多發(fā)性骨髓瘤本周氏蛋白檢測及其臨床意義

黃國賢，顏綿生

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一種起源于B細(xì)胞的漿細(xì)胞異常增生的惡性腫瘤，發(fā)病年齡大多在50～60歲之間，40歲以下較少見，男女之比為3：2[1]。而目前隨著人口老齡化以及檢測技術(shù)不斷提高，MM的發(fā)病率不斷增加，盡管不斷有新的藥物及治療方法應(yīng)用于MM的治療中，但到目前為止MM仍被認(rèn)為是不可治愈的[2]。

MM是由于單一株漿細(xì)胞異常增值，因而產(chǎn)生大量理化性質(zhì)十分均一的免疫球蛋白，此蛋白稱為單克隆蛋白 （monoclonal protein，M蛋白），M蛋白大多無免疫活性，所以又稱副蛋白。M蛋白可以是免疫球蛋白的任何一類，也可以是κ或λ輕鏈中的任何一型。根據(jù)M蛋白的成分可將MM分為不同的類型，其中IgG型約占50%，IgA型約占25%，IgM型約占1%，IgE型和IgD型罕見，輕鏈型約占 20%[3，4]。

本周氏蛋白（Bence-Jones protein，BJP）即是游離免疫球蛋白輕鏈，分為 κ(Kappa)、λ(Lambda)2個(gè)型別。正常個(gè)體每天產(chǎn)生約500mg輕鏈，合成的輕鏈除了跟重鏈形成完整的Ig分子外，將近40%的輕鏈?zhǔn)怯坞x的[5]，因此可以通過游離輕鏈(free light chain，F(xiàn)LC)的檢測方法檢測到。但是，常規(guī)的血清蛋白電泳技術(shù)（serum protein electrophoresis，SPE），甚至免疫固定電泳技術(shù) （immunofixation electrophoresis，IFE）由于檢出低限閾值較高，采用上述檢測方法一般無法檢出正常人血清FLC[6]。由于B細(xì)胞發(fā)育過程中κ輕鏈基因重排具有優(yōu)先性，所以正常人體內(nèi)攜帶κ輕鏈免疫球蛋白的成熟B細(xì)胞多于攜帶λ輕鏈免疫球蛋白的成熟B細(xì)胞，此外，游離λ鏈較κ鏈更易通過二硫鍵形成二聚體，而后者則通常保持單體狀態(tài)，且κ濾過速率比λ二聚體快將近3倍。雖然κ型輕鏈總量約為λ型輕鏈的2倍，但是最終導(dǎo)致血清中游離型κ/λ的比例低于 2[7]。

目前輔助MM診斷的檢測技術(shù)有熱沉淀法、血清蛋白電泳 （serum protein electrophoresis，SPE）技術(shù)和免疫固定電泳（immunofixation electrophoresis，IFE）技術(shù)。SPE的基本原理是蛋白質(zhì)在給定的pH條件下主要根據(jù)其所帶電荷數(shù)不同將其分離，形成 5 個(gè)不同遷移率區(qū)帶（Alb、α1、α2、β、γ），具有一定的敏感性和特異性，因此成為臨床上初步篩查M蛋白的首選技術(shù)。然而，SPE是一種半定量技術(shù)，其最低檢測M蛋白的濃度是0.13g/L，當(dāng)M蛋白不出現(xiàn)r區(qū)時(shí)，易被其它蛋白掩蓋。IFE的基本原理是血清區(qū)帶電泳與免疫沉淀反應(yīng)結(jié)合的一項(xiàng)定性實(shí)驗(yàn)，血清先行區(qū)帶電泳后，分別在電泳條帶加上不同類型的抗體，相應(yīng)的抗原將與抗體在某一區(qū)帶形成抗原抗體復(fù)合物，經(jīng)漂洗和染色可清晰地顯示出抗原抗體反應(yīng)帶。與SPE相比，IFE的敏感性和特異性明顯提高，其M蛋白的最低檢測濃度為100～150mg/L[8]，而且可對(duì)M蛋白進(jìn)行進(jìn)一步的分型，特別是在SPE電泳結(jié)果似是而非時(shí)，該技術(shù)有著明顯的優(yōu)越性。因此，至今IFE在鑒定M蛋白方面仍屬首選的技術(shù)，尤其在鑒定含重鏈或重鏈片斷的M蛋白時(shí)尚無其他技術(shù)可以替代。然而，非分泌型MM、游離輕鏈型MM、淀粉性樣變疾病及經(jīng)過治療后的MM，由于其產(chǎn)生少量的M蛋白，SPE和IFE難以檢測出來。而且，SPE和IFE在臨床使用繁瑣，尤其是IFE，不僅耗時(shí)、費(fèi)力，且對(duì)設(shè)備和人員的要求較高，并且這兩種方法均不是定量的方法，因此在監(jiān)測病情方面無法進(jìn)行量化。

近年來開發(fā)出針對(duì)輕鏈“隱藏區(qū)”表位(輕鏈通過二硫鍵與重鏈結(jié)合的恒定區(qū)表位)的檢測試劑，該試劑作為抗體只與FLC結(jié)合，而不與完整的Ig上的輕鏈結(jié)合，因此敏感性高，特異性強(qiáng)，能檢測正常人 FLC 水平，敏感度達(dá)到 2～4mg/L[8，9]。 與常用的M蛋白檢測方法相比，此方法檢測sFLC除高度敏感性和特異性外，還具有檢測快速、方便、易于自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，是一種定量的檢測方法，其對(duì)MM的早期診斷、鑒別診斷、療效評(píng)估和病情監(jiān)測等具有不可替代的優(yōu)勢(shì)。但是其檢測閾值較低，無法區(qū)分游離輕鏈?zhǔn)欠駷閱慰寺。趨f(xié)助MM診斷上存在一定的假陽性和假陰性，而且其試劑價(jià)格昂貴，因此尚未于臨床診斷廣泛開展[10]。

本研究是收集尿本周氏蛋白電泳陽性的MM患者血清和尿液標(biāo)本，然后采用散射免疫比濁法檢測MM患者的血清和尿液總輕鏈 (游離κ+結(jié)合的κ或游離的λ＋結(jié)合的λ)并計(jì)算κ/λ的比值，還結(jié)合免疫球蛋白定量（IgG、IgA、IgM）、血清蛋白電泳、血清及尿液本周氏蛋白電泳的檢測，探討本周氏蛋白（游離免疫球蛋白輕鏈）檢測在MM診斷中的臨床意義?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例選取 33例標(biāo)本均選自2013年 3月－20016年10月在我院住院尿本周氏蛋白電泳陽性的 MM 患者，年齡 36～79 歲，平均年齡 56±11.4 歲，其中男性17例，女性16例，所有患者均符合文獻(xiàn)MM診斷標(biāo)準(zhǔn)[11]。

對(duì)照標(biāo)本分為兩組，第一組為19例尿蛋白異常(尿白蛋白＞30mg/L)的非MM病人尿標(biāo)本，其中腎病綜合征女性患者3例、男性患者4例，糖尿病腎病女性患者患者2例、男性患者3例，急性淋巴瘤女性患者2例、男性患者2例，SLE女性患者3例，年齡 29～78 歲，平均年齡 50.6±13.1 歲；38 例尿蛋白正常的非MM病人尿標(biāo)本，女性15例，男性23 例，年齡 14～71 歲，平均年齡 49.6±13.6 歲。第二組為43例非MM病人的血清對(duì)照標(biāo)本，女性18例，男性 25 例，年齡 15～85 歲，平均年齡 49.2±19.1歲。兩組對(duì)照標(biāo)本人群的年齡、性別等相關(guān)因素均與 33例 MM 患者相仿，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

1.1.2 標(biāo)本采集 MM患者和對(duì)照組病人于清晨空腹留取靜脈血6ml，促凝管保存，標(biāo)本要求無脂血、溶血，3500rm/min離心5min，吸取上層血清分別移至1個(gè)1.5ml EP管，－70℃冰箱放置備用，同時(shí)期留取患者尿液標(biāo)本 （晨尿），然后移至1個(gè)1.5ml EP管，－70℃冰箱放置備用。

1.1.3 主要儀器及試劑 采用法國 Sebia公司的Hydrasys全自動(dòng)電泳儀，及其配套試劑包括瓊脂糖凝膠，樣本稀釋液緩沖液，抗IgG、IgA、IgM抗體，抗IgGAM混合抗體，抗 κ、λ抗體、抗游離 κ、游離 λ抗體，酸紫液，試劑批號(hào)15048101；美國德靈公司的BN II和BN Prospec全自動(dòng)特定蛋白分析儀及其配套試劑盒，試劑批號(hào)為12258B。

1.2 方法

1.2.1 血清蛋白電泳 取患者血清10μl按要求點(diǎn)于Sebia配套加樣梳上，經(jīng)瓊脂凝糖膠電泳后，烘干、染色、再褪色、烘干。然后通過光密度掃描，觀察M蛋白成分的含量。

1.2.2 血清免疫固定電泳 取患者血清 （加在抗IgG條帶的血清標(biāo)本進(jìn)行6倍稀釋）10μl按要求點(diǎn)于Sebia配套加樣梳上，經(jīng)瓊脂凝糖膠電泳后，在每份標(biāo)本的6條區(qū)帶依次加固定液40μl，抗IgG、IgA、IgM，抗 κ、抗 λ 試劑各 25μl，孵育 5min 以固定并沉淀蛋白。烘干、染色、再褪色、烘干，完畢后觀察結(jié)果。

1.2.3 血清和尿液本周氏蛋白電泳 患者血清用(尿液不用稀釋)稀釋液進(jìn)行4倍稀釋后，取10μl稀釋血清按要求點(diǎn)于Sebia配套加樣梳上，經(jīng)瓊脂凝糖膠電泳后，在每份標(biāo)本的6條區(qū)帶依次加固定液 40μl，抗 IgGAM，抗 κ、抗 λ、抗游離 κ、抗游離λ 試劑各 25μl，孵育 5min（尿液 10min）以固定并沉淀蛋白。烘干、染色、再褪色、烘干。完畢后觀察結(jié)果，如果抗IgGAM陰性，抗κ或抗λ區(qū)帶陽性，且在同一位置抗游離κ或抗游離λ區(qū)帶陽性，則判斷本周氏蛋白電泳陽性。

1.2.4 血清總輕鏈（κ、λ）的測定 血清輕鏈測定應(yīng)用散射免疫比濁法，其抗體是通過高純度人免疫球蛋白κ、λ輕鏈在兔子身上免疫反應(yīng)而制備的，結(jié)合于輕鏈的非結(jié)合區(qū)，所測定數(shù)值包括了游離輕鏈值及與重鏈相結(jié)合的輕鏈數(shù)值，為總血清輕鏈數(shù)值。具體要求按BN-II全自動(dòng)特定蛋白分析儀說明操作。

1.2.5 血清免疫球蛋白定量測定 血清免疫球蛋白（IgG、IgA、IgM）的測定應(yīng)用散射免疫比濁法，采用的抗體是通過高純度人免疫球蛋白IgG、IgA、IgM在兔子身上免疫反應(yīng)而制備。具體要求按BN-II全自動(dòng)特定蛋白分析儀相關(guān)要求操作。

1.2.6 尿微量免疫球蛋白定量測定 尿微量免疫球蛋白（κ、λ、IgG、白蛋白）的測定應(yīng)用散射免疫比濁法，其采用的抗體與血免疫球蛋白測定是一致的。具體要求按BN-Prospec全自動(dòng)特定蛋白分析儀相關(guān)要求操作

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所得的數(shù)據(jù)資料采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行Mann-Whitney U檢驗(yàn)，P<0.01表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2 結(jié)果

2.1 33例MM患者的電泳結(jié)果

2.1.1 血清蛋白電泳的結(jié)果 血清蛋白電泳見圖1，對(duì)M蛋白的判斷通過二人檢驗(yàn)結(jié)果確定，陽性率為79%。4例輕鏈型MM患者（見圖1的6、16、23、28區(qū)帶）、2例 IgA 型 （見圖 1的 2、32區(qū)帶）、1例IgG（見圖1的21區(qū)帶）的電泳區(qū)帶上看不到明顯的M蛋白帶。電泳區(qū)帶1、5、27是IgA-λ型，4、9、25 是 IgA-κ 型；電泳區(qū)帶 3、7、12、15、17、18、22是 IgG-λ 型 ，8、10、11、13、14、19、24、26、29、30、31、33是 IgG-κ 型。

圖1 33例MM患者血清蛋白電泳圖譜

2.1.2 免疫固定電泳結(jié)果 33例MM患者血清蛋白電泳、血清免疫固定電泳、血清本周氏蛋白電泳、尿本周氏蛋白電泳結(jié)果見表1。血清免疫固定電泳對(duì)輕鏈型的MM結(jié)果難以判段，只能懷疑可能出現(xiàn)游離的輕鏈或者應(yīng)用IgE型和IgD的抗體進(jìn)一步應(yīng)用免疫固定電泳確診，由于該兩型罕見，目前成本昂貴。而進(jìn)行血本周氏蛋白電泳結(jié)果陽性率雖然只有30%，但4例輕鏈型的MM陽性率為100%，由于血清樣本相對(duì)干擾比尿液小，其配合血清免疫固定電泳可明顯有助于對(duì)常見MM病人進(jìn)行確診。

表1 33例MM患者四種電泳結(jié)果數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2.2 尿蛋白定量結(jié)果 33例MM患者、19例尿蛋白異常的非MM病人（腎病病人）和38例尿蛋白正常的非MM病人的尿白蛋白、尿IgG、尿κ、尿λ的濃度、尿κ/λ的比值結(jié)果見表2和圖2。與尿蛋白異常的非MM病人及尿蛋白正常的非MM病人相比較，MM病人的偏離明顯，P<0.01。與尿蛋白正常的非MM病人相比較，偏離更明顯，P<0.01。但是，尿蛋白異常的非MM病人κ/λ的比值與尿蛋白正常的相比較無明顯差異，P=0.215，不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 血清免疫球蛋白定量結(jié)果 33例MM患者的血 κ、血 λ 的濃度(見表 3、圖 7、8），血 κ/λ 的比值(見圖9）與43例非MM患者相比較見，偏離非常明顯，P<0.01，具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（見表3）。

3 討論

MM系骨髓中惡性漿細(xì)胞過度增殖，導(dǎo)致血清或尿液中出現(xiàn)單克隆性免疫球蛋白或其輕鏈、重鏈的一種疾病。正常人血清中，免疫球蛋白分子是由多克隆性質(zhì)的漿細(xì)胞按一定比例合成的，因此血清中Ig及κ、λ輕鏈保持在一定范圍內(nèi)。在MM發(fā)生后，Ig合成受影響，異常增生的腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生了大量的單克隆Ig及其片斷。因此測定血清及尿中的單克隆免疫球蛋白在MM的診斷及療效評(píng)估中具有重要的指導(dǎo)意義。

圖2 33例MM患者、19例尿蛋白異常的非MM病人（腎病病人）和38例尿蛋白正常的非MM病人的尿白蛋白、尿IgG、尿κ、尿λ的濃度、尿κ/λ的比值結(jié)果分布

圖3 血清κ輕鏈、λ輕鏈及κ/λ比值結(jié)果分布

本研究中，尿本周氏蛋白電泳陽性的33例MM患者，其SPE結(jié)果顯示9%的病例M蛋白呈單株峰，其中4例輕鏈型MM在γ區(qū)看不到M蛋白區(qū)帶，2例IgA和1例IgG在γ區(qū)可見彌散的M蛋白區(qū)帶，但這7例MM患者的血清免疫固定電泳結(jié)果（除1例κ輕鏈和1例λ輕鏈外）均可看到濃集、窄細(xì)、深染的M帶。33例MM患者血本周氏蛋白電泳陽性率僅有30%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于SPE和IFE，但血本周氏蛋白電泳也有它自身的優(yōu)勢(shì)，本周氏蛋白電泳每份標(biāo)本共有 6 條泳道：ELP、GAM、κ、λ、游離κ、游離λ，ELP泳道相當(dāng)于血清蛋白電泳，在結(jié)果判斷中起對(duì)照作用，GAM泳道加入抗IgG、IgA、IgM 3種免疫球蛋白重鏈的混合抗血清，該泳道出現(xiàn)克隆帶即提示3種免疫球蛋白的其中1種呈克隆增生。κ和λ泳道加入抗結(jié)合型和游離型輕鏈的混合抗血清，標(biāo)本中只要有克隆性的輕鏈(與重鏈結(jié)合或游離于血中)存在，該泳道即出現(xiàn)克隆條帶。游離κ和游離λ泳道加入抗游離輕鏈抗血清，該泳道出現(xiàn)克隆條帶則提示標(biāo)本中有單克隆游離輕鏈存在。因而4例輕鏈型MM在游離κ或游離λ泳道上可看到明顯M帶。在M蛋白篩查方面，由于單克隆免疫球蛋白的類型不同，其分子大小亦不同，因此在電場泳動(dòng)的速率不同，導(dǎo)致單克隆成份可出現(xiàn)在 γ 區(qū) (IgG、IgM 型)、α1、α2或 β 區(qū)（IgA型、輕鏈型），當(dāng)單克隆成分不出現(xiàn)在γ區(qū)或其他腎病引起α2或β區(qū)升高時(shí)，SPE則有較大缺陷不能明確單克隆成份的有無，對(duì)于這種情況需要IFE進(jìn)行鑒別，IFE仍然是檢測M蛋白的金標(biāo)準(zhǔn)[12-14]。血本周氏蛋白電泳是在免疫固定電泳的基礎(chǔ)上利用了抗游離κ和抗游離λ抗體檢測血清中的游離輕鏈，因此，IFE結(jié)合血清本周氏蛋白電泳可進(jìn)一步提高M(jìn)M分型的陽性率。

表2 33例MM患者分別與19例尿蛋白異常的非MM病人、38例尿蛋白正常的非MM病人相比較（M±SD）

表3 33例MM患者與43例非MM患者血本周氏蛋白相比較（M±SD）

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道， 尿液中 κ/λ 在 0.75～3之間可排除單克隆輕鏈增多，當(dāng) κ/λ＜0.5 或 κ/λ＞5 時(shí)可以肯定尿中單克隆輕鏈增多，因此測定κ與λ的濃度并計(jì)算κ/λ的比值在MM的診斷上有重大意義[15-18]。本研究中33例MM患者尿液中κ或λ的濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對(duì)照組，及κ/λ的比值也遠(yuǎn)遠(yuǎn)偏離0.75～3范圍。對(duì)照組中，尿蛋白異常的非MM病人κ/λ的比值與尿蛋白正常的非MM病人相比較是沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的，也就說尿蛋白異常的病人包括腎病病人、結(jié)締組織病病人、淋巴瘤病人等，尿液中κ與λ的濃度會(huì)增高，但一般不會(huì)超過100mg/L，而且是按一定比例增高的，其比率維持正常。尿本周氏蛋白電泳作為MM的篩查手段，其結(jié)果的判斷存在許多不確定的因素，在一定程度上影響MM診斷的準(zhǔn)確率。然而利用散射免疫比濁法對(duì)尿液中的κ和λ定量并計(jì)算κ/λ比值，對(duì)提高臨床MM診斷效率有很大的幫助。

外國有研究表明， 血清 κ/λ 比值采用 0.3～2.0的參考范圍可早期發(fā)現(xiàn)低產(chǎn)量M蛋白的MM，還可進(jìn)行療效判斷，預(yù)后監(jiān)測等[9，19]。33例MM患者血清中κ或λ明顯升高，κ/λ的比值遠(yuǎn)遠(yuǎn)偏離正常對(duì)照值，具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。血清中κ與λ的量反應(yīng)的就是腫瘤的負(fù)荷關(guān)系，因此測定血清中κ與λ的濃度及κ/λ的比值可以很好地評(píng)價(jià)MM患者的體液免疫狀態(tài)。