Micro RNA—210誘導(dǎo)大鼠急性心肌梗死區(qū)域內(nèi)微血管新生作用機(jī)制研究

饒大勇　樊仲國(guó)　朱灝

【摘要】目的 研究micro RNA-210（miRNA-210）在大鼠急性心肌梗死（AMI）中調(diào)節(jié)微血管新生作用并探討其相關(guān)機(jī)制。方法 將大鼠按1：1隨機(jī)分為：假手術(shù)組（Sham組）、心肌梗死+陰性病毒對(duì)照組（AMI+NV）、心肌梗死組（AMI+PBS）、心肌梗死+miRNA-210激動(dòng)劑體內(nèi)轉(zhuǎn)染組（AMI+miRNA-210 agonist）。術(shù)后4周以微血管密度（MVD）為效應(yīng)終點(diǎn)，檢測(cè)各組內(nèi)miRNA-210、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的mRNA；檢測(cè)HGF及肌球蛋白重鏈（β-MHC）的表達(dá)，小干擾RNA（siRNA）處理HGF，以WB檢測(cè)效應(yīng)終點(diǎn)。結(jié)果 AMI+miRNA-210 agonist組HGF表達(dá)水平、微血管密度（MVD）隨miRNA-210表達(dá)增加而顯著增加；低氧環(huán)境下siRNA顯著抑制HUVECs中HGF表達(dá)，CD 31表達(dá)水平也顯著下降；AMI+miRNA-210 agonist組大鼠心臟收縮功能更為優(yōu)越。結(jié)論 心肌內(nèi)miRNA-210過表達(dá)可上調(diào)梗死區(qū)域內(nèi)HGF表達(dá)水平，促進(jìn)血管新生，改善心臟收縮功能。

【關(guān)鍵詞】微小RNA-210；急性心肌梗死；肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子；血管新生

【中圖分類號(hào)】R541 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B 【文章編號(hào)】ISSN.2095.6681.2018.32..02

急性心肌梗死（AMI）屬心血管疾病，致死率高，患者常伴隨并發(fā)癥，這與心肌纖維化、心室重構(gòu)等相關(guān)[1]。因此，促進(jìn)血管新生，加速心肌細(xì)胞功能復(fù)蘇或可緩解這一過程。Micro RNAs（miRNAs）與AMI的發(fā)生有關(guān)，對(duì)診斷AMI具有一定價(jià)值[2]。MiRNA-210為低氧應(yīng)答因子，可調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞（EC）的凋亡、遷移。目前，miRNA-210在AMI中對(duì)血管新生的調(diào)節(jié)作用仍存在爭(zhēng)議，因此，本研究通過研究miRNA-210在心肌梗死中的新生血管調(diào)節(jié)效應(yīng)，嘗試找出其可能的作用基因靶點(diǎn)并探討相關(guān)機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備及試劑

BIOER熒光定量PCR儀（博日，杭州）、Gel Doc 2000 成像系統(tǒng)（BIO-RAD，美國(guó)）、小動(dòng)物超聲儀（維勝，加拿大）；一抗-MHC（#ab 50967）（艾博抗）、一抗-HGF（#BA 0911）（博士德）等。

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.2.1 動(dòng)物飼養(yǎng)

南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供成年雄性SD大鼠（4周齡，220～240 g），室溫：20℃左右，照明：12 h/d，飼養(yǎng)一周后手術(shù)操作。

1.2.2 心肌梗死模型建立、分組及慢病毒載體轉(zhuǎn)染

對(duì)大鼠行冠脈前降支結(jié)扎，建立模型。隨機(jī)將其分為：假手術(shù)組（Sham組）：縫針穿過心肌而不行結(jié)扎，心肌梗死+陰性病毒對(duì)照組（AMI+NV），心肌梗死組（AMI+PBS），心肌梗死+miRNA-210激動(dòng)劑體內(nèi)轉(zhuǎn)染組（AMI+miRNA-210 agonist）。MiRNA-210激動(dòng)劑和和陰性對(duì)照病毒分別加入PBS緩沖液中混勻成0.5 mL混合液，其余組大鼠尾靜脈注射PBS緩沖液0.5 mL。

1.2.3 大鼠心功能評(píng)估及樣本獲取

術(shù)后4周行超聲心動(dòng)圖，包括：左室收縮期及舒張期內(nèi)徑（LVDs，LVDd）、左室收縮期及舒張期容積（LV VOLs，LV VOLd）。計(jì)算左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）及左室縮短速率（LVFS）。取心臟組織（剪去血管、右心房、心室組織），心尖部以備即時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）及蛋白印跡實(shí)驗(yàn)（WB），其余留作形態(tài)學(xué)檢測(cè)等。

1.2.4 qRT-PCR

檢測(cè)miRNA-210、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的表達(dá)水平。甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為定量?jī)?nèi)參。Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物序列。提取總RNA，以（2-ΔΔCt）法定量分析。

1.2.5心臟標(biāo)本形態(tài)學(xué)檢測(cè)及免疫組化分析

對(duì)標(biāo)本進(jìn)行染色，CD 31抗原結(jié)合EC后計(jì)算相關(guān)指標(biāo)。計(jì)算方法：每個(gè)區(qū)域選取微血管密集的三處計(jì)數(shù)并取平均值，平均光密度=累計(jì)光密度/區(qū)域面積，以兩處區(qū)域平均光密度的算術(shù)平均數(shù)為此標(biāo)本的微血管密度（MVD）。采集圖像，以Image-Pro Plus 6.0軟件量化分析。

1.3 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）（美國(guó)模式培養(yǎng)物研究所（Manassas，VA，美國(guó)））按培養(yǎng)狀態(tài)分為常氧組（normoxia condition）和低氧組（hypoxic condition）。低氧組HUVECs達(dá)50%孵育率后分為兩組：接受小干擾RNA（siRNA）轉(zhuǎn)染（siHGF組）、平行對(duì)照組（control組），以WB分析。

1.4 WB分析

檢測(cè)心肌內(nèi)HGF及β-MHC蛋白表達(dá)水平。繪制曲線，上樣，轉(zhuǎn)膜，洗膜，封閉。稀釋一抗，次日洗膜；稀釋二抗，反應(yīng)1h。Actin為內(nèi)參。檢測(cè)HUVECs中HGF、CD 31表達(dá)水平，步驟基本同上，GAPDH為內(nèi)參。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件完成數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，正態(tài)分布資料采用t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間比較，多組間相互比較采用單因素方差分析法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠存活情況

術(shù)前：48只；術(shù)后存活：Sham組12只，AMI+NV組7只，AMI+PBS組8只，AMI+miRNA-210 agonist 組9只。

2.2 心肌內(nèi)miRNA-210及HGF、β-MHC表達(dá)變化情況

AMI+miRNA-210 agonist組miRNA-210表達(dá)水平增加最為顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）；該組內(nèi)HGF表達(dá)隨之亦顯著增加；各組VEGF的表達(dá)水平無(wú)顯著差異，見圖1。AMI+miRNA-210 agonist組HGF的表達(dá)隨miRNA-210表達(dá)的增加而增加，AMI+NV組β-MHC表達(dá)水平增加最為顯著，見圖2。

Ⅰ：sham組；Ⅱ：AMI+NV組；Ⅲ：AMI+PBS組；Ⅳ：AMI+miRNA-210 agonist組。說明：*：P<0.05 vs.Ⅰ；#：P<0.05 vs.Ⅱ；&：P<0.05 vs.Ⅲ。

2.3 心肌內(nèi)HGF過表達(dá)對(duì)HUVECs的影響

siRNA顯著抑制HGF蛋白表達(dá)，見圖3。CD 31表達(dá)水平在低氧環(huán)境中隨HGF的增加而顯著升高；siRNA處理后，EC的分化及增殖速度受到明顯抑制，CD 31表達(dá)隨之顯著下降，見圖4。

2.4 心肌內(nèi)miRNA-210過表達(dá)所致心肌組織病理生理及心功能改變

2.4.1 心肌組織內(nèi)微血管密度計(jì)數(shù)

與對(duì)照組相比，AMI+NV組平均光密度顯著衰減（P=0.045）；差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。AMI+miRNA-210 agonist組較AMI+NV組顯著增強(qiáng)（P=0.029），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖5。

Ⅰ：sham組；Ⅱ：AMI+NV組；Ⅲ：AMI+PBS組；Ⅳ：AMI+miRNA-210 agonist組。說明：*：P<0.05 vs.Ⅰ；#：P<0.05 vs.Ⅱ。

2.4.2 梗死心肌病理改變

三組大鼠心肌纖維均被破壞，AMI+NV組破壞程度甚于AMI+PBS組；AMI+miRNA-210 agonist組破壞程度最小，但仍可見大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及結(jié)締組織增生，見圖6。

2.4.3 超聲心動(dòng)圖評(píng)估大鼠心功能

AMI+NV組LVDs、LV VOLs增大最為顯著，LVEF、LVFS隨之顯著降低；AMI+miRNA-210 agonist組LVEF、LVFS升高最為顯著，見表1。

3 討 論

AMI患者由于心肌細(xì)胞缺血、缺氧，心臟收縮力減弱，其預(yù)后不佳。有研究表明[3]，miRNA相關(guān)家系過表達(dá)對(duì)心肌細(xì)胞有多種作用。另外，多種miRNAs已被為診斷AMI的潛在標(biāo)志物[4]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)心肌內(nèi)miRNA-210過表達(dá)可刺激HGF過表達(dá)，促進(jìn)血管EC分化、增殖，從而改善心臟收縮功能。

HGF可調(diào)節(jié)EC的遷移、增殖，可能與增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)某些涉及細(xì)胞骨架重塑、細(xì)胞遷移等的信號(hào)分子相關(guān)[5]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miRNA-210誘導(dǎo)心肌梗死后血管新生是通過上調(diào)HGF表達(dá)實(shí)現(xiàn)，而非作用于VEGF靶基因。事實(shí)上，維持EC及血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）增殖、遷移之間的平衡是血管新生的重要條件。堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子可激活NFκB信號(hào)通路促進(jìn)諸多炎癥因子產(chǎn)生，從而誘導(dǎo)增加VSMCs數(shù)量。AMI常合并炎癥反應(yīng)，可打破EC、VSMC之間的平衡，而HGF可抑制有關(guān)炎性因子的釋放，因此miRNA-210過表達(dá)后上調(diào)HGF表達(dá)，可促進(jìn)EC增殖、遷移，增加梗死區(qū)域內(nèi)微血管新生。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)miRNA-210過表達(dá)可通過改善LVEF、LVFS水平，抑制β-MHC增長(zhǎng)，從而增強(qiáng)心肌收縮力，改善心功能。繼發(fā)于AMI的心室重構(gòu)早期可引起短期的心臟收縮能力代償性增加，且梗死區(qū)域內(nèi)的β-MHC蛋白表達(dá)量也顯著增加，提示miRNA-210過表達(dá)對(duì)于改善梗死后心室重構(gòu)也具有積極作用。

MiRNA-210過表達(dá)后可上調(diào)HGF表達(dá)，從而促進(jìn)EC增殖、遷移，增加梗死區(qū)域內(nèi)新生血管形成，減少心肌細(xì)胞壞死，改善心臟收縮功能。

參考文獻(xiàn)

[1] 閻 雪.循證護(hù)理在急性心肌梗死并發(fā)心律失?；颊咧械膽?yīng)用[J].中國(guó)循證心血管醫(yī)學(xué)雜志，2016，8（8）：995-996.

[2] 黃振華，葉 子，蔣 鵬，等.miRNAs在急性心肌梗死診斷中的研究進(jìn)展[J].嶺南心血管病雜志， 2017，23（3）：347-350.

[3] 馬詩(shī)語(yǔ)，王賢冬，王逸飛，等.miRNAs在心臟損傷和修復(fù)中的作用[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2017，33（18）：2796-2799.

[4] 馬麗娟，高雅卿，劉 巍.循環(huán)miRNAs與心血管疾病的診斷[J].醫(yī)學(xué)研究雜志，2017，46（9）：188-191.

[5] 吳文皋，鄧禮明，李林鵬，等.肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子在缺血性疾病的研究及進(jìn)展[J].臨床與病理雜志，2016，36（8）：1234-1238.

本文編輯：趙小龍