臍血干細(xì)胞移植對失代償期肝硬化患者TNF-α濃度和CD45RO+粒細(xì)胞表達(dá)的影響

董媛 師貞宗

失代償期肝硬化又叫肝硬化失代償期，是肝硬化的終末發(fā)展階段[1]。早期肝硬化肝功能尚具有代償性，但病情發(fā)展到一定的程度便會(huì)超出肝功能的代償能力，因此稱之為失代償期肝硬化，該階段表現(xiàn)為以門靜脈高壓、肝功能減退為主的臨床表現(xiàn)[2]。新鮮臍血具有充足的間充質(zhì)干細(xì)胞，同時(shí)具有較弱的免疫原性，臍血干細(xì)胞更為原始，具有較強(qiáng)的擴(kuò)增能力，因此臍血間充質(zhì)干細(xì)胞在臨床疾病中的應(yīng)用越來越普遍，各器官疾病的細(xì)胞移植均可采用這種新的替代細(xì)胞來源，運(yùn)用于終末期肝硬化具有十分重要的臨床意義[3]。本文探究對失代償期肝硬化患者進(jìn)行臍血干細(xì)胞移植的臨床療效，并檢測患者腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF-α）濃度和CD45RO+粒細(xì)胞表達(dá)的影響，為失代償期肝硬化的診治提供理論依據(jù)，報(bào)道如下。

資料與方法

一、一般資料

本組觀察對象為2015年7月至2016年7月于湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院消化內(nèi)科治療的80例失代償期肝硬化患者，進(jìn)行病歷資料回顧性分析，將40例在常規(guī)對癥、支持治療的基礎(chǔ)加用通過肝動(dòng)脈灌注性臍血干細(xì)胞移植治療的患者設(shè)為觀察組，40例常規(guī)治療的患者設(shè)為對照組。觀察組中男27例，女13例；年齡最大83歲，最小45歲，中位年齡（59.54±6.76）歲；病程最短2年，最長6年，平均（3.03±0.39）年；3例丙型肝炎所致肝硬化、22例乙型肝炎所致肝硬化、8例酒精所致肝硬化、4例血吸蟲型肝硬化，3例自身免疫疾病所致肝硬化；Child-Pugh分級(jí)：28例B級(jí)、12例C級(jí)；對照組中男26例，女14例；年齡最大82歲，最小45歲，中位年齡（60.21±6.32)歲；病程最短2年，最長7年，平均（3.11±0.41）年；2例丙型肝炎所致肝硬化、23例乙型肝炎所致肝硬化、7例酒精所致肝硬化、5例血吸蟲型肝硬化，3例自身免疫疾病所致肝硬化；Child-Pugh分級(jí)：26例B級(jí)、14例C級(jí)；本研究方案均獲得衛(wèi)計(jì)委以及我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：原發(fā)性肝病符合《內(nèi)科學(xué)》[4]診斷標(biāo)準(zhǔn)；所有患者均符合美國肝病學(xué)會(huì)《成人肝硬化腹水診療指南（2009年版）》[5]關(guān)于肝硬化失代償期診斷標(biāo)準(zhǔn)；Child-Pugh分級(jí)為B級(jí)、C級(jí)；患者或家屬同意治療方案；排除標(biāo)準(zhǔn)：病情嚴(yán)重生命垂危者；患者肝部癌變或其他組織惡性腫瘤者；合并嚴(yán)重感染者；兩組年齡、性別、疾病類型等一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。

二、方法

1.基礎(chǔ)治療：患者入院后均進(jìn)行常規(guī)對癥、支持治療，包括降酶、保肝、利尿、退黃、輸白蛋白治療，在常規(guī)治療上進(jìn)行臍血干細(xì)胞移植治療。臍血干細(xì)胞采集與移植：選取身體健康的足月產(chǎn)婦，分娩前做好各項(xiàng)病毒學(xué)以及酶學(xué)排查。胎兒娩出后馬上進(jìn)行斷臍，并進(jìn)行嚴(yán)格的包扎處理，通過采血袋針刺入胎盤側(cè)臍靜脈，采集150 ～ 200 ml臍血。通過臍帶血細(xì)胞處理試劑盒（湖州賽托森生物科技發(fā)展有限公司）進(jìn)行相應(yīng)操作，包括純化、分離，同時(shí)進(jìn)行干細(xì)胞計(jì)數(shù)，操作說明書進(jìn)行詳細(xì)操作，參照《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)范》第三版[6]，測出樣本核細(xì)胞總數(shù)A以及收集的有核細(xì)胞總數(shù)B，回收率=B/A×100%計(jì)算。細(xì)胞活性：取2滴細(xì)胞懸液加1滴2%錐蟲藍(lán)染液，5 ～ 10 min后取樣作濕片，高倍鏡檢，死細(xì)胞被染成藍(lán)色，活細(xì)胞不著色，原則上活性細(xì)胞數(shù)大于1×107個(gè)。臍帶血細(xì)胞放置于5 ml細(xì)胞轉(zhuǎn)移管內(nèi)，治療前2 h置于恒溫冰桶。

2.肝動(dòng)脈灌注性臍血干細(xì)胞移植方法：采用2%鹽酸利多卡因進(jìn)行局部麻醉，穿刺右側(cè)股動(dòng)脈參照Seldinger技術(shù)，通過數(shù)字減影血管造影的透視下完成5 FYashiro導(dǎo)管的引入，導(dǎo)絲輸送路線為肝總動(dòng)脈-肝固有動(dòng)脈-肝動(dòng)脈遠(yuǎn)端定，通過導(dǎo)絲的支撐將導(dǎo)管送至肝固有動(dòng)脈，進(jìn)行導(dǎo)管固定后拔出導(dǎo)絲。注入非離子型造影劑于導(dǎo)管，明確導(dǎo)管頭端處于超過胃十二指腸動(dòng)脈的位置后停止數(shù)字減影血管造影透視?；颊弑３制届o的呼吸，導(dǎo)管位置固定好后采用生理鹽水對導(dǎo)管內(nèi)殘留造影劑進(jìn)行沖洗，將臍血干細(xì)胞懸液從冰桶中取出待達(dá)到室溫后經(jīng)由導(dǎo)管勻速緩慢注入肝內(nèi)，干細(xì)胞純化分離的回收率為90%，每次干細(xì)胞數(shù)量（1 ～ 3）×108個(gè)，每周1次，共4 ～ 6次。并用生理鹽水嚴(yán)格沖洗導(dǎo)管殘留液。結(jié)束后拔管，采用動(dòng)脈壓迫器加壓對傷口進(jìn)行8 h的加壓包扎，伸直右下肢平臥8 h。

3.指標(biāo)判定標(biāo)準(zhǔn)：采集患者空腹外周靜脈血，檢查治療前與治療后肝功能，包括總膽紅素（total bilirubin，TBIL）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（cereal third transaminase，ALT）、血清白蛋白（albumin，ALB）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transaminase，AST）等。肝纖維化指標(biāo)，包括層粘連蛋白（laminin，LN）、透明質(zhì)酸酶（hyaluronidase，HA）、IV型膠原（type IV collagen，IVCol）、III型前膠原（procollagen type III，IIINP）。采用美國R&D公司快速ELISA試劑盒檢測治療前與治療后腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF-α）、白細(xì)胞介素6（interleukin，IL-6）等細(xì)胞因子水平。采用Attune NxT 流式細(xì)胞儀檢測治療前、治療6個(gè)月后CD45RO+淋巴細(xì)胞以及粒細(xì)胞表達(dá)水平。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

采用SPSS 16.00統(tǒng)計(jì)軟件，肝功能、肝纖維化指標(biāo)、TNF-α、IL-6、CD45RO+淋巴細(xì)胞以及粒細(xì)胞表達(dá)水平以±s表示，組間比較采用獨(dú)立t檢驗(yàn)，治療前后比較采用配對t檢驗(yàn)，以P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、治療前后肝功能比較

兩組治療后TBIL、ALT、AST水平顯著低于治療前，ALB高于治療后，治療后組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05，表1，表2）。

二、治療前后肝纖維化指標(biāo)比較

兩組治療后LN、HA、IVCol、IIINP低于治療前，且治療后組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05，表3，表4）。

三、治療前后TNF-α、IL-6比較

兩組治療后TNF-α、IL-6均逐漸降低，且治療后組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05，表3）。

四、治療前后CD45RO+淋巴細(xì)胞以及粒細(xì)胞表達(dá)水平比較

治療后CD45RO+淋巴細(xì)胞以及粒細(xì)胞表達(dá)水平均低于治療前，且組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05，表4）。

表1 治療前后TBIL、ALT水平比較（±s）

表1 治療前后TBIL、ALT水平比較（±s）

ALT（U/L）治療前治療后t 值P值治療前治療后t 值P值觀察組48.54±13.4333.65±10.2618.6560.00080.76±17.4356.76±14.2727.4530.000對照組48.34±13.4338.65±10.0812.5460.00080.45±17.2164.23±14.5621.5460.000 t 值 0.2372.1990.1322.652 P值0.8210.0310.8850.010分組TBIL（μmol/L）

表2 治療前后AST、ALB水平比較（±s）

表2 治療前后AST、ALB水平比較（±s）

ALB（g/L）治療前治療后t 值P值治療前治療后t 值P值觀察組75.65±20.3348.54±17.0432.5460.00030.65±7.4336.65±8.320.1240.862對照組75.62±20.1758.21±17.0226.7580.00030.54±7.2732.56±8.125.3430.000 t 值 0.1282.1990.2132.225 P值0.8240.0320.8450.029分組AST（U/L）

表3 治療前后肝纖維化指標(biāo)LN、HA比較（μg/L，±s）

表3 治療前后肝纖維化指標(biāo)LN、HA比較（μg/L，±s）

HA治療前治療后t 值P值治療前治療后t 值P值觀察組221.78±19.54126.67±15.6518.6560.000365.43±45.33231.67±34.4327.4530.000對照組219.56±18.90143.65±15.2112.5460.000366.32±45.41248.64±34.8721.5460.000 t 值 0.2374.9200.0652.190 P值0.8210.0000.9320.032分組LN

表4 治療前后肝纖維化指標(biāo)IVCol、IIINP比較（μg/L，±s）

表4 治療前后肝纖維化指標(biāo)IVCol、IIINP比較（μg/L，±s）

IIINP治療前治療后t 值P值治療前治療后t 值P值觀察組256.45±28.54172.67±25.4335.5870.00048.43±6.4332.54±5.4314.2340.000對照組258.12±28.31188.67±26.5627.5460.00048.65±6.2138.54±6.4111.3400.000 t 值 0.1272.7520.2124.517 P值0.8260.0070.8560.000分組IVCol

表5 治療前后TNF-α、IL-6比較（pg/ml，±s）

表5 治療前后TNF-α、IL-6比較（pg/ml，±s）

IL-6治療前治療后t 值P值治療前治療后t 值P值觀察組22.43±4.5414.78±4.0514.6230.00028.65±7.4315.87±6.0521.3230.000對照組22.39±4.6116.78±4.3212.3450.00028.87±7.4519.09±6.1215.4540.000 t 值 0.0672.1360.0652.367 P值0.9430.0360.9320.020分組TNF-α

表6 治療前后CD45RO+淋巴細(xì)胞以及粒細(xì)胞表達(dá)水平比較（%，±s）

表6 治療前后CD45RO+淋巴細(xì)胞以及粒細(xì)胞表達(dá)水平比較（%，±s）

CD45RO+粒細(xì)胞治療前治療后t 值P值治療前治療后t 值P值觀察組27.54±4.3222.54±3.6535.5870.00029.54±7.5422.54±6.5419.4540.000對照組27.60±4.3625.11±3.3827.5460.00029.60±7.6525.54±6.3714.3450.000 t 值 0.0632.1320.0652.078 P值0.9230.0340.9320.041分組CD45RO+淋巴細(xì)胞

討 論

肝硬化主要指肝臟彌漫性損害，該病由單種或多種致病因素反復(fù)、長期刺激所引起，主要病理特征為肝細(xì)胞壞死變性、彌漫性結(jié)締組織慢性增生、形成假小葉以及損害肝小葉結(jié)構(gòu)。失代償期肝硬化是肝硬化的終末期，臨床上無特效治療方法，主要采用對癥以及支持治療，如何改善失代償期肝硬化肝功能、緩解肝纖維化是該癥研究熱點(diǎn)及難點(diǎn)[7]。近年來隨著再生醫(yī)學(xué)及干細(xì)胞技術(shù)的研究深入，通過干細(xì)胞移植為基礎(chǔ)的細(xì)胞治療成為失代償期肝硬化的新方案。干細(xì)胞具有多向分化潛能以及自我更新的特點(diǎn)，在條件適宜的情況下能夠向多種功能細(xì)胞分化[8]。有研究證明，肝硬化患者肝細(xì)胞再生及肝損傷過程中，干細(xì)胞的作用較為明顯，干細(xì)胞經(jīng)體外分離純化后移植于肝硬化患者肝內(nèi)，其分化特性有助于定植于肝臟中，恢復(fù)和重構(gòu)損傷的肝功能[9]。本研究中，患者經(jīng)臍血干細(xì)胞移植后各項(xiàng)肝功能指標(biāo)均改善，提示患者肝功能的提升。同時(shí)各項(xiàng)肝纖維化指標(biāo)的降低使肝硬化患者肝纖維化進(jìn)程受到抑制，研究結(jié)果與上述觀點(diǎn)吻合[10]。

失代償期肝硬化的血循環(huán)、腹水中的內(nèi)毒素水平較高，肝組織受到內(nèi)毒素、病毒的不斷刺激，TNF-α是一種重要的炎癥始發(fā)細(xì)胞因子，主要作用對象是免疫炎性細(xì)胞與血管內(nèi)皮系統(tǒng)，能夠觸發(fā)機(jī)體炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)[11]。大多數(shù)單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞受到內(nèi)毒素、TNF-α、IL-1因素的刺激后會(huì)產(chǎn)生IL-6，IL-6在細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中表現(xiàn)出多種生物學(xué)功能[12]。有研究發(fā)現(xiàn)，IL-6能夠作為肝細(xì)胞刺激因素，可在對肝細(xì)胞的直接刺激下促進(jìn)其分泌膠原及增生，同時(shí)對儲(chǔ)能細(xì)胞刺激后其增生并合成LN、膠原以及蛋白多糖，同時(shí)對免疫球蛋白、細(xì)胞因子的表達(dá)具有促進(jìn)作用，通過對膠原酶活性的抑制，緩解膠原蛋白的降解過程，最終導(dǎo)致肝臟膠原沉積，形成肝纖維化[13]。本研究治療后TNF-α、IL-6水平降低，其原因在于臍血干細(xì)胞能夠分泌IL-10等細(xì)胞因子，改變肝臟的微環(huán)境，減輕炎性反應(yīng)，達(dá)到降低TNF-α、IL-6的目的[14]。CD45RO+能夠反應(yīng)機(jī)體炎癥反應(yīng)的嚴(yán)重程度，本研究證明臍血干細(xì)胞植入后降低炎癥反應(yīng)，相應(yīng)的，CD45RO+淋巴細(xì)胞及粒細(xì)胞表達(dá)水平均降低[15]。各指標(biāo)進(jìn)行組間比較后發(fā)現(xiàn)，加用臍血干細(xì)胞移植的觀察組患者各項(xiàng)數(shù)據(jù)均優(yōu)于常規(guī)治療，這得益于兩者在提升肝功能，降低炎癥反應(yīng)的協(xié)同作用。

綜上所述，失代償期肝硬化通過臍血干細(xì)胞移植治療能夠改善肝功能，降低相關(guān)肝纖維化指標(biāo)，降低TNF-α、IL-6等細(xì)胞因子的水平以及CD45RO+淋巴細(xì)胞以及粒細(xì)胞表達(dá)水平，可作為新型治療失代償期肝硬化有效方案。

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