臭氧在中晚期原發(fā)性肝癌的應(yīng)用探索

張潔，付海艷，羅煜

昆明市第三人民醫(yī)院姑息治療科，云南昆明 650041

臭氧(Ozone)也稱三氧，是氧氣的同素異形體，由三個(gè)氧原子組成，是一種強(qiáng)氧化劑，常溫下半衰期約20 min，易分解，易溶于水。臭氧屬于有害氣體，濃度為0.3 mg/L時(shí)，對(duì)眼、鼻、喉有刺激的感覺(jué)，濃度3～30 mg/L時(shí)，出現(xiàn)頭疼及呼吸器官局部麻痹癥狀，濃度15～60 mg/L時(shí)，對(duì)人體有害。自1958年濃度劑量可調(diào)控的臭氧發(fā)生器誕生后，臭氧在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。在適當(dāng)劑量（0.3～0.5 ppm）下，臭氧對(duì)癌細(xì)胞起劑量依賴性的生長(zhǎng)抑制作用，且在適當(dāng)劑量范圍內(nèi)對(duì)人體正常細(xì)胞無(wú)明顯損害。臭氧可誘導(dǎo)腫瘤壞死，抑制腫瘤細(xì)胞增殖。在缺氧環(huán)境下，缺氧誘導(dǎo)因子1A（HIF1A）可調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)機(jī)體適應(yīng)性反應(yīng)。低氧環(huán)境下胞核HIF-1A表達(dá)明顯增高，臭氧治療可抑制HIF-1A水平，從而在慢性損傷等疾病中發(fā)揮治療作用。

1 肝癌的流行病學(xué)現(xiàn)狀

根據(jù)2012年全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)[1]，肝癌居全球癌癥死亡原因第三位，發(fā)病數(shù)居第五位，而在發(fā)展中國(guó)家，其發(fā)病數(shù)及死亡數(shù)均居男性癌癥患者第二位。僅2012年，全球有大約78萬(wàn)新增肝癌患者，約74萬(wàn)因肝癌致死，其中，新發(fā)及死亡病例中，中國(guó)均占了50%左右。根據(jù)云南省疾病控制中心的調(diào)查[2]，肝癌高居云南省惡性腫瘤死亡病例第二位。我國(guó)原發(fā)性肝癌患者多數(shù)有病毒性肝炎（多為乙型肝炎）背景，因此，其肝功能儲(chǔ)備較差，相當(dāng)部分患者無(wú)法進(jìn)行手術(shù)治療，且原發(fā)性肝癌70%～90%病理類型為肝細(xì)胞癌，對(duì)放化療均不敏感。因此，在中晚期原發(fā)性肝癌患者中，如何在肝功能保護(hù)的同時(shí)尋找合適的治療方法以緩解患者癥狀、提高生活質(zhì)量仍是值得臨床關(guān)注的問(wèn)題。

2 臭氧抗炎、抗病毒的研究

臭氧在病毒性肝炎、肝硬化及急性肝損傷的臨床及實(shí)驗(yàn)研究表明，臭氧對(duì)肝功能有一定的改善作用。Zaky等[3]應(yīng)用臭氧自體血回輸/微量自體血回輸/直腸注氣聯(lián)合治療慢性丙肝患者，研究共納入52名慢性丙肝患者，其中40名患者采用臭氧聯(lián)合療法，12名患者采用傳統(tǒng)治療（水飛薊素及復(fù)合維生素）。結(jié)果顯示ALT/AST正常率及HCV RNA轉(zhuǎn)陰率均顯著高于對(duì)照治療組。郭亞兵等[4]回顧了2005-2014年應(yīng)用臭氧治療肝炎的臨床研究，結(jié)果顯示從慢性乙（丙）型肝炎、肝硬化和肝衰竭不同肝病類型及階段，臭氧療法均顯示出抗病毒、抗炎護(hù)肝及改善癥狀的效果，且治療耐受性良好。Zaky的研究團(tuán)隊(duì)[5]納入15名肝硬化患者，給予臭氧（300 mL濃度為40%臭氧/純氧混合氣體，療程為12次）直腸注氣治療，治療前及末次治療后半小時(shí)分別在超聲指引下取門靜脈血，測(cè)量門靜脈氧分壓及飽和度，結(jié)果顯示臭氧直腸注氣治療可顯著提高門靜脈氧合水平。這一結(jié)果可能在一定程度上解釋了臭氧直腸注氣治療對(duì)肝功能改善的機(jī)制。

3 缺氧誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的增殖

氧穩(wěn)態(tài)是腫瘤進(jìn)化、發(fā)展的生理基礎(chǔ)[6]。缺氧在腫瘤發(fā)展及轉(zhuǎn)移中的作用日益得到重視。臭氧可以為腫瘤內(nèi)提供充足的氧分壓，在癌癥發(fā)生部位提供足夠的氧抑制腫瘤生成及惡性度增加，達(dá)到細(xì)胞水平上抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。在缺氧環(huán)境下，缺氧誘導(dǎo)因子1A（Hypoxia-inducible factor 1A,HIF1A）可調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)機(jī)體適應(yīng)性反應(yīng)。HIF1A已被證實(shí)是促紅細(xì)胞生成素（調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF，促血管生成）及糖酵解酶等多種基因的調(diào)節(jié)因子，從而調(diào)節(jié)腫瘤缺氧微環(huán)境的適應(yīng)性細(xì)胞代謝[7]。既往已有多個(gè)研究[8-9]顯示臭氧治療可抑制HIF-1A水平，從而在糖尿病腎病、軟組織損傷等疾病中發(fā)揮治療作用。來(lái)自西班牙的Clavo團(tuán)隊(duì)[10]納入18例晚期惡性腫瘤患者，應(yīng)用臭氧自體血回輸進(jìn)行治療，測(cè)定腫瘤氧合情況。結(jié)果顯示，臭氧治療后患者低氧指數(shù)（PO2≤10 mmHg或5 mmHg比例）明顯降低，且氧合增加與腫瘤初始PO2值呈明顯非線性負(fù)相關(guān)，提示缺氧越嚴(yán)重的腫瘤，臭氧治療獲益越明顯。Bowyer等人[11]在常氧及低氧環(huán)境下將HepG2細(xì)胞與阿霉素/雷帕霉素/二者聯(lián)合應(yīng)用分別培養(yǎng)，結(jié)果顯示低氧環(huán)境下HepG2細(xì)胞對(duì)藥物抵抗力明顯增強(qiáng)。Western-blot結(jié)果顯示低氧環(huán)境下胞核HIF-1A表達(dá)明顯增高，有效劑量的阿霉素/雷帕霉素均可顯著抑制胞核HIF-1A表達(dá)，提示低氧在肝癌發(fā)展及化療抵抗起重要作用，針對(duì)低氧及HIF-1A的治療可能是肝癌治療的重要方向。低氧環(huán)境可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。臭氧清除腫瘤放化療過(guò)程中形成的自由基，消滅殘留的腫瘤細(xì)胞，增加局部氧飽和度，增強(qiáng)腫瘤對(duì)放化療的敏感性。

4 臭氧對(duì)癌細(xì)胞的抑制

早在1980年，來(lái)自美國(guó)華盛頓大學(xué)的Sweet等人[12]在science雜志上發(fā)表的研究顯示將臭氧與人肺泡腺癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、子宮肉瘤細(xì)胞及子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞共培養(yǎng)，在適當(dāng)劑量（0.3-0.5ppm）下，臭氧對(duì)癌細(xì)胞起劑量依賴性的生長(zhǎng)抑制作用，且該劑量范圍內(nèi)，臭氧對(duì)對(duì)照細(xì)胞（二倍體成纖維細(xì)胞）無(wú)抑制作用。增加劑量至0.8 ppm，癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制超過(guò)90%，而對(duì)照組細(xì)胞抑制仍不到50%。表明臭氧對(duì)人類癌細(xì)胞可有劑量依賴生長(zhǎng)抑制作用，且在適當(dāng)劑量范圍內(nèi)對(duì)人體正常細(xì)胞無(wú)明顯損害。Schulz等人[13]的研究制作VX2頭頸部鱗狀細(xì)胞癌新西蘭兔動(dòng)物模型，分別予臭氧/純氧混合氣體，純氧及對(duì)照治療，結(jié)果顯示臭氧/純氧混合氣體腹腔注氣組14只實(shí)驗(yàn)兔存活7只，其中6只腫瘤完全消失且未見(jiàn)局部及遠(yuǎn)處肺轉(zhuǎn)移。純氧治療組13只實(shí)驗(yàn)兔存活3只，2只腫瘤完全消失。對(duì)照組14只實(shí)驗(yàn)兔僅1只存活。且研究發(fā)現(xiàn)臭氧/純氧混合氣體治療組中腫瘤消失的實(shí)驗(yàn)兔對(duì)VX2再植入可產(chǎn)生抗性。Kuroda的研究團(tuán)隊(duì)將臭氧水應(yīng)用于荷瘤小鼠局部，結(jié)果發(fā)現(xiàn)臭氧水局部應(yīng)用對(duì)正常臟器功能無(wú)影響；與對(duì)照組相比，臭氧水局部應(yīng)用組腫瘤壞死面積明顯增大，且具有劑量依賴性[14]。周玉川等人[15]研究方法為獲取人肝癌HepG2細(xì)胞在體外增殖、傳代、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組采用含濃度為0.5μg/ml的醫(yī)用臭氧水的培養(yǎng)液處理細(xì)胞，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞凋亡情況、細(xì)胞遷移能力變化。結(jié)果體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，含臭氧的培養(yǎng)基中細(xì)胞數(shù)量明顯減少，腫瘤細(xì)胞膜破裂，核固縮甚至裂解，臭氧對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)有抑制作用，同時(shí)CCK-8的檢測(cè)結(jié)果顯示臭氧能抑制肝癌細(xì)胞的增殖，Transwell遷移實(shí)驗(yàn)顯示臭氧能抑制腫瘤細(xì)胞的遷移。Kuroda的研究團(tuán)隊(duì)將臭氧水應(yīng)用于荷瘤小鼠局部，結(jié)果發(fā)現(xiàn)臭氧水局部應(yīng)用對(duì)正常臟器功能無(wú)影響；與對(duì)照組相比，臭氧水局部應(yīng)用組腫瘤壞死面積明顯增大，且具有劑量依賴性[14]。提示臭氧水可誘導(dǎo)腫瘤壞死，抑制腫瘤細(xì)胞增殖?；谝陨涎芯?，我科前期研究[16]，以臭氧水腹腔灌注治療癌性腹腔積液及晚期腫瘤患者，結(jié)果顯示臭氧水可抑制惡性腹水的生長(zhǎng)。

在歐洲，臭氧早已應(yīng)用于腰椎間盤突出、關(guān)節(jié)炎、肩周炎疾病，創(chuàng)傷及難治性潰瘍，抗自由基防衰老、中風(fēng)及病毒性肝炎等疾病的治療，其臨床療效得到了充分肯定。在醫(yī)學(xué)發(fā)展的今天，逐漸研究出將更純濃度的醫(yī)用臭氧和不同的載體結(jié)合，形成臭氧水，臭氧自體回輸血和臭氧氣體的直接運(yùn)用，臭氧可以在體內(nèi)發(fā)揮其強(qiáng)氧化性。中晚期原發(fā)性肝癌多由慢性病毒性肝炎，肝硬化逐步發(fā)展而來(lái)。中晚期肝癌常常不同程度伴有惡性腹水形成。臭氧針對(duì)人體機(jī)體慢性缺氧，在有限的組織血液中提高氧濃度的作用，直接抑制和殺滅細(xì)菌、病毒，延緩腫瘤的發(fā)展，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此，臭氧的治療在中晚期原發(fā)性肝癌的治療中有廣泛的臨床運(yùn)用前景。