人類病毒組及研究進(jìn)展

，

病毒是一種能夠自我復(fù)制、專性在細(xì)胞內(nèi)寄生的非細(xì)胞生物。病毒結(jié)構(gòu)雖然簡(jiǎn)單，僅結(jié)構(gòu)蛋白外殼包裹著一種遺傳物質(zhì)(DNA或RNA)，卻能夠感染各種動(dòng)物、植物、藻類、真菌和細(xì)菌等多種生物群體。在人類發(fā)現(xiàn)病毒以來(lái)的100多年里，科學(xué)家們對(duì)于病毒的探索從未停息。特別是在病毒和人類健康關(guān)系方面，不僅陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了一大批與人類疾病密切相關(guān)的致病性病毒，研制出各種病毒疫苗和抗病毒制劑，還利用部分病毒獨(dú)有的生物學(xué)特性構(gòu)建了各種病毒載體，作為一些遺傳疾病和腫瘤基因治療的工具。

近年來(lái)，宏基因組學(xué)(metagenomics)的興起，科學(xué)家開始關(guān)注不同生態(tài)環(huán)境下所有微生物(細(xì)菌、病毒、真菌等)種群的遺傳構(gòu)成及生物學(xué)功能，美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究所(National Institutes of Health, NIH)也于2007年啟動(dòng)了人體微生物組計(jì)劃(Human Microbiome Project，HMP)[1]。作為微生物組的一部分，病毒組(virome)由特定生態(tài)環(huán)境下病毒樣顆粒所包含的核酸物質(zhì)(單鏈DNA、雙鏈DNA、單鏈RNA、雙鏈RNA) 構(gòu)成。因此人類病毒組(human virome)泛指人體內(nèi)部及人體表面各種器官/微生態(tài)環(huán)境(如皮膚、血液、鼻腔、口腔、肺、胃腸道、糞便等)所有能夠發(fā)現(xiàn)的病毒相關(guān)序列。其中少部分成員可以引起人類疾病，絕大多數(shù)成員并不一定與明顯的臨床癥狀有關(guān)聯(lián)[2-4]。那么，人類病毒組究竟有哪些成員？各種病毒在人體不同器官中如何分布及發(fā)揮作用？本文擬總結(jié)目前人類病毒組研究領(lǐng)域的進(jìn)展，以便深入認(rèn)識(shí)人類病毒組的構(gòu)成、功能以及與人類健康的關(guān)系。

1 不同標(biāo)本來(lái)源的人類病毒組

人體內(nèi)部及表面棲居著各種生物特性不同的病毒群體，包括真核病毒和大量的噬菌體，它們通過(guò)感染人體細(xì)胞及調(diào)節(jié)人類微生物組，對(duì)平衡宿主的健康和疾病狀態(tài)至關(guān)重要[2]。影響人類病毒組的因素很多，例如每個(gè)人的生活方式、年齡、地理位置、季節(jié)等差異，均可導(dǎo)致個(gè)體接觸各種病毒的機(jī)會(huì)不同，因此每個(gè)人都有自己特有的病毒組。而每個(gè)人對(duì)病毒的易感性與個(gè)體免疫力、病毒與人類遺傳特征等也存在聯(lián)系。同時(shí)，人類病毒組隨著病毒進(jìn)化也可能不斷發(fā)生改變[2-3]。根據(jù)病毒來(lái)源，人類病毒組既包括引起暫時(shí)急性感染的各種動(dòng)物病毒，作為細(xì)菌、古細(xì)菌天敵的噬菌體，各種內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(human endogenous retroviruses, HERVs)，還包括一些人體持續(xù)感染和潛伏感染相關(guān)的病毒[2-4]。其中HERVs估計(jì)占人類基因組約8%，但大多數(shù)基因被截?cái)嗪?或產(chǎn)生突變，不能編碼功能性蛋白，僅少數(shù)可以產(chǎn)生相關(guān)蛋白或完整的病毒顆粒[2]。

健康人體的各種組織系統(tǒng)存在不同生態(tài)環(huán)境，其病毒組成分也有差異。根據(jù)HMP項(xiàng)目中真核雙鏈DNA病毒調(diào)查數(shù)據(jù)[5]，就發(fā)現(xiàn)102名研究對(duì)象706份樣品(來(lái)自人體鼻、皮膚、口腔、陰道、糞便等5種生態(tài)環(huán)境)中，平均每人檢出5.5個(gè)病毒屬，92%的個(gè)體樣品中能夠檢出至少一種病毒，包括皰疹病毒(herpes simplex virus，HSV)、乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)、多瘤病毒(human polyomaviruses，HPyV)、腺病毒、指環(huán)病毒(anellovirus)、細(xì)小病毒和圓環(huán)病毒(circovirus)等。同時(shí)，按樣品采集部位，無(wú)癥狀健康人群糞便樣品只有7類真核雙鏈DNA病毒，其它部位則存在10-13類，而且各類病毒在不同部位的構(gòu)成比也有差異。其中，環(huán)病毒屬(gyrovirus)為糞便樣品中獨(dú)有，依賴病毒屬(dependovirus)僅存在于鼻腔。雖然以上數(shù)據(jù)還缺少單鏈DNA病毒、RNA病毒、噬菌體及前病毒序列信息，但至少證明了不同生態(tài)環(huán)境病毒組的差異，也充分顯示個(gè)體之間病毒組的多樣性。

1.1口腔和唾液 人類口腔生態(tài)系統(tǒng)包含無(wú)數(shù)的真核細(xì)胞、細(xì)菌、古細(xì)菌和病毒?？谇皇俏改c道的門戶，也是病毒感染和傳播的主要場(chǎng)所。唾液不僅能夠控制細(xì)菌在口腔中的定植(colonization)，而且其中的多種生物活性分子具有抗病毒作用[6-7]。口腔病毒組研究通常采集唾液或咽拭子作為檢材，據(jù)估計(jì)每毫升咽拭子或唾液中有108個(gè)病毒樣顆粒(virus-like particle, VLP)，每毫升牙菌斑則含有107個(gè)病毒樣顆粒[6]。這些病毒樣顆粒以噬菌體為主，能夠分類的噬菌體包括有尾噬菌體目(Caudovirales)的肌尾噬菌體科(Myoviridae)、短尾噬菌體科(Podoviridae)、長(zhǎng)尾噬菌體科(Siphoviridae)等[6]。同時(shí)，口腔中的噬菌體群落在唾液、牙菌斑、牙齦下空腔和齦上生物膜之間還存在明顯差異。而口腔噬菌體群落是在何種程度上形成及調(diào)節(jié)口腔細(xì)菌群落的，以及它們之間的平衡是否對(duì)人類健康帶來(lái)直接或間接影響，目前尚不清楚。除了噬菌體之外，僅少數(shù)病毒序列與已知的真核病毒同源，包括細(xì)環(huán)病毒(torque teno virus，TTV)、圓環(huán)病毒、HSV和EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)[6]。在致病性真核病毒中，能夠從唾液或口腔拭子中分離培養(yǎng)的常見病毒有輪狀病毒、諾如病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus，CMV)、1型和2型皰疹病毒(HSV-1、HSV-2)、EBV、流感病毒等，能夠檢出病毒核酸物質(zhì)或特異性抗體的種類則更多[7]。

1.2皮膚 皮膚是病原體和人體之間的物理屏障，也是多種微生物在人體的定居之處，一個(gè)70 kg成年人的皮膚表面積約1.7 m2。不同部位的皮膚由于溫度、濕度、暴露程度等不同，定居的微生物群落存在差異[2,8-9]。皮膚的病毒組研究通常采集不同部位的皮膚拭子作為檢材。定居在皮膚上的細(xì)菌一般為葡萄球菌屬、丙酸桿菌屬、棒狀桿菌屬，因此，皮膚的病毒組中，部分噬菌體成分與上述細(xì)菌存在一定聯(lián)系[2-3,9]。皮膚病毒組中能夠劃分為病毒的序列多數(shù)為有尾噬菌體目，少部分為肌尾噬菌體科和長(zhǎng)尾噬菌體科[9]。皮膚上的真核病毒可能為乳頭瘤病毒科、多瘤病毒科、圓環(huán)病毒科、腺病毒科、指環(huán)病毒科、皰疹病毒科和痘病毒科成員，以乳頭瘤病毒科最多。多數(shù)個(gè)體的皮膚表層有多種乙型和丙型HPV(beta-, and gammapapillomaviruses, β- and γ-HPVs)，高通量測(cè)序數(shù)據(jù)顯示健康個(gè)體皮膚樣品中HPV類型可以高達(dá)17種。有的病毒如指環(huán)病毒、部分HPV型別可能為皮膚正常生態(tài)群落的一部分，而一些HPV型別、HPyV、HSV等則可能導(dǎo)致皮膚癌和其它皮膚疾病[2]。

1.3呼吸道 呼吸道負(fù)責(zé)人體與外界氧氣和二氧化碳的交換，分為上呼吸道和下呼吸道，成人呼吸道總表面積約70 m2，是皮膚表面積的40倍[10]。人類呼吸道是空氣中細(xì)菌、病毒、真菌等微生物進(jìn)入人體的主要途徑，據(jù)報(bào)道，健康無(wú)癥狀兒童中呼吸道病毒的檢出率超過(guò)65%[10]。曾經(jīng)一度認(rèn)為健康人的肺是一個(gè)無(wú)菌器官，但近年來(lái)多種不依賴培養(yǎng)的檢測(cè)技術(shù)表明，肺里同樣存在大量的微生物。研究呼吸道微生物組通常采集上呼吸道樣品(鼻咽拭子、鼻咽抽吸物)和下呼吸道樣品(支氣管灌洗液)。有研究顯示，人類上呼吸道存在包括指環(huán)病毒科在內(nèi)的多種病毒，下呼吸道病毒組除了大量噬菌體外，也有較多指環(huán)病毒科成員[10-11]。

健康個(gè)體鼻吸取物的病毒組分析顯示，呼吸道存在多種真核病毒，包括巨細(xì)胞病毒、淋巴濾泡病毒(lymphocryptovirus)、玫瑰皰疹病毒(roseolovirus)、哺乳動(dòng)物腺病毒(mastadenovirus)、依賴病毒屬、HSV、HPyV以及甲、乙、丙型HPV及未分型HPV、甲型細(xì)環(huán)病毒(alphatorquevirus)和未分型指環(huán)病毒[2,10]。在發(fā)病人群中，瑞典學(xué)者對(duì)210名嚴(yán)重下呼吸道感染患者的鼻咽沖洗液進(jìn)行宏基因組檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)39種病毒感染，主要為副黏病毒科、小RNA病毒科、正黏病毒科(流感病毒)成員，占樣品病毒共有序列(viral contigs)的90%，其余依次為冠狀病毒科、細(xì)小病毒科、指環(huán)病毒科、圓環(huán)病毒科、多瘤病毒科以及其它[12]。我國(guó)學(xué)者對(duì)135名嚴(yán)重急性呼吸道感染(severe acute respiratory infection，SARI)兒童病例樣品的病毒宏基因組研究，得出類似結(jié)論。包括副黏病毒科、冠狀病毒科、細(xì)小病毒科、正黏病毒科、小RNA病毒科、指環(huán)病毒科和腺病毒科成員，而作為對(duì)照的15名非SARI兒童患者呼吸道樣品中病毒成分相對(duì)單純一些，除了少部分常見呼吸道病毒外，主要為指環(huán)病毒[13]。

1.4血液 一般認(rèn)為，健康人血液是無(wú)菌的。一些受到廣泛關(guān)注的已知血源傳播病毒如乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)、人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)、人T淋巴細(xì)胞病毒(human T-lymphotropic virus, HTLV)等，在多數(shù)國(guó)家都已經(jīng)列入獻(xiàn)血員篩查目錄，是保障臨床血液安全的重要措施[2,14]。曾經(jīng)認(rèn)為與病毒性肝炎有關(guān)聯(lián)的TTV和黃病毒科成員Human pegivirus (HPgV)，在健康人群血液中檢出率較高，現(xiàn)在普遍認(rèn)為它們僅在血液中循環(huán)不引起任何癥狀。另外部分病毒(如CMV、細(xì)小病毒B19、戊型肝炎病毒)，雖然引起病毒血癥，但只對(duì)特定人群帶來(lái)潛在影響，因此沒(méi)有列入常規(guī)篩查名錄[14]。

早期的宏基因組研究發(fā)現(xiàn)，血液中存在相當(dāng)數(shù)量的病毒群體，據(jù)估計(jì)人類血漿中各種病毒構(gòu)成比分別為指環(huán)病毒(68%)、皰疹病毒(13%)、多瘤病毒(5%)、有尾噬菌體目(5%)、腺病毒(2%)、痘病毒(1%)、逆轉(zhuǎn)錄病毒(1%)和其它未分型的病毒(5%)[15]。上述結(jié)論也得到近年來(lái)一些采用大樣本的病毒組學(xué)調(diào)查結(jié)果支持。瑞士學(xué)者對(duì)300個(gè)紅細(xì)胞單位和300個(gè)新鮮血漿(fresh-frozen plasma，F(xiàn)FP)單位的宏基因組分析[16]，在健康個(gè)體血液中經(jīng)常檢出指環(huán)病毒和HPgV，還能檢測(cè)到一般在皮膚才有的HPV27、Merkel細(xì)胞多瘤病毒，甚至在一個(gè)FFP單位中意外檢出了星狀病毒MLB2。研究人員對(duì)美國(guó)和歐洲10批次的血漿(每批體積達(dá)567 L-2 608L)的病毒宏基因組研究，發(fā)現(xiàn)10個(gè)批次均有指環(huán)病毒，8個(gè)批次存在A型HPgV，3個(gè)批次發(fā)現(xiàn)少量HPV[17]。而Moustafa等[18]對(duì)8 240名沒(méi)有任何傳染病人群的血液樣品，進(jìn)行全基因組測(cè)序。從測(cè)序數(shù)據(jù)中提取DNA病毒相關(guān)序列，共發(fā)現(xiàn)94種病毒，包括19種人DNA病毒、前病毒和RNA病毒，如HSV、指環(huán)病毒、HPV、HPyV、腺病毒、HIV、HTLV、HBV、HCV、細(xì)小病毒B19以及流感病毒，來(lái)自42%的測(cè)試人群。另外75種病毒則主要為商業(yè)試劑污染和外環(huán)境。

1.5神經(jīng)系統(tǒng) 雖然中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system, CNS)受到血腦屏障的保護(hù)，但仍然有很多病原體能夠突破血腦屏障，引起明顯的CNS感染相關(guān)疾病及死亡。多種病毒可以通過(guò)不同途徑侵入神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致腦膜炎、腦炎或腦膜腦炎[19]。盡管目前對(duì)大多數(shù)病毒相關(guān)CNS感染缺乏特異抗病毒藥物，但是及時(shí)確定引起CNS感染的病毒類型有助于采取相應(yīng)的應(yīng)急措施，有效避免疫情擴(kuò)大[20]。已知能夠感染CNS的病毒有HIV-1、彈狀病毒、黃病毒、HSV、流感病毒、副流感病毒、呼腸孤病毒、淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒、蟲媒病毒、CMV、腮腺炎病毒、細(xì)小病毒B19、麻疹病毒、HTLV、腸道病毒、亨尼帕病毒、布尼亞病毒、披膜病毒等[21]。神經(jīng)系統(tǒng)的病毒組研究可采集腦脊液作為檢材，但目前缺少采用腦脊液進(jìn)行病毒組研究的大型隊(duì)列調(diào)查數(shù)據(jù)。根據(jù)最近關(guān)于高通量測(cè)序用于腦炎個(gè)案診斷的綜述[20]，匯總了2008年1月-2017年4月共25篇文獻(xiàn)報(bào)告的44例病例資料，涉及到常見病毒有HSV、 柯薩奇病毒A9、麻疹病毒、水泡帶狀皰疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)、腮腺炎病毒、EBV和JC多瘤病毒，罕見病毒有人細(xì)小病毒4型(parvovirus 4, PARV4)、人冠狀病毒OC-43、人星狀病毒MLB1，新發(fā)現(xiàn)病毒則有沙粒病毒、博爾納病毒(bornavirus)、星狀病毒VA1/HMO-C、cyclovirus、gemycircuarlvirus、濃核癥病毒(densovirus)。

1.6胃腸道 健康成年人的胃腸道表面積超過(guò)200 m2，為各種微生物生長(zhǎng)和繁殖提供了理想的場(chǎng)所。人體胃腸道的微生物群落與人體生理和健康息息相關(guān)，有關(guān)人類胃腸道病毒組的研究較多。胃腸道病毒組研究通常采集糞便樣品作為檢材，正常糞便包含病毒樣顆粒約108～109/g，其來(lái)源按照宿主類型可分為：人類病毒、膳食來(lái)源植物病毒、膳食來(lái)源動(dòng)物病毒、噬菌體、感染原生動(dòng)物的病毒[2,22-24]。糞便中絕大多數(shù)病毒樣顆粒為噬菌體，主要包括有尾噬菌體目的肌尾病毒科、短尾噬菌體科、長(zhǎng)尾噬菌體，少部分屬于微小噬菌體科[2-3,24]。能夠劃分為真核病毒的序列相對(duì)較少，其中真核DNA病毒科包括雙生病毒科(Geminiviridae)、皰疹病毒科、矮縮病毒科(Nanoviridae)、乳頭瘤病毒科、痘病毒科、細(xì)小病毒科、多瘤病毒科、腺病毒科、圓環(huán)病毒科(Circoviridae)等。而真核RNA病毒方面，雖然相關(guān)研究不多，且發(fā)現(xiàn)多數(shù)RNA病毒為食物來(lái)源的植物RNA病毒，但至少檢出過(guò)包括杯狀病毒科、小雙RNA病毒科(Picobirnaviridae)、小RNA病毒科(腸道病毒)、呼腸孤病毒科(輪狀病毒)等在內(nèi)的RNA病毒[2, 25]。另外，身體其它部位的病毒也可能出現(xiàn)在糞便中[25]，如呼吸道的鼻病毒、博卡病毒、冠狀病毒可能通過(guò)吞咽進(jìn)入糞便，感染血細(xì)胞的病毒如HIV也能在糞便樣品中檢測(cè)到。因此，在糞便中檢出一種新病毒，并不代表此病毒就是在人類小腸細(xì)胞中復(fù)制的。

1.7泌尿生殖系統(tǒng) 人類尿道出現(xiàn)微生物通常與尿道感染有關(guān)，即使沒(méi)有尿道感染，尿液中也具有自身獨(dú)特的微生物群。泌尿生殖道感染分為尿道感染(膀胱炎、腎盂腎炎、前列腺炎)和生殖道感染(尿道炎、宮頸炎、附睪炎、子宮內(nèi)膜炎、生殖器潰瘍、盆腔炎)[26]。對(duì)泌尿生殖系統(tǒng)的病毒組研究通常采集尿液、陰道拭子等作為檢材。尿液和陰道拭子中經(jīng)常檢出各種HPVs，可能屬于共生微生物群落的一部分。同時(shí)，健康男性和女性尿道還可能有皰疹病毒(HSV、CMV)和多瘤病毒(BK多瘤病毒)，以及一些噬菌體[2, 27]。美國(guó)加州大學(xué)圣地亞哥分校研究人員采集了10名尿道感染(大腸埃希菌、糞腸球菌、鮑曼不動(dòng)桿菌)和10名無(wú)尿道感染者的尿液樣品，發(fā)現(xiàn)每毫升樣品大約含107病毒樣顆粒，略低于唾液和糞便中數(shù)目。無(wú)論是否存在尿道感染，都能夠檢出真核病毒如乳頭瘤病毒、皰疹病毒和多瘤病毒。95%樣品包含HPV序列，包括多種不常見型別HPV96、HPV49、HPV121、HPV92、HPV178等。通過(guò)與非冗余數(shù)據(jù)庫(kù)(non-redundant database, NR)比對(duì)，約27%的共有序列(contig)與已知病毒序列同源，其中絕大部分屬于噬菌體序列，包括大腸埃希菌、葡萄球菌、糞腸球菌等的特異噬菌體[27]。

1.8腫瘤組織 自從20世紀(jì)60年代發(fā)現(xiàn)部分腫瘤與病毒感染相關(guān)，迄今已經(jīng)確認(rèn)7種腫瘤病毒，分別是DNA病毒如EBV、HBV、HPV、人皰疹病毒8型(human herpesvirus 8，HHV-8)和Merkel細(xì)胞多瘤病毒(Merkel cell polyomavirus，MCPyV)，RNA病毒HCV、HTLV-1。大約12%的人類腫瘤由病毒所致，世界上大部分人群存在至少一種腫瘤病毒，但只有少數(shù)個(gè)體發(fā)展成為腫瘤[28]。

美國(guó)國(guó)家癌癥研究所(National Cancer Institute，NCI)和國(guó)家人類基因組研究所(National Human Genome Research Institute，NHGRI)于2006年啟動(dòng)了癌癥基因組圖譜 (The Cancer Genome Atlas，TCGA)項(xiàng)目，目的是提高癌癥的診斷、治療和預(yù)防。通過(guò)收集數(shù)千名癌癥患者組織樣品并進(jìn)行深度測(cè)序，從序列數(shù)據(jù)庫(kù)中也可以調(diào)查腫瘤組織中存在病毒。經(jīng)過(guò)10多年的工作，不僅在所有宮頸癌及部分頭頸部鱗狀細(xì)胞癌樣品中檢測(cè)到HPV序列，證明了HBV、HCV序列與部分肝癌有關(guān)，以及部分胃癌中有EBV基因表達(dá)，而且發(fā)現(xiàn)一些以前未認(rèn)識(shí)到的癌癥與病毒的相關(guān)性。最近，有學(xué)者首次結(jié)合DNA(全基因組、全外顯子組)和RNA序列數(shù)據(jù)，調(diào)查了來(lái)自3 052名患者22類不同癌癥樣品中存在的病毒序列[29]。經(jīng)過(guò)人工排除噬菌體、植物病毒、昆蟲病毒和真菌病毒之后，確定5個(gè)科(乳頭瘤病毒科、多瘤病毒科、嗜肝DNA病毒科、黃病毒科、皰疹病毒科)34種病毒存在于TCGA癌癥樣品中。除了少數(shù)樣品包含低危型的HPV30、HPV73、HPV111之外，所有宮頸癌樣品存在高危型HPV，其中HPV16、HPV18占89.4%。約20%頭頸部腫瘤樣品存在HPV，以HPV16居多。肝癌患者樣品中HBV、HCV序列檢出率分別為30%和5.6%，部分膀胱癌患者檢出HPV，在20種癌癥組織中發(fā)現(xiàn)了皰疹病毒序列，其中EBV、CMV、人皰疹病毒6型(human herpesvirus 6，HHV6)出現(xiàn)在17種癌癥中。

2 病毒組研究方法及挑戰(zhàn)

在過(guò)去100多年里，傳統(tǒng)的病毒鑒定方法包括病毒分離培養(yǎng)、電子顯微鏡觀察、血清學(xué)實(shí)驗(yàn)和核酸檢測(cè)等，逐漸豐富了人類對(duì)于病毒學(xué)的認(rèn)識(shí)。由于大多數(shù)病毒組成員的遺傳背景不明，也沒(méi)有合適的培養(yǎng)分離方法，因此目前主要采用病毒宏基因組的方法獲得病毒DNA或RNA基因組序列。宏基因組學(xué)不依賴于傳統(tǒng)的病毒培養(yǎng)，而是用分子手段分析環(huán)境樣品中所有微生物基因組，是探索復(fù)雜微生物環(huán)境生態(tài)學(xué)的可靠工具。但病毒基因組相對(duì)較小，也沒(méi)有類似細(xì)菌16S rRNA基因的通用遺傳元件，病毒宏基因組研究一直受到來(lái)自樣品處理、測(cè)序策略、生物信息學(xué)注釋等方面的挑戰(zhàn)[30-33]。

雖然直接提取來(lái)自外環(huán)境、臨床、培養(yǎng)物等樣品的總DNA或RNA進(jìn)行宏基因組深度測(cè)序就能夠檢測(cè)到樣品中各種核酸序列，其中病毒相關(guān)序列所占比例甚微，因而敏感性較低、實(shí)用性不高。為了消除來(lái)自宿主、外環(huán)境細(xì)胞碎片和游離核酸物質(zhì)的干擾，通常需要采用過(guò)濾(0.45 μm和/或0.22 μm)、離心(低速離心、超速離心、密度梯度離心)、聚乙二醇沉淀、DNA酶和RNA酶處理等手段對(duì)病毒顆粒進(jìn)行富集[23,33]。其次，通過(guò)去除宿主rRNA，或采用基于探針的核酸雜交方法，如病毒組捕獲測(cè)序(virome capture sequencing，VirCapSeq)、脊椎動(dòng)物病毒組捕獲測(cè)序平臺(tái)(virome capture sequencing platform for vertebrate viruses，VirCapSeq-VERT)系統(tǒng)，也可以對(duì)特異病毒核酸進(jìn)行富集，提高樣品中病毒相關(guān)序列的比例[30]。同時(shí)，為了涵蓋低豐度病毒序列，還需要對(duì)樣品中病毒序列片段進(jìn)行非特異、無(wú)偏差擴(kuò)增。常用方法包括不依賴序列的單引物擴(kuò)增(sequence independent single primer amplification, SISPA)、多重置換擴(kuò)增( multiple displacement amplification,MDA)和病毒cDNA擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多樣性(virus discovery based on cDNA-amplified fragment length polymorphism,VIDISCA)，不僅能夠擴(kuò)增已知病毒序列，還能擴(kuò)增未知病毒序列[31-32]。

早期的宏基因組研究采用的是克隆不同靶片段進(jìn)行毛細(xì)管電泳測(cè)序，其測(cè)序通量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，如今基本上已經(jīng)被淘汰。近10年來(lái)，各種高通量測(cè)序平臺(tái)不斷推陳出新，尤其在測(cè)序讀長(zhǎng)和通量上取得了飛速發(fā)展。測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建是宏基因組研究的基礎(chǔ)和關(guān)鍵，主要過(guò)程即是將目標(biāo)DNA或RNA制備為測(cè)序儀能夠相容的形式，基本過(guò)程包括靶序列片段化、雙鏈DNA轉(zhuǎn)換、連接寡核苷酸接頭以及文庫(kù)定量等步驟[23,33]。無(wú)論采用鳥槍法還是核酸擴(kuò)增準(zhǔn)備測(cè)序模板，都必須盡可能讓測(cè)序文庫(kù)忠實(shí)地代表樣品的復(fù)雜性，同時(shí)減少實(shí)驗(yàn)過(guò)程中帶來(lái)的各種偏差。

在獲得原始測(cè)序數(shù)據(jù)以后，另外一個(gè)重要環(huán)節(jié)就是選擇和應(yīng)用適當(dāng)?shù)纳镄畔W(xué)工具對(duì)宏基因組序列進(jìn)行注釋分析。利用現(xiàn)有各種商業(yè)或源代碼開放的生物信息學(xué)軟件，根據(jù)不同的算法原理，去除接頭序列、低質(zhì)量片段和宿主相關(guān)序列，通過(guò)將原始序列數(shù)據(jù)或拼接后的共有序列與公共數(shù)據(jù)庫(kù)的已知序列比對(duì)，然后將序列信息按不同種屬來(lái)源進(jìn)行生物學(xué)分類。但是，目前已知的病毒相關(guān)參比序列十分有限，導(dǎo)致許多病毒宏基因組序列數(shù)據(jù)中相當(dāng)一部分只能根據(jù)部分蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)信息劃分到未知病毒[2, 23]。

3 病毒組的功能

隨著測(cè)序技術(shù)發(fā)展，通過(guò)深度測(cè)序的方法研究人類病毒組，能夠快速確定人體特定生態(tài)環(huán)境中病毒組的豐度、穩(wěn)定性、基因功能以及與人類健康的聯(lián)系，無(wú)疑有助于新發(fā)病毒疾病診斷治療，減少抗生素使用，促進(jìn)抗病毒藥物研發(fā)。對(duì)于人類病毒組的功能，首先應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，人類病毒組是身體的一部分，并不總是對(duì)人體健康有害。多數(shù)病毒是良性的，僅少數(shù)病毒能夠致病。許多病毒一直存在于人體也不引起任何癥狀。只有病毒感染人體細(xì)胞，出現(xiàn)癥狀才算是對(duì)人體有害。同時(shí)，病毒對(duì)人類健康的影響是由個(gè)體免疫系統(tǒng)狀態(tài)決定的[2,34]。其次，細(xì)菌噬菌體是人類病毒組比例最大也是了解甚少的部分。這些噬菌體種類及分布與定植在人體局部生態(tài)環(huán)境中的細(xì)菌密切相關(guān)，是細(xì)菌中各種可移動(dòng)遺傳元件的主要來(lái)源，在細(xì)菌通過(guò)水平基因轉(zhuǎn)移交換遺傳物質(zhì)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。有證據(jù)表明，噬菌體組可能作為人體健康或疾病的生物標(biāo)志[2,32]。第三，致病性細(xì)菌與病毒在致病過(guò)程中是互相協(xié)同作用的。以呼吸道為例，呼吸道病毒突破人體氣管-表皮屏障，調(diào)節(jié)宿主先天及后天免疫反應(yīng)，有利于病原菌粘附，更容易引起細(xì)菌性疾病；而細(xì)菌反過(guò)來(lái)也通過(guò)上調(diào)黏附受體的表達(dá)，增加了人類鼻病毒(human rhinovirus, HRV)和呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)對(duì)上皮細(xì)胞的結(jié)合，并放大炎癥反應(yīng)[2,10]。第四，關(guān)于檢出率較高的真核病毒TTV和HPgV，曾經(jīng)認(rèn)為與輸血后肝炎和血源傳播疾病有關(guān)，目前已經(jīng)排除了它們與疾病的聯(lián)系，其功能及生物學(xué)意義尚不明確。

4 總結(jié)與展望

病毒伴隨著人類的一生，人類通過(guò)空氣、食物、其它人類、植物、動(dòng)物、微生物等暴露于病毒環(huán)境，直接或間接地影響人類健康和疾病的平衡。近年來(lái)全球科研人員的努力初步揭示了人類病毒組的部分構(gòu)成及功能，為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)病毒組與人類健康提供了便利。但是，目前有關(guān)人體病毒組的資料并不完整，不僅缺少標(biāo)準(zhǔn)化的病毒分離和測(cè)序方法，病毒基因組參考序列數(shù)目也非常有限。多數(shù)病毒組研究還局限于DNA病毒，而關(guān)于人體RNA病毒組的數(shù)據(jù)不夠。在富集病毒顆粒過(guò)程中，采用0.22 μm和/或0.45 μm的濾膜過(guò)濾可能失去一些顆粒稍大的病毒種類，也忽略了整合在宿主或細(xì)菌的前病毒或前噬菌體序列信息；隨機(jī)引物擴(kuò)增過(guò)程中，也可能因?yàn)槭褂玫腄NA多聚酶偏好而帶來(lái)系統(tǒng)性偏差。同時(shí)，所有病毒組研究?jī)H僅是提供了病毒多樣性及組成，還無(wú)法真實(shí)反映不同病毒的載量。對(duì)我國(guó)的生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域而言，目前的人類病毒組研究還處于起步階段。一方面需要在高通量測(cè)序硬件及相關(guān)試劑上發(fā)展自主的平臺(tái)體系，開發(fā)標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)和分析流程，促進(jìn)高通量測(cè)序在臨床上的開展；另一方面則是需要整合不同學(xué)科的樣本資源，通過(guò)大批量隊(duì)列樣本的病毒組相關(guān)序列數(shù)據(jù)，盡可能完整地展示我國(guó)人群中人類病毒組的構(gòu)成?？傊S著高通量測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步，測(cè)序成本的大幅降低，更大規(guī)模、更全面的人類病毒組研究數(shù)據(jù)將有助于深入了解病毒的多樣性、生態(tài)學(xué)、進(jìn)化和病毒分類，最終必將應(yīng)用于臨床診斷和治療，為促進(jìn)全人類健康帶來(lái)福利。