傣藥芽三英接骨膏提取工藝研究

劉承清 趙應紅 李曉幸

摘要：目的 優(yōu)選傣藥芽三英接骨膏制劑提取工藝條件。方法 采用高效液相色譜法測定煎煮液中槲皮素的含量，以浸膏得率、槲皮素含量為考察指標，以加水量、煎煮時間、煎煮次數(shù)為考察因素，采用正交試驗對處方中六味需要水提取的傣藥材進行提取工藝條件優(yōu)選。結果 優(yōu)選的提取工藝條件為12倍加水量，煎煮時間為60 min，煎煮2次。結論 優(yōu)選的提取工藝合理可行，為傣藥芽三英接骨膏煎煮的最佳提取工藝。

關鍵詞：傣藥；芽三英接骨膏；浸膏得率；槲皮素；正交試驗

中圖分類號：R931.7 文獻標志碼：A 文章編號：1007-2349（2018）10-0067-03

骨損傷是一種常見多發(fā)??；在臨床上除骨骼損傷外，常伴有紅腫、瘀血、隱隱作痛等癥狀，療程長、痊愈慢。傣藥芽三英接骨膏是根據(jù)云南省西雙版納傣族自治州名老傣醫(yī)巖拉所獻四代家傳外用接骨秘方中篩選研制新的傣藥制劑；也是西雙版納州傣醫(yī)醫(yī)院常用處方，具有促進骨痂生長、瘀斑消褪、活血化瘀、消炎止痛、續(xù)筋接骨的功效，用于治療跌打損傷、骨折、風濕骨痛的傳統(tǒng)制劑[1]。芽三英接骨膏由魚子蘭、血滿草、黑皮跌打、三臺紅花、當歸藤、羽萼葉、毛葉三條筋等藥材組成，臨床使用多年，對皮膚無刺激、無過敏性，并且使用方便、療程短、價廉，其療效和安全性已被證實[2]。原劑型是用傣藥材細粉與開水調和而成的膏劑；不利于儲存，使用時需要用繃帶固定，不方便使用且容易污染。為了增加其穩(wěn)定性，便于儲存，提高有效成分提取率和經(jīng)濟效益，現(xiàn)對該制劑的提取工藝條件進行優(yōu)選。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀（美國安捷倫）；UV-2401紫外-可見分光光度計（日本島津）；TG328A電子分析天平（賽多利斯科學儀器北京有限公司）；KDM型調溫電熱套（山東省鄄城振興儀器廠）；TA-816型光波爐（中山市天倚電器有限公司）；電熱恒溫鼓風干燥機（精宏XMTD-8222）；三用恒溫水浴箱（精宏DK-600S）等。

1.2 試藥 槲皮素對照品（中國食品藥品檢定研究院，供含量測定，HPLC含量測定按99.1%計，批號：100081-201610）；娃哈哈純凈水；甲醇、磷酸為色譜純，鹽酸為分析純；傣藥材魚子蘭（批號：20160513）、血滿草（批號：20170303）、黑皮跌打（批號：20160524）、三臺紅花（批號：20160708）、當歸藤（批號：20160704）、栘樹皮（批號：20161019）毛葉三條筋（批號：20160707）、羽萼葉（批號：20150331）、莪術（批號：150901）由西雙版納州版納藥業(yè)所提供。

2 方法與結果

2.1 藥材吸水性試驗 按處方比例稱取魚子蘭、血滿草、黑皮跌打、三臺紅花、當歸藤等傣藥材共計140 g，稱取3份，分別加水浸泡，待傣藥材浸潤至透心，再稱定潤透后傣藥材重量，計算傣藥材吸水率為128%，吸水率=（潤透傣藥材量-傣藥材量）/傣藥材量[3-4]，試驗安排見表1、表2。

2.2 正交試驗設計 設定提取工藝參數(shù)：加水量（8倍、10倍、12倍），煎煮時間（60 min、90 min、120 min），煎煮次數(shù)（1次、2次、3次）；選擇采用L9（34）正交設計表安排試驗，因素水平安排表詳見表3。

2.3 槲皮素含量測定[5]

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Kromasil C18柱（4.6×250 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.5%磷酸（49：51）；柱溫：35℃；流速：0.8 mL·min-1；檢測波長：370 nm[6]；進樣量：10μL。理論塔板數(shù)按槲皮素峰計算應不低于4000[7]。

2.3.2 對照品溶液的制備 取槲皮素對照品在105℃干燥2 h后精密稱定槲皮素對照品4.4 mg，置100 mL容量瓶內(nèi)，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即為對照品溶液（每1 mL含槲皮素 0.044 mg）。

2.3.3 供試品溶液的制備 按處方比例稱取魚子蘭、血滿草、黑皮跌打、三臺紅花、當歸藤等傣藥材，依法提取，提取液進行濃縮，之后放置于蒸發(fā)皿中水浴蒸干，干燥后冷卻，精密稱取適量干膏粉末置于150 mL圓底燒瓶內(nèi)，精密加入80%甲醇50 mL，稱重，加熱回流1.5 h，放冷，再稱定重量，用80%甲醇補足減失的重量，搖勻，過濾，精密量取續(xù)濾液20 mL，轉移至50 mL容量瓶中，精密加入25%鹽酸溶液7 mL，置85℃水浴中水解30 min，冷卻，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得[5]。

2.3.4 陰性對照品溶液的制備 按處方比例稱取缺血滿草、栘樹皮和三臺紅花的陰性對照藥材（即魚子蘭、當歸藤、黑皮跌打），按“2.3.3”項下供試品溶液的制備方法制備陰性對照品溶液，見圖1。

2.3.4 方法學考察

2.3.4.1 線性關系考察 分別精密量取上述槲皮素對照品溶液1mL，2 mL，4 mL，6 mL，8 mL，10 mL，于10 mL容量瓶內(nèi)，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成系列濃度的溶液，按“2.3.1”項下色譜條件，分別精密吸取各溶液10 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積。以峰面積為縱坐標，槲皮素進樣量為橫坐標，繪制標準曲線，得到線性回歸方程：Y=490 06X-54.918，r=0.9997（n=6），結果表明槲皮素對照品溶液進樣量在4.4～44 μg范疇內(nèi)與峰面積呈良好線性關系[5]。

2.3.4.2 精密度考察 精密吸取“2.3.2”項下制備的槲皮素對照品溶液10μL，按“2.3.1”項下色譜條件測定峰面積，重復進樣6次。根據(jù)峰面積積分值計算RSD為0.08%（n=6），結果表明儀器精密度良好。

2.3.4.3 穩(wěn)定性考察 精密量取“2.3.3”項下制備的供試品溶液10μL，按“2.3.1”項下的方法分別于0、2、4、8、12、24 h進樣，測定峰面積積分值計算RSD值為1.49%，結果表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4.4 重復性考察 取同一方法提取的干燥粉末6份，按“2.3.3”項下方法，分別平行制備6份樣品溶液，精密吸取10 μL，按“2.3.1”項下的方法測定峰面積。根據(jù)峰面積積分值計算供試品中槲皮素的含量，槲皮素含量平均值為1.7163 mg/g，SD值為0.0055，RSD值為0.303%，結果表明供試品溶液制備方法重復性良好。

2.3.4.5 加樣回收率試驗[8] 取已知含量（1.7181 mg/g）的樣品6份，每份0.3 g，精密稱定；精密稱取槲皮素對照品0.00713 g置于25mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，濃度為0.2852 mg/mL，分別精密吸取2 mL加入6個樣品內(nèi)，置圓底燒瓶內(nèi)，精密加入80%甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流90 min，放冷，再稱定重量，用80%甲醇補足減失的重量，搖勻，過濾，精密量取續(xù)濾液20 mL，轉移至50 mL容量瓶中，精密加入25%鹽酸溶液7 mL，置85℃水浴中水解30 min，冷卻，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。精密吸取10 μL，按“2.3.1”項下的方法測定峰面積，計算槲皮素含量和回收率。槲皮素的平均回收率為100.15%，RSD為0.94%，結果見表4。

2.4 浸膏得率的測定方法 按處方比例稱取魚子蘭、血滿草、黑皮跌打、三臺紅花、當歸藤等傣藥材，共9份，按表2、表3所設計因素水平表依法進行提取，將煎煮液進行濃縮，將濃縮液置于已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，在105℃干燥3 h，取出，置干燥器中冷卻30 min后迅速稱定重量，計算浸膏得率（浸膏得率=浸膏量/生藥投入量），結果見表5。

3.5 正交試驗結果 采用L9（34）正交表進行試驗，按照處方比例稱取魚子蘭、血滿草、黑皮跌打、三臺紅花、當歸藤等傣藥材，共9份，按表3所設計因素水平表依法進行提取，測定浸膏得率、槲皮素含量。正交試驗結果見表5，方差分析結果見表6。

多指標綜合評分時以各指標最大值為參照，對數(shù)據(jù)進行歸一化，給出權重，干膏量和槲皮素含量權重系數(shù)均為0.5。即綜合評分=（0.5×浸膏得率測定值/浸膏得率最大值+0.5×槲皮素含量測定值/槲皮素含量最大值）×100[9]。

由表5、表6可知，因素A（加水量）、因素B（煎煮次數(shù)）因素C（煎煮時間）對芽三英接骨膏提取均無顯著性影響。由極差R得出影響因素大小順序為C>A>B。此次試驗中指標干膏量和槲皮素含量都是越高越好，通過直觀分析（表5），選擇各個因素K1、K2、K3中最大者所對應的水平，即A3B1C2，故確定A3B1C2為最佳提取條件，即加12倍量的水，提取2次，每次提取60 min。

4 工藝驗證

在所選提取工藝條件下，將處方量放大5倍，平行3份，按照所選的最佳提取工藝條件為A3B1C2，即加12倍量的水，煎煮2次，每次煎煮60 min；按“3.4”項下方法測定浸膏得率；按“3.3.3”項下方法，制備樣品溶液，按“3.3.1”項下的方法測定峰面積，用0.22μm微孔濾膜濾過，進樣量10μL，每份進樣2針，測定槲皮素的峰面積，計算含量，結果見表7。

按照優(yōu)選出的提取工藝條件為A3B1C2進行三次平行操作，浸膏得率平均值高于正交試驗中的最高值，槲皮素含量平均值接近正交試驗中的最高值，說明優(yōu)選的提取工藝得率高，合理可行，因此作為最佳提取工藝條件。

5 討論

色譜條件優(yōu)化時，選擇甲醇為有機相，基線較平，干擾較??；選擇磷酸作為流動相水相，結果顯示磷酸可以顯著提高分離效果，磷酸過多的加入會明顯增高基線。最終選擇甲醇-0.5%磷酸（49：51）為流動相，所檢測的槲皮素色譜峰到達基線分離，峰形較好，分離度較高[10]。本文采用HPLC法測定槲皮素含量，進行方法學考察，結果表明該測定方法簡便，測定結果準確，重復性好，穩(wěn)定性高。

目前，傣藥膏劑提取工藝研究較少，主要提取工藝研究多采用加水量、提取時間、提取次數(shù)作為工藝考察因素。鑒于傣藥復方成分的復雜性，任何單一成分均難以代表制劑的效應，因此本文采用浸膏得率和槲皮素兩個指標，設計L9（34）正交試驗考察傣藥接骨膏的提取工藝，運用某種單一指標進行提取工藝控制更為科學合理。在提取工藝條件中，由于各指標的因素互不相同，因此原始樣本數(shù)據(jù)中各變量的數(shù)量級存在很大差別。為了便于綜合評分時比較分析，在研究過程中對各指標數(shù)據(jù)進行必要的標準化處理。標準化處理的方法很多，本文采用的是Ci/Ci（max），即數(shù)據(jù)除以該組最大數(shù)使數(shù)量級統(tǒng)一[11]。采用多指標信息熵權重分析法，結合正交設計優(yōu)化制備工藝，既保證了評價指標的全面性，又可根據(jù)各指標不同的影響程度進行權重系數(shù)的分配，使提取工藝路線的優(yōu)化更為合理、可信，結果分析更為科學、客觀。根據(jù)正交試驗結果，影響此次試驗提取結果的關鍵因素依次是煎煮次數(shù)、加水量、煎煮時間，再結合綜合評分、經(jīng)濟效益的角度考慮，以浸膏得率和槲皮素含量高為佳，優(yōu)選的提取條件為A3B1C2，即用12倍量水，煎煮2次，每次煎煮60 min。

對膏劑的研究，必須重視安全、科學、實用原則。本文優(yōu)選的提取工藝條件簡練、穩(wěn)定，可作為傣藥芽三英接骨膏的提取工藝條件。本試驗作為規(guī)范芽三英接骨膏制備工藝的有益嘗試，為保障芽三英接骨膏質量以更好地服務于醫(yī)療保健提供依據(jù)。

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（收稿日期：2018-07-09）