包裝飲用水中銅綠假單胞菌檢驗(yàn)析釋

劉小根+許春蘭+金元寶

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一種重要的水源性條件致病菌，廣泛存在于各類型水中，對消毒劑、干燥、紫外線燈理化因素具有較強(qiáng)的抵抗力，可引起急性腸道炎、腦膜炎、敗血癥和皮膚炎癥等疾病。近年來，銅綠假單胞菌污染桶裝水的情況報(bào)道較多，是市面上包裝飲用水最容易出現(xiàn)的質(zhì)量問題；2016年江西省瓶（桶）裝飲用水不合格率高發(fā)，主因是銅綠假單胞菌超標(biāo)嚴(yán)重，該項(xiàng)目政府抽檢不合格率為21.93%，遠(yuǎn)超其他抽檢項(xiàng)目，質(zhì)量安全問題十分嚴(yán)重，主要原因是生產(chǎn)企業(yè)沒有做好日常生產(chǎn)過程的微生物監(jiān)控，生產(chǎn)過程的消毒效果缺乏準(zhǔn)確的驗(yàn)證方法，使得生產(chǎn)的產(chǎn)品質(zhì)量失控。

GB8538-2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 飲用天然礦泉水檢驗(yàn)方法是國家最新公布的針對包裝飲用水銅綠假單胞菌的檢驗(yàn)方法，檢驗(yàn)程序如下：

標(biāo)準(zhǔn)的檢測過程寫的比較精煉，對于一般生產(chǎn)企業(yè)的檢測人員來說在實(shí)際的檢測過程中，會(huì)遇到比較多的問題，以下來對其中的可能的檢測難點(diǎn)一一說明并推薦相應(yīng)的解決辦法。

操作步驟：

1.水樣過濾。

取好的水樣需在100級的潔凈工作臺用0.45um的濾膜進(jìn)行抽濾，將微生物截留在濾膜上，再將濾膜貼在CN瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，應(yīng)避免在濾膜和培養(yǎng)基之間夾留氣泡。

這個(gè)步驟中有兩個(gè)方面檢測方法中未說明，一是采用何種濾器和如何滅菌，二是濾膜如何滅菌。

包裝水生產(chǎn)企業(yè)可以購買專用的不銹鋼濾器，一般材質(zhì)是不銹鋼的，可以用牛皮紙包好后直接放入滅菌鍋內(nèi)進(jìn)行滅菌；也可以購買常見的砂芯過濾器（如津騰），同樣可以用牛皮紙包好后放入滅菌鍋滅菌；如果需要使用的濾器數(shù)量較多，介紹可以采用75%酒精全浸泡的方式滅菌，浸泡后放置在已滅菌容器中在潔凈工作臺晾干。使用前先用無菌水抽濾一次以避免酒精殘留影響檢測結(jié)果。浸泡半分鐘以上即可起到滅菌效果。

通過使用添加了標(biāo)準(zhǔn)菌綠膿桿菌（ATCC27853）的生理鹽水（高含量）和無菌生理鹽水交叉過濾共6次，濾器滅菌方式分別采用滅菌鍋高溫滅菌和75%酒精全浸泡滅菌，CN瓊脂培養(yǎng)后結(jié)果均符合要求：添加了標(biāo)準(zhǔn)菌的生理鹽水樣品在CN瓊脂上生長良好，兩種滅菌方式數(shù)量沒有明細(xì)區(qū)別，特征符合；無菌生理鹽水樣品在CN瓊脂上未發(fā)現(xiàn)有菌落生長（見圖1）。

濾膜滅菌可以直接用純水煮沸三次后使用，也可以放在合適的容器中加入適量無菌水，包好后放入高壓滅菌鍋121℃滅菌15分鐘進(jìn)行滅菌。

2.濾膜在CN瓊脂培養(yǎng)和觀察

CN瓊脂培養(yǎng)后的菌落形態(tài)分以下三種，其它情況為非銅綠假單胞菌：

（1）藍(lán)色或綠色的典型可疑菌落，直接做綠膿菌素的確證性實(shí)驗(yàn)，這個(gè)現(xiàn)象比較明顯，也容易辨認(rèn)；

（2）非藍(lán)綠色而在365nm紫外燈照射下產(chǎn)熒光的菌落，這種類型的可疑菌落需進(jìn)行乙酰胺肉湯確證性實(shí)驗(yàn)；

（3）是紅褐色菌落紫外燈照射下也不產(chǎn)熒光，需進(jìn)行氧化酶測試、乙酰胺液體培養(yǎng)基確證，金氏B培養(yǎng)基確證。

所有三種情況均需接種到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行純化。

根據(jù)日常檢測數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)，前兩種的情況較多，第三種情況最少，而第二種即非藍(lán)/綠色的產(chǎn)熒光的菌落最具有迷惑性，也是檢驗(yàn)的難點(diǎn)所在，需要特別仔細(xì)的進(jìn)行驗(yàn)證。

典型菌落的形態(tài)周圍呈現(xiàn)融化的狀態(tài)，菌落數(shù)較少的情況下，劃線純化比較簡單；菌落數(shù)較多的情況劃線就比較麻煩了，因?yàn)榈谝环N典型可疑菌落是直接目測能看到的，而第二種情況產(chǎn)熒光是需要在360nm的紫外燈照射下才能看見是否產(chǎn)熒光，這就會(huì)可能導(dǎo)致劃線純化的時(shí)候可疑和典型菌落出現(xiàn)混淆錯(cuò)劃的情況，會(huì)導(dǎo)致結(jié)果的截然不同。例如：挑取藍(lán)綠色可疑菌落純化時(shí)，因菌落溶解狀擴(kuò)大，可能挑取時(shí)不僅挑取到了藍(lán)綠色可疑菌落，還挑取到其他類型可疑菌落，純化后確證就可能導(dǎo)致結(jié)果完全改變的情況，解決辦法是在這種菌落較多的情況下，可以采取計(jì)數(shù)后分開再在CN瓊脂平板上劃線一次，先在CN瓊脂平板上分離中上述幾種菌落的單個(gè)菌落，再劃線接種到營養(yǎng)瓊脂平板上純化后進(jìn)行確證試驗(yàn)，已避免因挑取典型菌落出現(xiàn)差錯(cuò)導(dǎo)致結(jié)果的偏差。

3.確證性試驗(yàn)

這里需特別注意的是上述的第二種情況，即非藍(lán)/綠色產(chǎn)熒光的可疑菌落的產(chǎn)氨實(shí)驗(yàn)：

純培養(yǎng)物接種到乙酰胺液體培養(yǎng)基36℃培養(yǎng)20～24h后，滴加1～2滴鈉氏試劑，檢查產(chǎn)氨實(shí)驗(yàn)，有出現(xiàn)從深黃色到磚紅色的顏色變化，則為陽性，否則為陰性。

在實(shí)際過程中會(huì)發(fā)現(xiàn)確證試驗(yàn)出現(xiàn)這種顏色變化過程的比例很高，是很多都是陽性結(jié)果嗎？

經(jīng)過使用生化試劑條鑒定發(fā)現(xiàn)有近六成的比例并不是銅綠假單胞菌，是什么原因呢，主要是時(shí)間的問題，時(shí)間比較久時(shí)，磚紅色出現(xiàn)的幾率比較高，會(huì)影響檢測人員的判斷，建議在3～5分鐘內(nèi)進(jìn)行觀察，并且一定要與陽性和陰性對照菌株進(jìn)行比較觀察，可有效降低誤判。另外推薦一種簡單的方法：如覺得還有疑問不能判定，可以從純培養(yǎng)物接種劃線到固體乙酰胺培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，銅綠假單胞菌在固體培養(yǎng)基上的特征是灰白色，扁平，邊緣不整齊，菌落周圍培養(yǎng)基略帶粉紅色，可以結(jié)合固體和液體培養(yǎng)基的生長特征和現(xiàn)象進(jìn)行判定，誤判基本可以消除，此方法成本很低，一般的生產(chǎn)企業(yè)可以使用。

銅綠假單胞菌的污染主要來自三個(gè)方面，一是水源的污染，二是加工過程的污染，三是包裝材料的污染，作為生產(chǎn)企業(yè)，需要通過提高自身的檢測能力，分別監(jiān)測這三個(gè)方面的污染情況，采取有效的消毒滅菌方式，并驗(yàn)證滅菌效果，可確保生產(chǎn)的產(chǎn)品質(zhì)量安全有保障。endprint