脊髓損傷的代謝組學(xué)研究進展

1.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院，甘肅蘭州市730000；2.蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院全軍骨科中心，甘肅蘭州市730050；3河南省榮軍醫(yī)院，河南新鄉(xiāng)市453000

脊髓損傷是脊柱骨折的嚴重并發(fā)癥之一。脊髓損傷可能導(dǎo)致永久性的機體運動和感覺功能障礙，且由于脊髓損傷后發(fā)生一系列復(fù)雜的病理生理變化，目前難以治愈；同時長期臥床及功能喪失也會導(dǎo)致多種嚴重并發(fā)癥，治療及護理花費巨大，對家庭造成嚴重的精神及經(jīng)濟負擔(dān)[1-3]。雖然隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，嚴重脊髓損傷導(dǎo)致的死亡率明顯降低，但致殘率依然很高，絕大部分患者終身癱瘓。

當前反映脊髓損傷預(yù)后的指標主要有臨床功能評定和磁共振檢查等間接手段，一些生化指標如乳酸脫氫酶、蛋白激酶C、血清內(nèi)皮素等也用于預(yù)后判斷，但特異性均較差[4-5]。根據(jù)脊髓損傷后的即時美國脊柱損傷協(xié)會(American Spinal Injury Association,ASIA)分級來預(yù)測神經(jīng)系統(tǒng)恢復(fù)情況并不完全可靠[6]，目前尚缺乏能直接反映脊髓損傷嚴重程度及判斷其預(yù)后的特異性生物標志物。對于患者而言，他們最關(guān)心的是感覺及運動功能是否能夠恢復(fù)，鑒定一組能夠準確預(yù)測個體神經(jīng)、功能恢復(fù)能力的生物標志物對這些患者的康復(fù)以及臨床醫(yī)生的治療具有重大的意義。

代謝組學(xué)是通過考察生物體系(細胞、組織或生物體)受刺激或擾動后(如將某個特定的基因變異或環(huán)境變化后)其代謝產(chǎn)物的變化或其隨時間的變化，來研究生物體系代謝途徑的一門學(xué)科[7-8]。代謝組學(xué)研究生物體在疾病或環(huán)境刺激下的整體應(yīng)激和變化，通過分析個體應(yīng)激后代謝物的變化，更好地理解疾病的病變過程及機體內(nèi)代謝途徑的改變[9]。運用代謝組學(xué)的方法了解脊髓損傷后的病理生理過程，找出能夠用于輔助診斷或判斷預(yù)后的特異性生物標志物，傷后早期對脊髓神經(jīng)損傷程度和可能的預(yù)后做出準確判斷，能夠為臨床治療提供重要的參考依據(jù)，幫助臨床醫(yī)生制定最佳的治療及康復(fù)方案。

本文旨在綜述脊髓損傷和代謝組學(xué)的研究現(xiàn)狀以及代謝組學(xué)在脊髓損傷方面的研究進展，以期為脊髓損傷的進一步研究提供幫助。

1 脊髓損傷的研究現(xiàn)狀

脊髓損傷分為兩類：橫斷傷和挫傷(鈍性損傷)[10-11]。這兩種類型損傷都會導(dǎo)致血腦屏障的破壞，對脊髓組織產(chǎn)生原發(fā)或繼發(fā)性的損傷，最終導(dǎo)致脊髓細胞死亡或凋亡。血腦屏障的破壞導(dǎo)致炎癥細胞進入脊髓組織，浸潤的白細胞和常駐的小膠質(zhì)細胞釋放蛋白水解酶、氧化酶、活性氧和一系列促炎性細胞因子，如腫瘤壞死因子 α (tumor necrosis factor α,TNF-α)[12-13]。急性期促炎分子的峰值可以在受傷后24 h內(nèi)在人血中測量到[14-17]。但是由于急性期機體應(yīng)激反應(yīng)比較大，所以此時出現(xiàn)的變化可能是機體對于創(chuàng)傷的全身反應(yīng)的結(jié)果，而不是脊髓損傷本身。在進行脊髓損傷的實驗研究時，通過對建立的動物模型設(shè)置“假手術(shù)組”與“脊髓損傷組”進行對比，有助于分辨哪些物質(zhì)與脊髓損傷本身相關(guān)。

急性期炎癥反應(yīng)導(dǎo)致?lián)p傷原發(fā)部位及周圍組織發(fā)生繼發(fā)性損害，將進一步加重機體的神經(jīng)功能障礙。此外，膠質(zhì)細胞的激活在脊髓損傷的繼發(fā)性損傷中也起很大的作用。星形膠質(zhì)細胞活化后合成細胞外基質(zhì)，包括勿動蛋白A(Nogo protein-A,Nogo-A)、神經(jīng)硫酸軟骨素蛋白多糖(chondroitin sulfate proteoglycan,CSPGs)、少突膠質(zhì)細胞-髓磷脂糖蛋白(oligodendrocyte-myelin glycoprotein,OMgp)及髓鞘相關(guān)糖蛋白(myelin-associated glucoprotein,MAG)等，有大量文獻證實，Nogo-A、CSPGs、OMgp和MAG可以在體外抑制軸突生長和在體內(nèi)抑制軸突再生，并且在臨床前研究中，無論是針對單一分子還是針對幾種分子組合的治療均可促進脊髓損傷的神經(jīng)功能恢復(fù)[18-23]。

目前對于脊髓損傷治療的研究主要從兩方面入手[24]，一是神經(jīng)保護治療，通過低溫、手術(shù)減壓[25]，應(yīng)用粒細胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)[26]、糖皮質(zhì)激素、利魯唑[27]等，以減輕機械損傷、神經(jīng)毒性反應(yīng)、氧化應(yīng)激對脊髓神經(jīng)細胞的損害，從而抑制神經(jīng)細胞凋亡，減輕神經(jīng)細胞損傷；二是神經(jīng)再生治療，包括髓磷脂相關(guān)抑制劑靶向劑和成體細胞移植，通過促進神經(jīng)細胞的再生而恢復(fù)神經(jīng)功能。

雖然文獻報道了許多治療脊髓損傷的新方法，但由于建立臨床試驗來證明這些方法的安全性和有效性相當困難，所以臨床上并不會輕易將新療法應(yīng)用于患者。目前臨床上對脊髓損傷的治療仍然以傳統(tǒng)的方法為主，即手術(shù)復(fù)位脊柱骨折，解除對脊髓的壓迫，重建脊柱穩(wěn)定性，同時配合保守治療，減輕脊髓水腫、缺血、炎性應(yīng)激等反應(yīng)。但是，無論用什么方法，治療的最終目的均在于盡可能多地保留脊髓的神經(jīng)功能，避免繼發(fā)性損傷，提高患者的生存率和生活質(zhì)量。然而，對于脊髓損傷后的病理生理機制尚未完全清楚，現(xiàn)有的針對繼發(fā)性損傷過程的治療效果也相當有限，一些新方法也尚未被應(yīng)用于臨床，關(guān)于脊髓損傷的治療仍然是一個世界性的難題。因此，一組能夠用于輔助診斷及判斷預(yù)后的生物標志物的發(fā)現(xiàn)，將有可能使脊髓損傷的治療產(chǎn)生重大突破。

2 代謝組學(xué)概述

代謝組學(xué)作為基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)的重要補充，在短短數(shù)年內(nèi)取得了飛速的發(fā)展。代謝組學(xué)已經(jīng)被廣泛用來進行特異性生物標志物的尋找以及疾病病理生理機制的研究，并與其他組學(xué)技術(shù)聯(lián)合，以求能夠闡明疾病的發(fā)病機制，從病理代謝過程的角度揭示疾病發(fā)生發(fā)展的規(guī)律，從而積極有效地評價病情，制定最佳的治療方案[8-9,28]。代謝組學(xué)常用的分析技術(shù)包括核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)、色譜、質(zhì)譜、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)等，代謝組學(xué)可以對某個或某類相關(guān)的特定化合物進行靶向篩選，也可以對樣品中所有代謝產(chǎn)物進行無偏向性的非靶向篩選。

相比較基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)，代謝組學(xué)的優(yōu)點比較突出。首先，代謝組學(xué)檢測的是最終的代謝產(chǎn)物，基因和蛋白質(zhì)表達的微小變化都會在代謝上得到放大，從而更容易檢測；其次，代謝組學(xué)研究不需要建立全基因組測序的數(shù)據(jù)庫，只需要代謝物的數(shù)據(jù)庫，而且機體代謝物的種類也遠遠少于基因和蛋白質(zhì)的數(shù)量，工作量大大減少；最后，代謝組學(xué)的研究技術(shù)更通用，只需要對樣品進行不同的預(yù)處理，就可以滿足液態(tài)、固態(tài)等不同性質(zhì)或不同種類樣品的檢測[29]。

然而代謝組學(xué)技術(shù)也有一定的不足。樣品中殘留的酶解反應(yīng)和氧化還原反應(yīng)均會對結(jié)果產(chǎn)生一定影響，而且目前尚沒有一種能夠適合所有代謝物的提取方法；雖然GC-MS有商品化的質(zhì)譜圖庫，但還是有相當數(shù)量的代謝物或其衍生化產(chǎn)物的質(zhì)譜圖未包含其中，對這部分代謝物的鑒定仍比較困難。盡管現(xiàn)在代謝組學(xué)的技術(shù)還尚不完善，但是可以通過一系列的設(shè)計盡量將誤差降到最低。目前最佳的檢測方案是先使用非靶向的方法對樣品中代謝物進行整體的分析、辨認，避免研究的方向性錯誤，再利用靶向的方法對結(jié)果進行具體的分析、驗證，可以保證最大程度檢測出需要的所有代謝物，并提高檢測的準確性。

3 代謝組學(xué)在脊髓損傷中的應(yīng)用

脊髓原發(fā)性損傷或繼發(fā)性損傷最終導(dǎo)致脊髓神經(jīng)細胞死亡或凋亡，隨著這些死亡或凋亡脊髓細胞的破裂，一些在神經(jīng)組織損傷的指標中具有特異性的物質(zhì)也同時被釋放，釋放到腦脊液或血液中的特異性物質(zhì)可以提供大量關(guān)于脊髓損傷的生物學(xué)反應(yīng)的信息[30]。目前已有研究報道，神經(jīng)絲蛋白(neurofilament protein,NF)[31]、?；撬?taurine,Tau)[32]、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuronspecific enolase,NSE)[33]、 鈣 結(jié) 合 蛋 白 S100 β (calcium binding protein S100 β,S100 β)[33]和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)[31]等物質(zhì)首先被釋放到腦脊液中，然后吸收入血，所以在損傷局部和全身均可檢測到，而且能夠反復(fù)檢測，動態(tài)了解個體的脊髓神經(jīng)損傷進展或恢復(fù)情況，快速判斷患者對當前治療的反應(yīng)，從而了解當前治療對于該患者是否有效。這些物質(zhì)在腦脊液或血液中的量或許與脊髓神經(jīng)損傷的嚴重程度直接相關(guān)，通過對體液中這些物質(zhì)的檢測，能夠更準確判斷病情，避免延誤治療時機而造成不可逆的后果。

有關(guān)脊髓損傷的生物標志物，絕大多數(shù)研究都是建立在對特定目的蛋白的假設(shè)上。Shaw等[34]提出，由于NF在神經(jīng)元中的豐度很高，因此檢測腦脊液或血清中的NF極有可能指示神經(jīng)元損傷。在NF的三種亞基，即輕(Light,L)、中(Middle,M)、重(Heavy,H)中，磷酸化的NF-H，由于其對蛋白降解酶的相對抗性，被認為可能是神經(jīng)損傷后在血清或腦脊液中最容易檢測到。這個假設(shè)為后來更深入地研究奠定了基礎(chǔ)，用以評估脊髓損傷后這種生物標志物的潛在價值。然而，很少有研究鑒定脊髓損傷的新生物標志物。

Lubienicka等[35]使用高通量無標記液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜蛋白組學(xué)定量技術(shù)，比較了脊髓損傷后24 h大鼠的腦脊液，確定了42個具有潛在價值的生物標志物，其中10個標志物可能提示了脊髓損傷的嚴重程度。Sengupta等[36]采用無偏倚的蛋白組學(xué)定量的方法，使用差異凝膠電泳和質(zhì)譜分析技術(shù)比較脊髓損傷后1～8 d患者的腦脊液，鑒定了8種在脊髓完全和不完全損傷患者的腦脊液中差異表達的蛋白質(zhì)。Xu等[37]通過脂質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)評估脊髓組織中含有的多不飽和脂肪酸的磷脂酰膽堿，發(fā)現(xiàn)其中一種磷脂酰膽堿的空間表達與反應(yīng)性小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞的活性相匹配，這些脂質(zhì)組學(xué)分析可以闡明脂質(zhì)代謝的作用以及脊髓損傷后細胞膜的損傷情況。但是這些結(jié)果尚不能用于臨床，還需要對脊髓損傷患者的腦脊液或血液進行代謝組學(xué)的研究來驗證其作為生物標志物的價值，因為代謝組學(xué)代表了基因、轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)相互作用的終點，更能反應(yīng)脊髓損傷后的病理生理變化；對脊髓損傷患者腦脊液或血漿中這些代謝物的分析也可以用來判斷在大鼠實驗中的這些發(fā)現(xiàn)是否同樣適用于人類。

Kuhle等[38]以健康人群作為對照，研究血清NF-L作為人類脊髓損傷嚴重程度和預(yù)后生物標志物的價值，這些健康個體不可能顯示出任何異常的系統(tǒng)生物學(xué)反應(yīng)，因此，損傷組和對照組之間觀察到的一些差異很可能與脊髓損傷本身無關(guān)。即使能夠篩選出相同水平和類型的無脊髓損傷表現(xiàn)的創(chuàng)傷患者以及匹配的患者人口數(shù)，但是不可能保證對脊髓組織沒有任何的損傷。人類脊髓損傷的原因多種多樣，表現(xiàn)復(fù)雜多變，因此，可以認為干預(yù)的動物模型為脊髓損傷相關(guān)生物標志物的研究提供了便利。目前已經(jīng)產(chǎn)生了幾種不同的動物模型。

脊髓損傷的原因主要有兩類：銳器傷和挫傷。在動物模型中，挫傷最常見的是使用脊髓擊打器[39]，經(jīng)過校準的重物落下砸在暴露的脊髓上，這種裝置可以通過改變所使用的重力的大小而造成不同程度的損傷。但這種方法造成的損傷并不穩(wěn)定，需要大量預(yù)實驗來確定擊打的力度。另外一種新型的制造脊髓挫傷模型的方法是鉗夾法，使用動脈夾或標準鉗在設(shè)定的時間內(nèi)壓迫脊髓，從而達到損傷的效果[40]。而為了研究完全性損傷，通常需要使用手術(shù)剪或手術(shù)刀片切割離斷所有脊髓束，并且抽吸檢查是否造成了完全性損傷[41]。

動物模型是高度可控的，可以建立單一的損傷模型，沒有人與人之間脊髓損傷易變的復(fù)雜性，并可以通過設(shè)置假手術(shù)組，來檢測脊髓損傷和假損傷動物之間的代謝差異，避免了全身性反應(yīng)(如全身炎癥反應(yīng))對結(jié)果的影響，用以確定特異于脊髓損傷的生物標志物，這在臨床研究中不可能做到。而且在動物模型中，可以按照時間點，縱向分析比較急性、亞急性和慢性脊髓損傷后不同時間點的代謝變化，動態(tài)觀察脊髓損傷從損傷到自我修復(fù)整個過程中的病理生理機制。最后通過與人類樣品相比較，來驗證在動物模型身上發(fā)生的變化是否同樣適用于人類。不管是人類還是動物模型都是為了鑒定脊髓損傷發(fā)展過程中具有潛在價值的生物標志物[18]。

Fujieda等[42]通過建立大鼠脊髓損傷模型，對脊髓損傷組和假手術(shù)組大鼠的脊髓組織進行非靶向色譜聯(lián)用質(zhì)譜的代謝組學(xué)分析對比，發(fā)現(xiàn)N-乙酰-天冬氨酸-谷氨酸(N-acetyl aspartic acid-glutamic acid,NAAG)和N-乙酰天門冬氨酸(N-Acetylaspartate,NAA)的水平顯著降低，可能反映神經(jīng)細胞死亡。而且NAA可以在人體內(nèi)無創(chuàng)地測量，并有助于確定損傷嚴重程度并預(yù)測脊髓損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)的情況。Fujieda等[42]的研究提示NAA作為脊髓損傷相關(guān)特異性生物標志物的價值。Peng等[43]利用氫核磁共振(hydrogen nuclear magnetic resonance,1H-NMR)技術(shù)對脊髓損傷大鼠的血漿進行代謝組學(xué)分析，得到與Fujieda等[42]的研究類似的結(jié)果。但這些結(jié)果尚不能應(yīng)用于臨床的病情程度評估和預(yù)后判斷，尚需要對人類標本進行代謝組學(xué)分析對比，來驗證其可靠性。由于臨床上獲取人類脊髓標本是不可能的，而血漿受全身因素的影響較大，所以，腦脊液是進行臨床研究的最佳選擇。腦脊液是唯一與脊髓直接接觸的體液，其成分的變化可直接顯示中樞神經(jīng)系統(tǒng)的代謝情況，如炎癥、感染等，如果能夠獲取臨床的腦脊液標本進行代謝組學(xué)研究，其結(jié)果將更加可靠。

4 總結(jié)

代謝組學(xué)作為基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的重要補充，已經(jīng)滲透到科學(xué)研究的方方面面，具有良好的發(fā)展前景。雖然有研究通過不同方法已經(jīng)找到脊髓損傷相關(guān)的特異性生物標志物，但是，相關(guān)研究較少，不能保證結(jié)果的可靠性。而且大多數(shù)研究結(jié)果都是通過動物實驗獲得，是否能與人類脊髓損傷后的變化相匹配，仍需要大量的臨床實驗來驗證。所以，將這些結(jié)果應(yīng)用于臨床還有很大的困難，有待更多的高質(zhì)量研究來證實。此外，任何單一“組學(xué)”或檢測方法都不可能完全揭示疾病的發(fā)生發(fā)展過程，代謝組學(xué)研究的是機體物質(zhì)代謝過程的終點，需要和其他“組學(xué)”或檢測方法聯(lián)合起來，進一步闡明疾病的病理生理過程，為患者得到最佳的治療及康復(fù)提供可參考的依據(jù)。代謝組學(xué)作為“組學(xué)”大家庭的新成員，其本身并不完善，仍需在今后的不斷實踐中探索更加優(yōu)化的樣品處理及檢測分析方法，進一步提高結(jié)果的準確性。相信隨著代謝組學(xué)各項技術(shù)的不斷更新完善，脊髓損傷甚至更多嚴重復(fù)雜疾病的病理生理機制將會得到進一步的揭示，將會為疾病的診斷及治療打開一扇新的大門，更好地為人類謀福祉。