齊墩果酸通過PPARγ調(diào)控人臍靜脈內(nèi)皮細胞抗氧化損傷作用

朱寶華 谷春景 劉鳳蓮 劉璐 任艷紅

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種常見的心血管致死性疾病，成為所有心血管疾病中的主要危險因子。目前，AS被認為是一種與血管壁脂質(zhì)沉積相關(guān)的，且由免疫介導(dǎo)的慢性炎癥性疾病，它的發(fā)病機制極其復(fù)雜。低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）是AS發(fā)生發(fā)展過程中的一個主要危險分子，其在AS中的主要表現(xiàn)形式是氧化LDL（oxidative-LDL，ox-LDL）。ox-LDL不僅可導(dǎo)致內(nèi)皮細胞損傷，還可促進內(nèi)皮細胞凋亡的發(fā)生，增強內(nèi)皮通透性，也能夠促使單核細胞向內(nèi)皮細胞發(fā)生遷移，加強其附著力，從而促使AS的發(fā)生發(fā)展[1-2]。因此，阻止血管內(nèi)皮細胞的病變對治療AS具有重要的臨床價值。

齊墩果酸（oleanolic acid，OA）是屬于五環(huán)三萜類化合物，以游離或者成苷的形式存在，其在食物、藥用植物等多種植物中廣泛存在。研究表明，OA具有抗氧化[3]、抗炎[4]以及抗AS[5]等多種生物學(xué)功能。本課題組已有的發(fā)現(xiàn)表明，OA對人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）氧化損傷具有保護作用[6-7]。但是，OA的這種抗內(nèi)皮細胞氧化損傷作用機制尚未明確，需要進一步探討和研究。

過氧化物酶體增殖激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor，PPARγ）是一種配體依賴的核轉(zhuǎn)錄因子，屬于核受體超家族成員。PPARγ在血管壁內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞、巨噬細胞和泡沫細胞都有較高水平的表達[8]。在心血管系統(tǒng)中，PPARγ可通過抗炎作用，抑制血管平滑肌增殖遷移，保護血管內(nèi)皮細胞，增加膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運等作用發(fā)揮抗AS效應(yīng)[9]?；赑PARγ抗AS功能以及本小組的前期研究結(jié)果，認為PPARγ在OA的抗內(nèi)皮細胞氧化損傷中扮演重要角色，并初步探討PPARγ參與OA抗內(nèi)皮細胞氧化損傷作用的分子機制。

材料與方法

一、試劑：齊墩果酸（OA，≥99%）購買于美國Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基以及胎牛血清購買于美國Gibco公司；BCA蛋白定量試劑盒購買于上海碧云天公司；MTT購買于美國Sigma公司。SOD、GSH-Px、MDA檢測試劑盒購自武漢優(yōu)爾生公司；ROS試劑盒由上海碧云天公司提供；PPARγ抑制劑GW9662由美國Cayman公司提供；抗PPARγ單克隆抗體購自美國CST公司；羊抗鼠抗體購自美國Cell Signaling公司。

二、實驗方法

1.實驗分組：對照組，ox-LDL模型組，ox-LDL+OA（10 μmol/L，20 μmol/L，40 μmol/L）組，ox-LDL+OA（10 μmol/L，20 μmol/L，40 μmol/L）+GW9662，GW9662單獨處理組。

2.細胞培養(yǎng)：將HUVECs（購買于中國科學(xué)院上海細胞庫）按（密度）接種于培養(yǎng)瓶或者培養(yǎng)板中，加入適量含有10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，置于一定條件（37 ℃，5% CO2）的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。待細胞生長至70%～ 80%融合度，用胰酶消化細胞，并按1：3 ～ 5進行傳代培養(yǎng)。

3. MTT實驗：將處于對數(shù)生長期的HUVECs（5×103個/孔）均勻接種到96孔板中，放置于細胞培養(yǎng)箱中孵育。藥物處理細胞結(jié)束后，向每孔中加入5 mg/ml的MTT（20 μl）試劑，置于培養(yǎng)箱中孵育4 h，去掉上清液，加入150 μl DMSO，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育30 min，充分溶解結(jié)晶物，在波長為570 nm的條件下，用酶標(biāo)儀檢測每孔的吸光度（A）值。

4.脂質(zhì)過氧化物檢測：HUVECs的SOD、GSH以及MDA水平都是應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗法，其主要區(qū)別是微孔板包被的單克隆抗體不同。具體操作步驟參考試劑盒說明書。所有標(biāo)準(zhǔn)品、樣本加入微孔板后，經(jīng)孵育、洗滌、二抗孵育、洗滌、加入底物顯色并終止，在波長為450 nm的條件下，用酶標(biāo)儀測定樣品A值，并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出樣品濃度。

細胞內(nèi)ROS水平運用活性氧檢測試劑盒，主要利用DCFH-DA熒光探針的強度來反應(yīng)細胞內(nèi)ROS的濃度。詳細的操作步驟參考試劑盒說明書，最后，用流式細胞儀檢測。

5. Western blot檢測PPARγ蛋白的表達水平：藥物處理細胞后，提取細胞蛋白進行，使用蛋白定量試劑盒測定各組蛋白濃度，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離細胞蛋白，應(yīng)用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶對PVDF膜進行封閉，于4 ℃條件下過夜孵育一抗（PPARγ、β-actin），抗體稀釋比例均為1：1 000。用TBST于搖床上洗滌PVDF膜3次，每次10 min。室溫孵育二抗60 min。用TBST于搖床上洗滌PVDF膜3次，每次10 min。加入顯色劑，用成像儀顯影。

三、統(tǒng)計學(xué)分析方法

使用SPSS 20統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，細胞存活率、SOD、GSH、MDA、ROS相對熒光強度以及PPARγ蛋白水平實驗數(shù)據(jù)用±s表示，多組間比較使用單因素方差分析，組與組之間的比較采用兩樣本t檢驗，以P＜ 0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、OA提高ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs細胞存活率結(jié)果

MTT檢測結(jié)果顯示，ox-LDL組的細胞存活率為（49.17±0.62）%，OA（10、20、40 μmol/L）預(yù)處理可顯著減弱ox-LDL對HUVECs細胞存活率的降低，其存活率分別為（68.51±1.16）%、（82.64±0.73）%、（92.37±0.13）%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t= 24.35，26.18，35.17，P= 0.034，0.027，0.008）；且呈劑量依賴性關(guān)系，以上結(jié)果提示OA可拮抗ox-LDL誘導(dǎo)HUVECs細胞的細胞損傷（圖1）。

圖1 OA對ox-LDL抑制HUVECs細胞活力的影響

二、OA逆轉(zhuǎn)ox-LDL誘導(dǎo)HUVECs的氧化損傷結(jié)果

本研究進一步探討了OA對ox-LDL作用下HUVECs細胞的抗氧化物質(zhì)SOD、GSH活性和氧化損傷相關(guān)指標(biāo)ROS、MDA水平的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ox-LDL組的細胞SOD、GSH、ROS和MDA水平，與ox-LDL+OA（10 μmol/L）組、ox-LDL+OA（20 μmol/L）組、ox-LDL+OA（40 μmol/L）組的細胞SOD、GSH、ROS和MDA水平比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。同時，本研究還發(fā)現(xiàn)，OA對ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs細胞SOD、GSH活性的降低和MDA、ROS水平的增加抑制作用呈劑量依賴關(guān)系。以上結(jié)果表明OA可抑制ox-LDL誘導(dǎo)HUVECs細胞SOD，GSH含量的降低以及ROS和MDA水平的增加（表1）。

三、OA減弱ox-LDL對HUVECsPPARγ蛋白的下調(diào)作用結(jié)果

基于PPARγ抗動脈粥樣硬化作用，于是猜想OA抗ox-LDL氧化損傷作用是否與調(diào)控內(nèi)皮細胞PPARγ的表達水平有關(guān)。因此，進一步檢測預(yù)處理OA的情況下，ox-LDL作用下的HUVECs細胞中PPARγ蛋白水平是否有變化。Western blot結(jié)果顯示，OA預(yù)處理能明顯逆轉(zhuǎn)ox-LDL誘導(dǎo)的PPARγ蛋白水平的降低，且隨著濃度的增加，OA的這種逆轉(zhuǎn)作用也不斷提高。以上結(jié)果提示，OA可拮抗ox-LDL導(dǎo)致的HUVECs細胞PPARγ蛋白水平的降低 （圖2）。

圖2 OA對ox-LDL抑制HUVECs細胞PPARγ蛋白表達水平的影響

表1 OA對ox-LDL抑制HUVECs細胞氧化損傷的影響（±s）

表1 OA對ox-LDL抑制HUVECs細胞氧化損傷的影響（±s）

注：與對照組比較，aP ＜ 0.01；與ox-LDL組比較，bP ＜ 0.01

分組樣本數(shù)SOD（μmol/g）GSH（μmol/g）MDA（kU/g）ROS相對熒光強度（%）對照組316.12±0.06132.16±2.112.03±0.04100.04±0.45 ox-LDL3 5.43±0.08a 49.72±1.28a 2.63±0.02a 158.12±0.39a ox-LDL+OA（10 μmol/L）3 10.60±0.14b 108.36±2.05b 2.41±0.21b 136.18±1.24b ox-LDL+OA（20 μmol/L）3 13.28±0.09b 129.58±0.09b 2.26±0.15b 126.43±1.51b ox-LDL+OA（40 μmol/L）3 14.86±0.16b 131.47±0.76b 2.14±0.08b 112.39±1.07b F值26.3831.2756.8241.16 P值 0.005 0.004 0.002 0.003

表2 PPARγ抑制劑對OA抗ox-LDL抑制HUVECs細胞氧化損傷的影響（±s）

表2 PPARγ抑制劑對OA抗ox-LDL抑制HUVECs細胞氧化損傷的影響（±s）

注：與對照組比較，aP ＜ 0.01；與ox-LDL組比較，bP ＜ 0.01；與各自ox-LDL+OA組比較，cP ＜ 0.01

分組樣本數(shù)SOD（μmol/g）GSH（μmol/g）MDA（kU/g）ROS相對熒光強度（%）對照組3 17.05±0.12135.28±2.142.16±0.15100.53±1.08 ox-LDL3 6.41±0.04a 50.38±0.13a2.71±0.12a160.05±0.46a ox-LDL+OA（10 μmol/L）3 10.58±0.13b 102.46±0.06b2.42±0.08b144.38±2.02b ox-LDL+OA（20 μmol/L）3 13.25±0.05b 122.59±0.33b2.23±0.16b123.94±0.15b ox-LDL+OA（40 μmol/L）3 15.88±0.14b 140.26±1.05b2.02±0.13b187.52±0.68b oxLDL+OA(10 μmol/L)+GW96623 8.42.±0.05c 88.38±0.48c2.83±0.01c154.41±1.04c oxLDL+OA(20 μmol/L)+GW96623 10.59.±0.12c 106.42±0.15c2.61±0.07c138.12±1.15c oxLDL+OA(40 μmol/L)+GW96623 13.65.±0.03c 124.61±1.27c2.49±0.04c126.51±0.73c GW96623 16.02±0.13130.14±2.041.98±0.29103.15±0.29 F值35.0842.3126.8433.73 P值0.0030.0010.0040.003

四、PPARγ抑制劑部分逆轉(zhuǎn)OA對ox-LDL抑制HUVECs細胞活力的拮抗作用結(jié)果

為了探討PPARγ在OA抗ox-LDL導(dǎo)致的HUVECs細胞氧化損傷的作用，首先檢測了PPARγ抑制劑GW9662（10 μmol/L）預(yù)處理對OA拮抗ox-LDL導(dǎo)致的HUVECs細胞活力降低的影響。結(jié)果顯示，與ox-LDL+OA（20 μmol/L）組比較，ox-LDL+OA（20 μmol/L）+GW9662組的細胞活力明顯降低，為（63.31±1.15）%。以上結(jié)果表明GW9662預(yù)處理可部分逆轉(zhuǎn)OA對ox-LDL導(dǎo)致的HUVECs細胞存活率降低的拮抗作用，提示PPARγ蛋白可能參與了OA的抗ox-LDL導(dǎo)致的HUVECs細胞氧化損傷作用（圖3）。

圖3 PPARγ抑制劑對OA抗ox-LDL抑制HUVECs細胞活力的影響

五、PPARγ抑制劑可減弱OA對ox-LDL誘導(dǎo)HUVECs細胞氧化損傷的改善作用結(jié)果

接下來本研究探討PPARγ抑制劑GW9662對OA抗ox-LDL誘導(dǎo)HUVECs細胞氧化損傷的逆轉(zhuǎn)作用，以進一步闡明PPARγ蛋白對OA拮抗ox-LDL誘導(dǎo)HUVECs細胞氧化損傷的介導(dǎo)作用。結(jié)果顯示，與ox-LDL+OA（10 μmol/L）組比較，ox-LDL+OA（10 μmol/L）+GW9662組的SOD、GSH水平明顯降低而MDA、ROS水平明顯升高與ox-LDL+OA（20 μmol/L）組比較，ox-LDL+ OA（20 μmol/L）+GW9662組的SOD、GSH水平明顯降低而MDA、ROS水平明顯升高與ox-LDL+OA（40 μmol/ L）組比較，ox-LDL+OA（40 μmol/ L）+GW9662組的SOD、GSH水平明顯降低，而MDA、ROS水平明顯升高。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，抑制PPARγ后，OA抑制ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs細胞的氧化損傷仍存在劑量效應(yīng)。以上結(jié)果表明PPARγ抑制劑GW9662OA預(yù)處理可減弱OA對ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs細胞SOD，GSH含量降低以及ROS和MDA水平增加的抑制作用，提示OA可通過PPARγ拮抗ox-LDL導(dǎo)致的HUVECs細胞氧化損傷（表2）。

討 論

氧化應(yīng)激在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色，特別是活性氧常常伴隨在AS的發(fā)展過程中[10-11]。過多活性氧的產(chǎn)生可直接損傷細胞膜、蛋白質(zhì)和DNA。且線粒體DNA對氧化損傷極其敏感[11]。最近有研究表明，活性氧水平的增加參與炎癥的發(fā)生，可導(dǎo)致血流量和剪切應(yīng)力的異常以及誘導(dǎo)動脈壁的重塑[12]。正常生理條件下，機體的抗氧化系統(tǒng)能夠消除多余的活性氧，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激功能。然而，當(dāng)機體處于病理狀態(tài)時，細胞內(nèi)活性氧生成量增加，抗氧化物酶活性受到抑制，進而損傷蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等生物大分子，導(dǎo)致細胞功能發(fā)生障礙，最終誘導(dǎo)有關(guān)疾病的形成[13-14]。機體調(diào)控活性氧的抗氧化劑主要有由抗氧化劑如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）以及谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）[15]。有研究表明，ox-LDL的生產(chǎn)量增加可促進AS進程[16]。GALLE和他的同事等發(fā)現(xiàn)，濃度為10 ～ 300 mg/L的ox-LDL可誘導(dǎo)HUVEC細胞中活性氧的產(chǎn)生，并呈濃度依賴性關(guān)系，且高濃度的ox-LDL可誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞發(fā)生死亡[17]。

OA是一種天然的五環(huán)三萜類化合物，普遍存在于許多的藥用植物中，能夠產(chǎn)生抗氧化效應(yīng)。目前的研究資料表明，OA在治療氧化應(yīng)激有關(guān)的疾病包括炎癥、糖尿病以及癌癥等方面取得了明顯的效果[18]。研究進一步發(fā)現(xiàn)，OA的抗氧化作用與其提高多種抗氧化酶的活性有關(guān)[19]。本研究結(jié)果顯示，濃度為10 μmol/L，20 μmol/L和40 μmol/L的OA預(yù)處理可顯著減弱ox-LDL對HUVECs細胞存活率的抑制作用，且呈濃度依賴性關(guān)系。為了探討OA對ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs細胞氧化應(yīng)激的影響，本研究檢測了OA對ox-LDL作用下的抗氧化劑SOD和GSH活性以及氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)ROS和MDA水平的影響。結(jié)果顯示，OA預(yù)處理可減弱ox-LDL誘導(dǎo)HUVECs細胞SOD，GSH含量的降低。同時，OA預(yù)處理可拮抗ox-LDL誘導(dǎo)HUVECs細胞ROS和MDA水平的增加。以上結(jié)果表明OA可改善ox-LDL誘導(dǎo)HUVECs細胞的氧化損傷。

PPARγ是核受體超家族成員之一，其在心血管疾病中起重要作用。PPARγ可通過抗炎，保護血管內(nèi)皮細胞以及抑制血管平滑肌增殖和遷移作用發(fā)揮抗AS功能[9]。有趣的是，γ-谷氨酰半胱氨酸乙酯對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的肝損傷的保護作用與PPARγ的表達上調(diào)以及氧化應(yīng)激的減弱有關(guān)[20]。以上資料提示，PPARγ在OA抗ox-LDL誘導(dǎo)HUVECs細胞的氧化損傷中具有重要作用。于是，首先檢測了OA對ox-LDL作用下的HUVECs細胞中PPARγ蛋白表達的影響。結(jié)果顯示，OA能劑量依賴性的抑制ox-LDL誘導(dǎo)的PPARγ蛋白水平的下調(diào)，這表明OA可減弱ox-LDL導(dǎo)致的HUVECs細胞PPARγ蛋白水平的降低。為了進一步確定PPARγ蛋白是否參與OA的抗ox-LDL導(dǎo)致的HUVECs細胞氧化損傷作用，接著探討了PPARγ抑制劑GW9662預(yù)處理對OA抗ox-LDL誘導(dǎo)HUVECs細胞氧化損傷的影響，以闡明PPARγ蛋白對OA拮抗ox-LDL導(dǎo)致的HUVECs細胞氧化損傷的介導(dǎo)作用。結(jié)果顯示，PPARγ抑制劑可逆轉(zhuǎn)OA對ox-LDL抑制HUVECs細胞活力的拮抗作用。此外，抑制PPARγ后，OA減弱ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs細胞活性降低仍存在劑量效應(yīng)。本研究進一步發(fā)現(xiàn)PPARγ抑制劑GW9662OA可減弱OA對ox-LDL誘導(dǎo)HUVECs細胞，SOD，GSH含量的降低以及ROS和MDA水平的增加的抑制作用。此外，抑制PPARγ后，OA抑制ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs細胞的氧化損傷仍存在劑量效應(yīng)。這表明抑制PPARγ蛋白表達可部分逆轉(zhuǎn)OA對ox-LD導(dǎo)致的HUVECs細胞氧化損傷，提示OA可通過PPARγ拮抗ox-LDL導(dǎo)致的HUVECs細胞氧化損傷。

綜上所述，OA對ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs細胞氧化產(chǎn)生保護作用的分子機制與其調(diào)控PPARγ蛋白有關(guān)，這為OA治療AS的分子機制提供了新的視角。

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