21]。這一結(jié)果表明，血清外泌體中miR-9和miR-124有望成為診斷AIS和評估缺血損傷程度新的生物標(biāo)志物。

隨著對miRNA與缺血性腦卒中相關(guān)研究的不斷深入，更多可用作生物標(biāo)志物的miRNA被發(fā)現(xiàn)，其在缺血性腦卒中進(jìn)程中的作用正在研究中。

4 外泌體有望成為治療缺血性腦卒中的新的藥物載體

治療缺血性腦卒中等CNS疾病的一個重要障礙就是沒有有效的載體將藥物轉(zhuǎn)運(yùn)通過血腦屏障，從而發(fā)揮治療作用。血腦屏障是一種高度分化的系統(tǒng)，具有精細(xì)和緊密的黏附連接，由腦微血管的內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞、基底膜和星形膠質(zhì)細(xì)胞共同構(gòu)成[22]。血腦屏障嚴(yán)格控制著腦實(shí)質(zhì)和外周血之間離子、分子和細(xì)胞的交換，以確保CNS的正常功能[23]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，所有小分子中約有98%不能穿過血腦屏障。劉辰庚等[24]將提取自阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)模型小鼠腦脊液中的外泌體源性miR-135a轉(zhuǎn)入正常小鼠腦室，結(jié)果正常小鼠腦脊液和血漿內(nèi)miR-135a的表達(dá)水平均升高。血腦屏障并不允許核酸分子自由通過，該研究提示，外泌體能跨越血腦屏障，且能將miR-135a這一生物信息傳達(dá)至外周血，也能將這一信號傳入腦細(xì)胞內(nèi)，并發(fā)揮miR-135a的生物學(xué)作用。

目前應(yīng)用外泌體治療疾病的方式主要有2種：①利用電穿孔或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方式把藥物轉(zhuǎn)入外泌體；②通過基因工程技術(shù)調(diào)控外泌體相關(guān)基因的表達(dá)。

可見，外泌體以其低免疫排斥、較高的運(yùn)輸效率、可穿過血腦屏障等優(yōu)勢，有望成為新的藥物運(yùn)輸載體[25]。但是，目前外泌體作為藥物載體僅限于理論層面，與血腦屏障之間的相互作用機(jī)制尚未闡明，是否可行還有待研究[26]。

5 外泌體促進(jìn)缺血性腦卒中后神經(jīng)血管重塑

缺血性腦卒中發(fā)生后，主動脈栓塞觸發(fā)下游微血管繼發(fā)性血栓形成，造成腦內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞功能障礙，從而導(dǎo)致血腦屏障的破壞和缺血性細(xì)胞損傷[27]。下游微血管血栓形成的演變是異質(zhì)性的，且持續(xù)數(shù)小時，與缺血性神經(jīng)元死亡從可逆性到不可逆性的進(jìn)展高度相關(guān)[28]。

因此，治療缺血性腦卒中的主要目標(biāo)是要重建缺血性腦微血管中的腦血流量，保持血管完整性，并使神經(jīng)元的死亡程度降到最低[29]。其中血管新生、神經(jīng)再生及突觸可塑性是缺血性腦卒中恢復(fù)的關(guān)鍵過程[30]。

5.1 血管新生

血管新生是一個復(fù)雜和高度調(diào)控的過程，包括內(nèi)皮細(xì)胞的活化、增殖、遷移、發(fā)芽，基底膜形成，新血管生成成熟[31]，是缺血性腦卒中后生理功能恢復(fù)的首要因素。

血管新生需要大量生長因子，例如血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF)，再將生長因子以有效濃度遞送到作用部位[32]。其中外泌體在促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖及血管生成中扮演重要角色，它將所包含的mRNA和miRNA遞送到腦內(nèi)皮細(xì)胞中，促進(jìn)血管生成[33]。例如，在局灶性腦缺血小鼠模型中，通過下調(diào)腦血管中miR-15a的水平，可以提高FGF2和VEGF的表達(dá)水平，從而促進(jìn)缺血性腦卒中后周邊區(qū)域的血管生成[34]；小鼠腦內(nèi)皮細(xì)胞分泌的外泌體可轉(zhuǎn)移miRNA、mRNA至小鼠腦血管周細(xì)胞，提高VEGF-Β及其受體VEGFR-1的蛋白水平，介導(dǎo)血管生成[35]。

此外，腦血管新生和保護(hù)血腦屏障完整性需要激活腦內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞之間的Notch信號通路[36]。例如，由腦內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的膜Delta-like 4(DLL4)結(jié)合Notch配體，刺激周細(xì)胞上的Notch3受體，可以保持腦血管結(jié)構(gòu)靜止[37]。Notch信號通路與VEGF信號通路相互作用表明，外泌體可以介導(dǎo)腦內(nèi)皮細(xì)胞與周細(xì)胞間的通信，從而促進(jìn)血管生成，并能通過VEGF和Notch兩種信號傳導(dǎo)途徑來維持血腦屏障的完整性。

除了腦內(nèi)皮細(xì)胞外，循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞也參與血管新生。已有研究顯示，循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞分泌的外泌體可將與PI3K/Akt信號傳導(dǎo)途徑和促進(jìn)血管生成有關(guān)的miRNA(如miR-126和miR-296)轉(zhuǎn)移到受體內(nèi)皮細(xì)胞中。在受體內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)，這些miRNA激活PI3K/Akt信號通路，從而促進(jìn)血管生成[38-39]。

5.2 神經(jīng)再生

神經(jīng)損傷會導(dǎo)致髓鞘及軸突的破壞，影響神經(jīng)沖動的傳導(dǎo)。在CNS中，髓鞘是由少突膠質(zhì)細(xì)胞包繞軸突而形成，因此，缺血性腦卒中后少突膠質(zhì)細(xì)胞的分化與成熟以及軸突的生長，對神經(jīng)功能的修復(fù)起著重要作用。2006年Faure等[40]首次發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元可分泌外泌體。隨后，星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞等都被證明能分泌外泌體，因此多種腦細(xì)胞之間可以通過外泌體進(jìn)行物質(zhì)轉(zhuǎn)移和信號傳導(dǎo)，進(jìn)而形成神經(jīng)元-膠質(zhì)細(xì)胞信號網(wǎng)絡(luò)[41]。

外泌體中的多種miRNA參與缺血性腦卒中后的神經(jīng)重建過程。例如，miR-17-92可促進(jìn)腦缺血損傷后的神經(jīng)再生、增殖和功能恢復(fù)[42]；在大鼠模型中，富含miR-219的外泌體刺激少突膠質(zhì)細(xì)胞前體分化成髓鞘細(xì)胞，并促進(jìn)髓鞘在CNS中的形成[43]。有報(bào)道顯示，在眾多miRNA中，miR-124在CNS中的表達(dá)最為豐富。在腦室區(qū)的神經(jīng)祖細(xì)胞內(nèi)，外泌體所含miR-124的衰減會減少神經(jīng)元分化，而表達(dá)水平升高則會促進(jìn)神經(jīng)元的生長。同時發(fā)現(xiàn)，缺血性腦卒中后miR-124在缺血半暗帶中的表達(dá)水平升高[44-45]。

外泌體中的miR-124可促進(jìn)神經(jīng)血管生成，并起到重要的神經(jīng)保護(hù)作用。Yang等[46]將被狂犬病病毒糖蛋白(rabies virus glycoprotein,RVG)修飾的miR-124，通過外泌體遞送到大腦皮質(zhì)，來研究其是否可以防止皮質(zhì)缺血。結(jié)果顯示，外泌體可以將被RVG修飾的miR-124轉(zhuǎn)運(yùn)至缺血區(qū)，且能通過促進(jìn)梗死部位的神經(jīng)祖細(xì)胞中神經(jīng)元的生長來改善腦損傷。這個研究表明，外泌體中的miR-124在神經(jīng)保護(hù)和修復(fù)方面的潛能。

此外，外泌體還可將RNA和其他物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到軸突，促進(jìn)缺血性腦卒中損傷后的軸突再生[47]；MSCs也可通過外泌體將miR-133b轉(zhuǎn)運(yùn)至神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞以促進(jìn)軸突生長[48]。

5.3 突觸可塑性

核內(nèi)體與質(zhì)膜的融合是突觸可塑性的基本機(jī)制。在果蠅中，外泌體是神經(jīng)肌肉接頭處蛋白質(zhì)跨突觸轉(zhuǎn)移的載體，如Wnt信號。Wnt信號在突觸發(fā)育和可塑性中起關(guān)鍵作用，它可通過外泌體運(yùn)輸穿過突觸。有研究顯示，外泌體可介導(dǎo)Wnt1/Wingless蛋白在果蠅神經(jīng)肌肉接頭處的跨突觸轉(zhuǎn)移，使突觸成熟。

電突觸和化學(xué)性突觸傳遞是信號在神經(jīng)元回路內(nèi)傳播的主要手段[49]。神經(jīng)元能分泌外泌體，這種分泌可通過鈣和谷氨酸能突觸活性來調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)神經(jīng)元的外泌體分泌，可能是局部消除不需要的蛋白質(zhì)和RNA的一種方式，促進(jìn)突觸可塑性，而不需要樹突將蛋白質(zhì)和RNA轉(zhuǎn)運(yùn)到主要存在于體細(xì)胞和近端樹突的溶酶體中，提示神經(jīng)元分泌的外泌體可能代表了CNS內(nèi)細(xì)胞間通信的一種新方式[50]。

在谷氨酸能刺激下，皮層神經(jīng)元分泌含有神經(jīng)元細(xì)胞黏附分子L1和α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸(alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid,AMPA)受體亞基GluR2/3的外泌體，在突觸可塑性中發(fā)揮重要作用[7]。其中AMPA受體是促進(jìn)突觸可塑性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)受體，它的激活有助于缺血性腦卒中后運(yùn)動功能恢復(fù)。同時，與神經(jīng)元軸突接觸的少突膠質(zhì)細(xì)胞受谷氨酸能刺激而分泌外泌體，這些外泌體在一定條件下可增強(qiáng)神經(jīng)元存活。

此外，外泌體中miRNA所介導(dǎo)的通信網(wǎng)絡(luò)可控制突觸前和突觸后細(xì)胞的交流。例如，神經(jīng)元分泌外泌體中的miRNA控制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體-1(glutamate transporter 1,GLT-1)的生物表達(dá)[51]?？傊?，外泌體作為細(xì)胞間通信的新載體，參與了突觸可塑性的調(diào)節(jié)。

外泌體參與缺血性腦卒中發(fā)生后血管新生、神經(jīng)再生、突觸可塑性等諸多病理過程，其中miRNA介導(dǎo)的信號網(wǎng)絡(luò)更是在腦缺血損傷后的大腦修復(fù)過程中起到關(guān)鍵性作用[52]。

6 MSCs源性外泌體有望用于缺血性腦卒中的治療

到目前為止，給予組織型纖溶酶原激活劑(tissue plasminogen activator,tPA)是治療缺血性腦卒中患者的唯一有效方法。然而，這種治療只適用于一小部分及時住院的患者。此外，tPA的使用還可能導(dǎo)致某些患者發(fā)生出血性轉(zhuǎn)化的風(fēng)險(xiǎn)[53]。

近年來，MSCs的功能機(jī)制已成為研究熱點(diǎn)。MSCs是一類擁有自我更新、多分化潛能的多功能細(xì)胞。大量研究報(bào)道了MSCs移植具有顯著的大腦功能修復(fù)療效，但由于其潛在的致瘤、栓塞風(fēng)險(xiǎn)以及低存活率等缺點(diǎn)限制了其臨床應(yīng)用[54]。

然而有研究表明，MSCs源性外泌體相比MSCs能發(fā)揮更好的治療作用。MSCs源性外泌體通過分泌活性因子來介導(dǎo)腦修復(fù)的信號通路，從而促進(jìn)缺血性腦卒中后的血管新生、神經(jīng)再生和突觸重塑。

Doeppner等[55]系統(tǒng)地比較了MSCs源性外泌體和MSCs對暫時局灶性腦缺血小鼠模型的神經(jīng)恢復(fù)和腦重構(gòu)的影響，結(jié)果顯示，MSCs源性外泌體極好地模擬了MSCs治療腦缺血的有益效果。

此外，通過研究MSCs源性外泌體的機(jī)制發(fā)現(xiàn)，MSCs源性外泌體減弱了外周免疫抑制，并促進(jìn)神經(jīng)元存活和血管生成。Xin等[56]研究了MSCs源性外泌體對大鼠大腦中動脈閉塞后神經(jīng)血管重塑和腦功能的影響，結(jié)果顯示，MSCs處理組和MSCs源性外泌體處理組之間沒有顯著差異。這些發(fā)現(xiàn)支持MSCs源性外泌體可以代替MSCs的想法[57]。但MSCs源性外泌體的相關(guān)作用機(jī)制尚不清楚，仍有待進(jìn)一步研究。

7 小結(jié)

相對于腫瘤、心肌缺血等疾病，外泌體在缺血性腦卒中方面的研究還較少，目前主要集中在缺血后的損傷修復(fù)機(jī)制。

外泌體作為介導(dǎo)缺血性腦卒中后大腦功能恢復(fù)的重要細(xì)胞間參與者，以其可穿過血腦屏障的獨(dú)有優(yōu)勢，在生物標(biāo)志物、藥物載體、神經(jīng)血管重塑以及治療等方面顯示出極大的潛能。但外泌體的研究還處于起步階段，仍然面臨著以下問題。

①外泌體中各種生物活性分子的相關(guān)作用機(jī)制尚未完全闡明，仍無法將其切實(shí)地用于缺血性腦卒中等疾病的診斷和治療；②外泌體中RNA的研究目前大部分局限于miRNA，其他特異性RNA發(fā)現(xiàn)較少；③外泌體存在于大部分體液中，且體液本身也存在與外泌體內(nèi)容物相同的成分，因此，外泌體的分離和提純尤為重要，但目前還未找到穩(wěn)定高效的提取制備技術(shù)。

因此，外泌體在缺血性腦卒中的診斷和預(yù)后方面的研究仍舊任重而道遠(yuǎn)，需要研究者們進(jìn)一步去探尋。

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