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    一種新的沙丁胺醇人工抗原的合成及單克隆抗體的制備

    2014-09-10 15:45:10陳觀銀黃顯會劉曉云鄧發(fā)亮李帥鵬孔祥凱懷彬彬
    關(guān)鍵詞:半抗原沙丁胺醇單克隆

    陳觀銀,黃顯會,劉曉云,鄧發(fā)亮,李帥鵬,孔祥凱,懷彬彬

    (1華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,廣東廣州 510642;2廣州萬孚生物技術(shù)股份有限公司,廣東廣州 510642)

    一種新的沙丁胺醇人工抗原的合成及單克隆抗體的制備

    陳觀銀1,黃顯會1,劉曉云2,鄧發(fā)亮2,李帥鵬1,孔祥凱1,懷彬彬1

    (1華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,廣東廣州 510642;2廣州萬孚生物技術(shù)股份有限公司,廣東廣州 510642)

    【目的】為證明采用4-溴丁酸乙酯半抗原合成人工抗原可制備靈敏度高、特異性好的單克隆抗體.【方法】將硫酸沙丁胺醇(SAL)與4-溴丁酸乙酯反應(yīng)制備半抗原(SAL-HS);通過N-羥基琥珀酰亞胺活化酯法合成免疫原與包被原,用聚丙烯酰胺凝膠電泳、紫外光譜和質(zhì)譜方法對沙丁胺醇免疫原及包被原進行鑒定.免疫原免疫Balb/c小鼠,采用融合技術(shù)產(chǎn)生雜交瘤細胞株,體內(nèi)誘生腹水法制備單克隆抗體,并鑒定其免疫學(xué)特性.【結(jié)果和結(jié)論】篩選出1株雜交瘤細胞株,其細胞培養(yǎng)上清液效價達1∶128 000,腹水效價達1∶2 560 000,免疫球蛋白亞型鑒定為IGg 1;抗體對沙丁胺醇的半數(shù)抑制濃度(IC50)為:0.746 ng/mL;與其他同類結(jié)構(gòu)藥物的交叉反應(yīng)率均小于0.015%.

    沙丁胺醇;單克隆抗體;膠體金;間接競爭ELISA

    沙丁胺醇(Salbutamol,SAL),又名舒喘寧、索布胺、阿布叔醇、羥甲異丁腎上腺素、羥甲叔丁腎上腺素等,化學(xué)名1-(4-羥基-3-羥甲基苯基)-2-(叔丁氨基)乙醇[1],是一種人工合成的β2腎上腺素受體激動劑(β2-激動劑)[2],其中有活性作用的是R型沙丁胺醇,臨床常用其硫酸鹽形式治療支氣管哮喘[3].此外,沙丁胺醇還具有一定的營養(yǎng)重分配作用[4-5],攝入量過大時對心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)會產(chǎn)生明顯的刺激作用,引起肌肉顫抖、心悸、心慌、頭疼、目眩,嚴重者惡心、嘔吐等.由于沙丁胺醇對動物具有促進骨骼肌生長,減少脂肪蓄積作用,因而被國內(nèi)外不少養(yǎng)殖場非法用作飼料添加劑,其殘留嚴重危害著人們的身體健康和生命安全.為防止沙丁胺醇超標的畜產(chǎn)品進入市場,必須建立一種簡便、快速、靈敏、準確的檢測方法,對沙丁胺醇殘留進行有效的監(jiān)測.目前,沙丁胺醇的殘留檢測主要依靠理化檢驗方法,如氣相色譜(GC)、高效液相色譜(HPLC)[6-7]、氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)[8-9]、液質(zhì)聯(lián)用(HPLC-MS)等[10],盡管這些方法有很高的靈敏度和準確性,但存在需要昂貴的儀器、樣品前處理復(fù)雜、繁瑣費時、不能現(xiàn)場操作等缺陷,限制了理化檢驗方法的應(yīng)用[11].免疫學(xué)分析方法由于具有靈敏、快速、特異、簡便等優(yōu)點,近年來國內(nèi)外在獸藥、農(nóng)藥殘留檢測領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[12-16].本研究采用溴丁酸乙酯法合成沙丁胺醇免疫原,制備沙丁胺醇單克隆抗體,應(yīng)用于膠體金平臺,旨在為沙丁胺醇殘留免疫學(xué)檢測方法的建立奠定基礎(chǔ).

    1 材料與方法

    1.1 試劑

    硫酸沙丁胺醇(江蘇金壇)(結(jié)構(gòu)見圖1);4-溴丁酸乙酯(Sigma公司);牛血清白蛋白(BSA)、雞卵清白蛋白(OVA)(上海金穗生物科技有限公司); 1-乙基3-(3-二甲胺丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基琥珀酸亞胺(NHS)(阿拉丁試劑公司);PEG1500、弗氏完全佐劑、弗式不完全佐劑(Sigma公司);SP2/0細胞(廣州萬福生物技術(shù)公司); HAT、HT、RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Gibico公司);其他試劑市售所得,均為AR級.

    圖1 沙丁胺醇化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 The chemical structure of salbutamol

    1.2 主要儀器

    U3000紫外掃描儀(UV)(日本島津公司);洗板機、酶聯(lián)免疫檢測儀、離心機(Thermo Scientific);磁力攪拌器(鞏義市予華儀器);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器);TC-2323CO2培養(yǎng)箱(SHELDON公司).

    1.3 人工半抗原合成

    硫酸沙丁胺醇500 mg(2.1 mmol)、碳酸鉀718 mg(5.23 mmol)、4-正丁基碘化胺50 mg(0.135 mmol)、二甲基甲酰胺(DMF)5 mL、4-溴丁酸乙酯497 mg(密度為1.363 g/mL),按上述順序依次加入開始反應(yīng),TLC板跟蹤反應(yīng)情況,大約反應(yīng)24 h,用水和乙酸乙酯開始萃取,旋轉(zhuǎn)蒸干,稱其質(zhì)量為776 mg,加氫氧化鋰600 mg、水3.6 mL和乙醇3.6 mL開始水解.TLC板跟蹤,反應(yīng)1.5 h后,旋轉(zhuǎn)蒸干乙醇,加入三氯甲烷除去堿性條件下不成鹽的副產(chǎn)物,倒掉,加約1.5 mL水,調(diào)pH為3~5,然后加過量的無水硫酸鈉、甲醇和乙酸乙酯(體積比2∶8)開始萃取,蒸干有機相得目標產(chǎn)物(SAL-HS).反應(yīng)原理見圖2.

    圖2 半抗原合成過程Fig.2 The synthetic procedure for hapten

    1.4 完全抗原的合成

    半抗原(SAL-HS)與牛血清白蛋白、雞卵清白蛋白偶聯(lián)分別合成免疫原和包被原(圖3).

    1.4.1 免疫原合成將100 mg 4-溴丁酸乙酯沙丁胺醇半抗原溶于1 mL DMF中,取200 μL該溶液加入1 mL DMF,再加入15 mg EDC、10 mg NHS,常溫反應(yīng)過夜.將40 mg牛血清白蛋白溶于3 mL PBS (0.05 mol/L pH 7.4)中,將活化好的半抗原逐滴加入到溶于牛血清白蛋白的PBS中,室溫磁力攪拌反應(yīng)4 h,轉(zhuǎn)入透析袋中開始透析(0.01 mol/L pH 7.4 PBS),3 d后,4℃條件下保存?zhèn)溆?

    1.4.2 包被原合成將100 mg 4-溴丁酸乙酯沙丁胺醇半抗原溶于1 mL DMF中,取200 μL該溶液加入1 mL DMF,再加入15 mg EDC、10 mg NHS,常溫反應(yīng)過夜.將100 mg雞卵清白蛋白溶于3 mL PBS (0.05 mol/L pH 7.4)中,將活化好的半抗原逐滴加入到溶于雞卵清白蛋白的PBS中,室溫磁力攪拌反應(yīng)4 h,轉(zhuǎn)入透析袋中開始透析(0.01 mol/L pH 7.4 PBS),3 d后,4℃條件保存?zhèn)溆?

    圖3 完全抗原合成過程Fig.3 The synthetic procedure for complete antigen(R represents hapten)

    1.5 抗原合成鑒定

    1.5.1 完全抗原濃度的測定采用福林酚法測定抗原的濃度[17].

    1.5.2 偶聯(lián)比測定采用三硝基苯磺酸法測定免疫原和包被原偶聯(lián)比[18].

    1.5.3 紫外光譜鑒定將抗原用水稀釋到0.2 mg/mL,半抗原用少量DMF溶解,用水配成0.2 mg/mL牛血清白蛋白用水配成0.2 mg/mL,在200~400 nm范圍內(nèi)進行紫外掃描,可以很好地取得結(jié)果.

    1.5.4 SDS-PAGE鑒定配制各種電泳溶液,濃縮膠5%,分離膠12%.考馬斯亮藍染色液染色,用脫色液脫色至條帶清晰.

    1.5.5 半抗原質(zhì)譜鑒定參考毛利莎等[3]質(zhì)譜條件,進行沙丁胺醇半抗原的質(zhì)譜全掃描.

    1.6 沙丁胺醇單克隆抗體的制備

    1.6.1 動物免疫將免疫原SAL-BSA免疫5只Balb/c小鼠,分別標記為1、2、3、4、5,用牛血清白蛋白直接免疫Balb/c小鼠,作為空白對照組(標記為6),首免將等量的抗原與弗氏完全佐劑乳化,腹部皮下注射100 μg/只,第2~第5次免疫,將等量免疫原與弗氏不完全佐劑乳化,皮下注射50 μg/只,融合前3 d加強免疫,皮下注射免疫原50 μg,免疫間隔時間為2周.

    1.6.2 間接ELISA測定血清效價小鼠五免后第7天采血測定其血清抗體效價.方法如下:將SAL-OVA包被原用碳酸緩沖液(pH 9.6)稀釋成1.0 μg/mL,包被96孔板,4℃條件孵育過夜,洗板3次;加入倍比稀釋好的抗體,每孔100 μL,37℃條件孵育1 h,洗板3次;加入羊抗鼠IgG-HRP,每孔100 μL,37℃條件孵育40 min,洗板3次;加入顯色液各50 μL,37℃條件顯色10 min,0.2 mol/L硫酸終止反應(yīng),酶標儀450 nm讀數(shù).以S/N≥2.1所對應(yīng)的最大稀釋倍數(shù)為陽性血清的抗體效價,其中S為陽性血清的D450nm,N為陰性血清的D450nm.

    1.6.3 間接競爭ELISA測定血清IC50根據(jù)1.6.2結(jié)果將D450nm在1.0左右的抗體稀釋倍數(shù)作為最佳工作條件,按1.0 μg/mL包被原包96孔板(100 μL/孔),洗板3次;然后加入沙丁胺醇標準品(1、10、20、40、80 ng/mL)各50 μL,再加入陽性血清50 μL,使最終濃度為最佳工作濃度.37℃競爭反應(yīng)1 h,洗板3次;然后加入羊抗鼠IgG-HRP,每孔100 μL,37℃孵育40 min,洗板3次;再加入顯色液,各50 μL,37℃顯色10 min,0.2 mol/L硫酸終止反應(yīng),酶標儀450 nm讀D450 nm.

    1.6.4 細胞融合按常規(guī)方法融合,將SP2/0細胞與脾細胞以1∶5(質(zhì)量比)比例混合,然后,將細胞混勻加入甲基纖維素半固體培養(yǎng)基中培養(yǎng).培養(yǎng)步驟:將離心好的融合細胞,去除上清液,加入4 mL血清,并將細胞吹勻;然后再加入6 mL血清、4 mL飼養(yǎng)細胞及0.8~1.0 mL的HAT(50×);向離心管中加入25 mL滅菌半固體培養(yǎng)基,定容至40 mL,并將其充分混勻,30 min后將融合好的細胞倒入小皿中,再將小皿放入濕盒中,最后放入37℃、體積分數(shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).1.6.5陽性細胞克隆檢測細胞培養(yǎng)上清抗體效價,選擇強陽性細胞進行克隆,取50個細胞鋪半塊96孔板,亞克隆后第4~5天數(shù)板,挑選單克隆或克隆數(shù)少的孔換液,第7~10天后(細胞占視野的25%以上)即可ic-ELISA檢測,直至100%陽性.得到穩(wěn)定分泌高特異性、高效價、高親和力抗體的雜交瘤細胞株,保存于液氮中.

    1.6.6 單克隆抗體的制備及其效價和亞型檢測將克隆及擴大培養(yǎng)的雜交瘤細胞注入提前致敏的Balb/c小鼠腹腔,誘生腹水產(chǎn)生抗沙丁胺醇單克隆抗體.收集5 mL腹水進行抗體的純化[19],采用福林酚法測定抗體濃度;采用間接ELISA測定抗體效價;使用抗體亞型試劑盒(廣州萬孚生物技術(shù)責(zé)任有限公司產(chǎn)品)鑒定抗體亞型.

    1.6.7 抗體靈敏度與特異性測定參照1.6.3,采用間接競爭ELISA法測定單克隆抗體的靈敏度和特異性.根據(jù)IC50判定抗體靈敏度.檢測抗沙丁胺醇單克隆抗體與沙丁胺醇、鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺等的交叉反應(yīng)性,根據(jù)交叉反應(yīng)率(Cross reaction,CR)判定抗沙丁胺醇單克隆抗體的特異性.CR=(沙丁胺醇的IC50/各結(jié)構(gòu)類似物的IC50)×100%.

    2 結(jié)果與分析

    2.1 半抗原質(zhì)譜鑒定

    溴丁酸乙酯半抗原相對分子質(zhì)量為325.12,由圖4可見,H+質(zhì)譜出峰相對分子質(zhì)量為326.3,表明是本試驗所合成的半抗原.

    圖4 半抗原質(zhì)譜圖Fig.4 The mass spectrogram of SAL-HS

    2.2 完全抗原鑒定

    2.2.1 紫外光譜鑒定由圖5可見,沙丁胺醇半抗原(SAL-HS)的最大吸收峰在275 nm,BSA的最大吸收峰在278 nm,沙丁胺醇半抗原和牛血清白蛋白偶聯(lián)后在240~300 nm紫外吸收峰發(fā)生上移,表明偶聯(lián)成功,依據(jù)三硝基苯磺酸法計算出沙丁胺醇半抗原和牛血清白蛋白結(jié)合比為13∶1.

    由圖6可見,沙丁胺醇半抗原(SAL-HS)的最大吸收峰在275 nm,雞卵清白蛋白的最大吸收峰在279 nm,沙丁胺醇半抗原和雞卵清白蛋白偶聯(lián)后在240~300 nm紫外吸收峰發(fā)生上移,表明偶聯(lián)成功,依據(jù)三硝基苯磺酸法推算出沙丁胺醇半抗原和牛血清白蛋白結(jié)合比為3∶1.

    2.2.2 SDS-PAGE鑒定由圖7可見,牛血清白蛋白相對分子質(zhì)量為67 000,而沙丁胺醇半抗原連接牛血清白蛋白后相對分子質(zhì)量加大,遷移速度比牛血清白蛋白慢,由此可見合成完全抗原成功.

    圖5 沙丁胺醇半抗原(SAL-HS)、牛血清白蛋白(BSA)、SAL-BSA的紫外掃描光譜Fig.5 UV absorption spectra of bovine serum albumin(BSA),salbutamol hapten(SAL-HS),and coating antigen (SAL-BSA)

    圖6 沙丁胺醇半抗原(SAL-HS)、雞卵清白蛋白(OVA)、SAL-OVA的紫外掃描光譜Fig.6 UV absorption spectra of ovalbumin(OVA),salbutamol hapten(SAL-HS),and coating antigen(SAL-OVA)

    圖7 載體蛋白和偶聯(lián)物的SDS-PAGEFig.7 SDS-PAGE of carrier proteins and conjugates

    2.3 小鼠融合前血清抗體效價及IC50測定

    五免后第7天的5只小鼠中,2號小鼠效價可達1∶128 000,其IC50為10.56 ng/mL.其他4只小鼠效價均可達1∶64 000,其IC50>10.56 ng/mL.陰性對照鼠的效價可以達1∶2 000,但沒有抑制,所以選擇效價高、特異性好的2號小鼠進行融合.

    2.4 小鼠雜交瘤細胞的建立

    選擇效價最高的2號小鼠進行融合.經(jīng)陽性細胞克隆后,獲得2株雜交瘤細胞,分別測定其IC50,篩選出1株高效價、敏感、特異的雜交瘤.

    2.5 抗體的制備及純化

    將篩選得到的1株雜交瘤細胞注射到成年Balb/c小鼠腹腔,收集腹水,經(jīng)蛋白純化后,獲得蛋白質(zhì)量濃度為2.54 mg/mL.經(jīng)間接ELISA效價檢測,雜交瘤細胞株的細胞培養(yǎng)上清液和腹水抗體效價分別為1∶128 000和1∶2 560 000,經(jīng)抗體亞型鑒定,細胞株所分泌的抗體均為IgG1.

    2.6 抗體靈敏度與特異性測定

    根據(jù)間接競爭ELISA結(jié)果,擬合曲線可得,單克隆抗體的IC50為0.746 ng/mL(圖8),與其他同類結(jié)構(gòu)的交叉反應(yīng)率均小于0.015%(表1).

    圖8 抗沙丁胺醇單克隆抗體標準抑制回歸曲線Fig.8 Inhibitory curve determined by indirect competitive ELISA

    表1 單克隆抗體與沙丁胺醇及其同類結(jié)構(gòu)藥物交叉反應(yīng)率Tab.1 Cross-reactivity monoantibody with other drugs

    3 討論

    沙丁胺醇是小分子,必須與大分子物質(zhì)結(jié)合才具有免疫原性,而整個抗原合成中,半抗原結(jié)構(gòu)設(shè)計尤為重要,直接影響動物的免疫效果,本研究的結(jié)構(gòu)設(shè)計是新穎所在.以硫酸沙丁胺醇為原料,在酚羥基上接溴丁酸乙酯,因為沙丁胺醇相對分子質(zhì)量很小,4-溴丁酸乙酯相對分子質(zhì)量為195.05,增大相對分子質(zhì)量同時,形成的醚鏈不容易水解,穩(wěn)定性好,可以增強免疫原性.由于半抗原特殊結(jié)構(gòu),使得抗體與其他同類結(jié)構(gòu)的交叉反應(yīng)率小于0.015%,文獻報道沙丁胺醇與克倫特羅有很高的交叉反應(yīng)率[20],這種半抗原結(jié)構(gòu)的設(shè)計解決了交叉反應(yīng)的問題,為創(chuàng)新所在.

    免疫原偶聯(lián)比為13∶1,能產(chǎn)生效價高的抗體,偶聯(lián)包被原的半抗原和雞卵清白蛋白質(zhì)量比為1∶50,測得偶聯(lián)比為2.5∶1,包被原偶聯(lián)比越低包被效果越好.

    在免疫小鼠檢測小鼠血清抗體效價和抑制時,要選擇效價高且抑制率高的小鼠進行融合,由于小鼠機體差異性,在免疫時應(yīng)多免疫幾只小鼠.由于融合時使用的是甲基纖維素半固體培養(yǎng)基,挑克隆之后要換全液,然后再檢測效價和抑制,因為甲基纖維素半固體培養(yǎng)基可能會造成假陽性.

    雜交瘤細胞株誘生腹水制備抗體的效價可達1∶2 560 000,其IC50可達到0.746 ng/mL,說明免疫原可以刺激動物機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答,從而制備高特異性的單克隆抗體.

    免疫學(xué)方法具有靈敏度高、過程簡單和分析速度快等優(yōu)點,是監(jiān)測食品安全很好的方法,將沙丁胺醇單克隆抗體應(yīng)用到膠體金平臺,省時、省力、成本低的膠體金試紙條,為沙丁胺醇殘留檢測提供了更加方便快速靈敏的方法,也為免疫學(xué)方法的建立奠定了基礎(chǔ),同時為膠體金試紙條的應(yīng)用優(yōu)化提供基礎(chǔ).

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    【責(zé)任編輯柴焰】

    Synthesis of a newly designed artificial antigen and preparation of a monoclonal antibody against salbutamol

    CHEN Guanyin1,HUANG Xianhui1,LIU Xiaoyun2,DENG Faliang2,LI Shuaipeng1,KONG Xiangkai1,HUAI Binbin1
    (1 College of Veterinary Medicine,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China; 2 Guangzhou Wanfu Biotechnology Co.,Ltd.,Guangzhou 510642,China)

    【Objective】To prove that the artificial antigen which was synthesised by 4-bromine ethyl butyrate was successful,and that the monoclonal antibody had a high sensitivity and specificity.【Method】Salbutamol sulfate was connect with 4-bromine ethyl butyrate,then converted into hapten(SAL-HS).The immunogen SAL-BSA(salbutamol-bovine serum albumin)and coating antigen SAL-OVA(ovalbumin) were synthesized by the N-Hydroxy-succinimide active ester method.The conjugations were identified by SDS-PAGE,UV and mass spectrum.Balb/c mice were immunized by immunogen;splenocytes were fused with SP2/0 myeloma cells;hybridomas cells were produced for a monoclonal antibody by ascitesin vivoto identify immunological characteristics.【Result and conclusion】Cultural supernatants titer of hybridomas cells and ascites were 1∶128 000 and 1∶2 560 000 respectively;the subclasses of monoclonal antibody was IGg 1;the IC50of standard curve was 0.746 ng/mL,with other drugs of similar structure showing cross-reactivity affinities being less than 0.015%.

    salbutamol;monoclonal antibody;immunogen;ic-ELISA

    S859

    A

    1001-411X(2014)01-0023-06

    陳觀銀,黃顯會,劉曉云,等.一種新的沙丁胺醇人工抗原的合成及單克隆抗體的制備[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2014,35(1):23-28.

    2013-02-21優(yōu)先出版時間:2013-11-07

    優(yōu)先出版網(wǎng)址:http:∥www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.S.20131107.1610.016.html

    陳觀銀(1987—),女,碩士研究生,E-mail:344173825@qq.com;通信作者:黃顯會(1969—),男,高級獸醫(yī)師,博士,E-mail:xhhuang@scau.edu.cn

    國家科技支撐計劃(2011BAK10B01-08)

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