外周血幼稚淋巴細(xì)胞、染色體、E2A/PBX1、TEL/AML1、MLL融合基因聯(lián)合檢測用于兒童淋巴細(xì)胞白血病的早期診斷

趙理平，周傳恩，崔娓，李科成，蘇文

據(jù)報道，目前兒童急性淋巴細(xì)胞白血病(cALL)發(fā)病率有上升趨勢，嚴(yán)重威脅兒童生命健康[1，2]。一直以來，實(shí)行骨髓穿刺術(shù)抽取骨髓，檢查其細(xì)胞形態(tài)是白血病早期診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，可這種取材方法創(chuàng)傷性大，對兒童尤其是低齡兒來說極其痛苦及不便。外周血細(xì)胞是由骨髓原始干細(xì)胞發(fā)育、分化而來，無論白血病的何種階段，理論上外周血都有相應(yīng)的改變。抽取外周血相比骨髓穿刺創(chuàng)傷性小，能很大程度減輕患兒痛苦。白血病作為一種造血細(xì)胞克隆性疾病，細(xì)胞遺傳學(xué)改變在其發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用[3]，近年來，隨著細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，染色體核型分析和融合基因檢測在白血病的診斷中逐漸占據(jù)重要位置，其不僅從分子水平上進(jìn)一步闡明白血病發(fā)病機(jī)制，還用于白血病的分子生物學(xué)分型，本文通過抽血這種無創(chuàng)式取材，聯(lián)合檢測外周血幼稚淋巴細(xì)胞、染色體、融合基因，以探討其對兒童淋巴細(xì)胞白血病早期診斷或提示性診斷的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象 我院2012年8月至2017年6月門診及住院兒童外周血涂片初查異常淋巴細(xì)胞的病例220例，年齡3月～12歲，其中男128例，女92 例，男：女=1.4：1。

1.2 試劑和儀器 外周血幼稚淋巴細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查所用瑞氏染料及染色體制備所用吉姆薩染料由廣州達(dá)暉生物技術(shù)有限公司提供；染色體培養(yǎng)基由廣州白云山拜迪生物醫(yī)藥有限公司提供；Imager Z2型號蔡司全自動染色體核型分析儀掃片；Vysis探針試劑盒；熒光顯微鏡。

1.3 方法

1.3.1 外周血涂片 常規(guī)消毒行外周血采集后制成血涂片，干燥固定，瑞氏染色，OLYMPUSCH2顯微鏡油鏡下觀察異常淋巴細(xì)胞并進(jìn)行分類計(jì)數(shù)。

1.3.2 染色體制備 對外周血細(xì)胞形態(tài)檢查高度懷疑急性淋巴細(xì)胞白血病患者抽取靜脈血進(jìn)行染色體培養(yǎng)、制備、G顯帶，核型報告參照《人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制ISCN2013》進(jìn)行描述。

1.3.3 融合基因檢測 對外周血細(xì)胞形態(tài)檢查高度懷疑急性淋巴細(xì)胞白血病患者抽取靜脈血FISH技術(shù)檢測融合基因。

2 結(jié)果

220例患者中，33例外周血異常淋巴細(xì)胞陰性，187例陽性，在陽性患者中有24例外周血涂片可觀察到一種“特殊類型”的異常幼稚淋巴細(xì)胞，這種細(xì)胞異型性更明顯，外形明顯不規(guī)則，細(xì)胞核粗顆粒狀，暫稱為“白血病型”幼稚淋巴細(xì)胞（圖1），在外周血細(xì)胞中占比范圍在1%～38%，其中比例范圍在1%～10%有3例，比例范圍在11%～20%有11例，比例范圍在21%～38%的有10例，這24例患者后經(jīng)骨髓檢查驗(yàn)證，除比例范圍在1%～10%中的2例外，其余22例均診斷為急性淋巴細(xì)胞白血病。對比例在11%～20%的11例患者及比例在21%～38%的10例患者均抽取靜脈血檢查染色體、融合基因(因比例高易于染色體、融合基因陽性的檢出)，結(jié)果比例在11%～20%的11例患者染色體均未見異常，未檢出融合基因9例，檢出融合基因2 例，其中 1例 TEL/AML1 陽性（男性）（圖 2），1 例E2A/PBX1(即 PBX1/TCF3)陽性（男性）（圖 3）。 比例在21%～38%的10例患者中8例染色體未見異常，2例染色體異常（均為結(jié)構(gòu)異常，男性），其中1例為 46，XY，t(1；19)(q23；p13)(圖 4)，1 例為 46，XY，t(4；11)(q21；q23)(圖 5），未檢出融合基因 4 例，檢出融合基因6例，其中4例TEL/AML1陽性（男性2例， 女性2例），1例E2A/PBX1陽性 （男性），1例MLL陽性（男性）（圖6），圖中白色箭頭所示為陽性信號。結(jié)果見表1。

圖1 “白血病型”幼稚淋巴細(xì)胞 (瑞氏染色，×1000)

圖2 FISH檢測TEL/AML1陽性

圖3 FISH檢測E2A/PBX1陽性

圖4 G顯帶染色體核型 t(1；19)(q23；p13)

圖5 G顯帶染色體核型 t(4；11)(q21；q23)

圖6 FISH檢測MLL陽性

3 討論

外周血出現(xiàn)異常淋巴細(xì)胞增多一部分是由于病毒感染等因素刺激淋巴細(xì)胞增生亢進(jìn)，使之發(fā)生不平衡而導(dǎo)致的一種機(jī)體反應(yīng)，一部分卻是惡性腫瘤細(xì)胞對骨髓及外周血的浸潤，是惡性腫瘤的早期提示。本文24例患者外周血涂片觀察到的“特殊類型”的異常幼稚淋巴細(xì)胞增多就是惡性腫瘤的早期提示，這種細(xì)胞(暫稱為“白血病型”幼稚淋巴細(xì)胞)具有共同特點(diǎn)：異型性更明顯，外形明顯不規(guī)則，細(xì)胞核粗顆粒狀，可見核溝等，本文研究中這種細(xì)胞在外周血細(xì)胞中占比范圍在1%～38%。這24例患者后經(jīng)骨髓檢查驗(yàn)證有22例均確診為急性淋巴細(xì)胞白血病，說明外周血幼稚淋巴細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查對兒童淋巴細(xì)胞白血病具有一定的早期診斷及提示性診斷作用。

表1 220例患者外周血涂片結(jié)果及21例染色體、融合基因檢查結(jié)果

染色體畸變與白血病發(fā)病密切相關(guān)[4]。染色體畸變導(dǎo)致原癌基因或抑癌基因結(jié)構(gòu)變異，原癌基因激活或抑癌基因失活，產(chǎn)生新的融合基因，編碼融合蛋白。迄今報道涉及50多種特異的染色體易位形成的融合基因[4]。兒童急性淋巴細(xì)胞白血病(cALL)中，染色體畸變檢出率最高的核型是t(12；21)(p13；q22)；t(1；19)(q23；p13)；t(9；22)(q34；q11)；t(4；11)(q21；q23)等。 文獻(xiàn)[5-10]報道兒童 ALL 中最常見的融合基因包括t(12；21)易位形成的TEL/AML1融合基因，t(1；19)易位形成的E2A/PBX1融合基因，t(9；22)易位形成的BCR/ABL融合基因以及t(4；11)易位形成的AF4/MLL融合基因，而這4種融合基因中TEL/AML1是小兒ALL最常見的基因改變[11]，本文21例檢查融合基因E2A/PBX1、TEL/AML1、MLL，有 5例 TEL/AML1陽性，僅有 2例E2A/PBX1陽性，1例MLL陽性，說明TEL/AML1較其他融合基因常見，與之相符。TEL/AML1基因融合是由t(12；21)(p13；q22)易位使12號染色體上的TEL基因的螺旋2環(huán)2螺旋結(jié)構(gòu)域融合到21號染色體上的AML1基因的DNA結(jié)合域和轉(zhuǎn)錄活化域而形成的，常伴有其他TEL基因的缺失[12]。二者融合之后，AML1由轉(zhuǎn)錄活化因子轉(zhuǎn)變?yōu)橐种埔蜃邮前籽“l(fā)病的分子基礎(chǔ)。由于t(12；21)易位片段G顯帶十分相似，通常不引起染色體的形態(tài)改變，常規(guī)核型分析對其的檢出率不足0.05%[13]。本文5例TEL/AML1陽性患者染色體核型未檢出異常，檢出率低，與報道相符。而FISH技術(shù)彌補(bǔ)了這一不足。染色體R顯帶與常規(guī)G顯帶相反，可使G顯帶不易檢出的易位片段易于檢出，建議染色體核型分析常規(guī)G顯帶的同時加做R顯帶可提高染色體畸變的檢出率。

兒童ALL中有不足10%的患兒存在t(1；19)(q23；p13)，該易位形成 E2A/PBX1 融合基因[14]，PBX1蛋白參與細(xì)胞的分化調(diào)控，融合蛋白使正常PBX1蛋白失活，是導(dǎo)致ALL發(fā)病的主要因素[15]。本文21例患者中有1例染色體核型為46，XY，t(1；19)(q23；p13)，占 4.8%，融合基因 E2A/PBX1 陽性2例，占9.5%，均不足10%，與報道相符。2例E2A/PBX1陽性患者中1例染色體核型為46，XY，t(1；19)(q23；p13)，其外周血異常淋巴細(xì)胞比例在21%～38%，而另1例染色體核型正常，其外周血異常淋巴細(xì)胞比例在11%～20%，可見染色體核型陽性檢出率可能與異常淋巴細(xì)胞比例有關(guān)。染色體核型分析技術(shù)有較多的影響因素，如培養(yǎng)成功率低、敏感性低等，F(xiàn)ISH技術(shù)可直接檢測間期細(xì)胞.不需要細(xì)胞培養(yǎng)，能分辨較小的染色體易位或缺失區(qū)域(相對分子質(zhì)量50×103左右)，因此可以彌補(bǔ)染色體核型分析的不足[16]。

MLL基因位于11q23，白血病時MLL基因會發(fā)生重排[17]。MLL基因重排包括缺失、重復(fù)、插入及易位。重排的MLL基因丟失了SET和PHD結(jié)構(gòu)域而不能發(fā)揮其原有正常功能，即對造血祖細(xì)胞的細(xì)胞周期及分化的負(fù)調(diào)控作用，這是MLL基因重排導(dǎo)致白血病的發(fā)病機(jī)制之一。兒童急性白血病約有5%～10%可檢測到MLL基因改變[4]。本文21例患者中有 1例染色體核型為 46，XY，t(4；11)(q21；q23)，其融合基因 MLL 陽性，檢出率 4.8%，與文獻(xiàn)報道相近。此例患者染色體核型與融合基因檢測結(jié)果相互驗(yàn)證及吻合，其外周血“白血病型”幼稚淋巴細(xì)胞比例在21%～38%，可見聯(lián)合檢測外周血幼稚淋巴細(xì)胞、染色體、融合基因，對兒童淋巴細(xì)胞白血病起到了早期診斷的作用。目前本文研究的例數(shù)有限，還有待后期進(jìn)一步積累數(shù)據(jù)，加強(qiáng)研究。

綜上所述，外周血幼稚淋巴細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查對兒童淋巴細(xì)胞白血病具有一定的早期診斷及提示性診斷作用。而染色體核型分析與融合基因檢測技術(shù)從分子水平上進(jìn)一步闡明白血病發(fā)病機(jī)制，用于白血病的診斷分型，此兩種技術(shù)之間又可相互驗(yàn)證及補(bǔ)充。聯(lián)合檢測外周血幼稚淋巴細(xì)胞、染色體、E2A/PBX1、TEL/AML1、MLL 融合基因可用于兒童淋巴細(xì)胞白血病的早期診斷及提示性診斷，與經(jīng)典有創(chuàng)的骨髓檢查相比，這種無創(chuàng)的檢查模式值得臨床推廣借鑒。