“苦參堿分離純化”的實驗教學設計

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1.昆明理工大學生命科學與技術學院，云南 昆明 650500；2.云南大學化學科學與工程學院，云南 昆明 650091

1 引言

《制藥分離工程》是制藥工程專業(yè)一門重要的專業(yè)基礎課，在制藥工程專業(yè)課程體系中占有非常重要的地位。主要介紹藥物的提取、分離與純化理論與技術。該課程著重培養(yǎng)學生的工程意識，通過學習，逐漸具備解決工程實際問題的能力[1]。在傳統(tǒng)的教學中存在著以下問題：①《制藥分離工程》開課前學生很少接觸工程實際問題，工程意識不強，實踐基礎薄弱，學生聽不懂。②《制藥分離工程》涉及一些分離操作原理，多采用模型和掛圖等輔助教具進行講解，教學手段單一，效果不好。③《制藥分離工程》是一門實踐性很強的課程，傳統(tǒng)的考試模式是以閉卷筆試為主，主要考查的是學生記憶基本原理和技術的能力，不能提高學生運用基本原理和技術解決實際問題的能力。在當前高等教育著力于培養(yǎng)有創(chuàng)新能力的高素質(zhì)人才的大背景下，教學時間的有限性與知識增長的無限性之間的矛盾日益突出，為了能使學生掌握本課程的基本內(nèi)容，運用課程中的基本原理和技術解決實際問題的能力，在教學安排上增加《制藥分離工程》教學實踐環(huán)節(jié)。從云南制藥工程專業(yè)的本科教學來看，從云南豐富的藥用植物資源中分離天然藥效成分，并為之設計有效的分離路線，進而付諸實踐教學，不僅可以調(diào)動學生學習積極性，讓學生從理論到實踐得以跨越，真正做到“知行合一”，同時也為后續(xù)的制藥工程生產(chǎn)實習和畢業(yè)實習奠定實踐基礎。

2 實驗設計對象的選擇

在《制藥分離工程》教學實驗設計時，以云南特色藥用植物資源為出發(fā)點，選擇有特色、有藥效、有資源和有開發(fā)價值的藥用植物開展《制藥分離工程》教學實踐。白刺花為豆科槐屬植物白刺花(Sophora viciifolia)的花蕾，別名苦刺花，廣泛分布于云南海拔2000～3500米的山坡上，白刺花在云南民間可食用[2]，具有抗炎、抗過敏、抗腫瘤等藥理作用[3]，其中含有生物堿類化學物質(zhì)，苦參堿是其中的藥效成分[4]，苦參堿具有治療抑制大腸癌細胞增殖、促大腸癌細胞凋亡、抗肝炎等功效[5]，目前已有苦參堿注射液上市銷售[6]。云南具有廣泛的白刺花植物資源，其中的苦參堿具有顯著藥效，選擇白刺花，并設計其中苦參堿的分離純化實驗教學，對于《制藥分離工程》教學具有較強的教學實踐意義。

3 實驗方案的設計

通過文獻調(diào)研和實驗條件的摸索，比對了幾條實驗路線，結合《制藥分離工程》教材內(nèi)容和云南植物藥業(yè)有限公司的實際生產(chǎn)工藝，最終確定以下實驗方案。

3.1 白刺花中總生物堿的提取 白刺花花蕾2.0 kg，陰干粉碎后用5 L 的丙酮室溫提取3次，每次48 h，提取液合并，減壓過濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，最后得到197.2 g浸膏，用水將所得浸膏分散，正丁醇萃取后得到，正丁醇部分提取物160.0 g和水部分37.2 g。水部分用氨水調(diào)pH為10，氯仿萃取3次，得萃取物4.2 g。

3.2 白刺花中苦參堿的分離 將氯仿萃取物進行硅膠柱層析，流動相條件為：石油醚/丙酮/二乙胺(體積比為30∶1∶0.2)，梯度洗脫，逐漸增加丙酮的體積，直到流動相的體積比為10∶10∶0.2，同時采用薄層層析法將相同洗脫成分合并，最終得到了4個部分(Fr.W1-Fr.W4)。對Fr.W3進行硅膠柱層析，流動相為氯仿/甲醇(98∶2)，得到化合物1(836 mg)和化合物2(50 mg)。以苦參堿為標準品，采用薄層層析法將化合物1、2與苦參堿標準品在薄層板上展開，展開劑為氯仿/甲醇/氨水(比例為90∶7∶3)，顯色劑為用碘化鉍鉀試劑噴霧，最終苦參堿樣點顯橙紅色，經(jīng)過比移值Rf比對，確定化合物1為苦參堿。

3.3 白刺花中苦參堿的純化 將分離得到的苦參堿置于5～8 mL的熱水(70～80 ℃)中溶解，加入15%的NaOH，邊滴加邊攪拌，直至苦參堿溶解完全，冷卻，靜置24 h，過濾，所得結晶體用8～10 mL石油醚于40～50 ℃下回流溶解，熱濾，母液冷卻后靜置24 h，過濾后用石油醚清洗晶體，40～50 ℃真空干燥，得到柱狀苦參堿晶體。

3.4 結構表征所得化合物 通過與對照品進行薄層層析的比對分析初步確定苦參堿，再通過核磁共振進行測定，測定所得數(shù)據(jù)如下：1H NMR (CDCl3, 500 MHZ) δppm:4.35 (1H, m, He-17), 3.74(1H, m, H-11), 3.00 (1H, m, Ha-17), 2.78 (1H, d, J=11.5 Hz, He-10), 2.70(1H, d, J =11.5 Hz, He-2), 2.31(1H, m, He-14), 2.14(1H, m, Ha-14), 1.96(2H, m, Ha-10,); 13C NMR (CDCl3, 125 MHz) δppm: 57.5(C-2), 21.0(C-3), 27.6(C-4), 35.3(C-5), 64.0(C-6), 41.9(C-7), 26.8(C-8), 21.9(C-9), 58.0(C-10), 53.5(C-11), 27.5(C-12), 19.1(C-13), 33.0(C-14), 170.1(C-15), 43.1(C-17)。

4 實驗教學中的注意事項

4.1 白刺花采收和苦參堿成分的預判 采收白刺花后，引導學生用少量樣品進行預實驗，通過與苦參堿對照品進行薄層層析比對分析，預先判斷是否含有苦參堿，并學習從薄層斑點的大小初步判斷苦參堿的含量。

4.2 提取工藝 得到苦參堿結晶體后，讓學生計算得率，從提高得率和環(huán)保角度出發(fā)，引導學生在提取溶劑種類、溶劑料液比、時間、溫度、原料預處理等方面進行思考，深入設計實驗，并反復比對實驗結果，總結得到最佳提取方法。結晶時以結晶量的多少和結晶含量高低為主要考慮因素，引導學生從結晶溶液濃度、NaOH用量、結晶溫度和加入晶種方法考慮結晶工藝的優(yōu)化，深入開展后續(xù)實驗，優(yōu)選最佳工藝。

5 小結

本實驗教學內(nèi)容涵蓋了《制藥分離工程》中固液提取、液液萃取、色譜分離和結晶等課程內(nèi)容，通過以上實驗，使學生加深了以上教學內(nèi)容的思考和理解，學生掌握了固液萃取、液液萃取、色譜分離和結晶的基本操作方法，深入掌握了以上分離技術的原理。同時，在實驗過程中還碰到了一些具體問題，如：提取率低、苦參堿純度不高、雜質(zhì)多等，通過對以上問題的分析和解決，使學生真正學會了從經(jīng)濟、有效和環(huán)保的角度出發(fā)，深入思考和解決藥物分離問題。綜上所述，苦參堿的分離純化實驗教學，能有效提高學生學習《制藥分離工程》的積極性，加深學生對本課程的思考和認識，有效提高教學質(zhì)量。

[1]李潔瓊, 齊濱, 于波,等. 制藥分離工程教學改革探索與實踐[J]. 教育教學論壇, 2017(11):83-84.

[2]吳榮書, 袁唯, 趙燕. 野生白刺花的加工技術研究[J]. 食品科學, 2000, 21(8):67-68.

[3]毛曉健, 溫敏, 蔣孝悝. 白刺花水煎劑的部分藥效學研究[J]. 云南中醫(yī)中藥雜志, 2009, 30(2):44-46.

[4]董劉宏, 太志剛, 楊亞濱,等. 白刺花花的化學成分研究[J]. 華西藥學雜志, 2010, 25(6):636-640.

[5]王菁雯, 沈克平. 中醫(yī)藥對大腸癌信號通路的調(diào)控作用[J]. 中國實驗方劑學雜志, 2018(1):227-234.

[6]白建剛, 朱偉平, 羅金武,等. 苦參堿注射液治療乙型肝炎療效觀察[J].中國醫(yī)藥導報, 2007, 4(17):19-20.