有限稀釋法分離純化人牙周膜干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究

任婭嵐　張湘宜　陳思思　白玲　劉春竹　劉亞麗

摘要：目的 體外分離培養(yǎng)人牙周膜干細(xì)胞（periodontal ligament stem cells， PDLSCs）并進(jìn)行鑒定。方法 采用有限稀釋法分離和純化PDLSCs并通過(guò)克隆形成及多向分化實(shí)驗(yàn)，鑒定所得細(xì)胞的增殖和分化能力。結(jié)果 分離純化所得細(xì)胞均為長(zhǎng)梭形或者不規(guī)則形，克隆細(xì)胞呈旋渦狀集落生長(zhǎng)趨勢(shì)，體外誘導(dǎo)條件下可向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞分化，具有干細(xì)胞增殖和多向分化的特性。結(jié)論 有限稀釋法分離純化的PDLSCs具有間充質(zhì)干細(xì)胞的表型及增殖和多向分化的生物學(xué)特性。

關(guān)鍵詞：有限稀釋法；人牙周膜干細(xì)胞；克隆形成；誘導(dǎo)分化

中圖分類(lèi)號(hào)：R781.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-1959（2017）18-0043-02

Abstract：Objective To isolate and culture the human periodontal ligament stem cells（PDLSCs）in vitro and to identify them.Methods PDLSCs were isolated and purified by limiting dilution method.The proliferation and differentiation ability of the obtained cells were identified by clonal formation and multidirectional differentiation experiments.Results The purified cells were fusiform or irregular in shape，cell clone was spiral colony growth trend under induction to osteoblasts，adipocytes，with characteristics of proliferation and multi cell differentiation.Conclusion PDLSCs isolated and purified by limited dilution method have the phenotype of mesenchymal stem cells and the biological characteristics of proliferation and multi-directional differentiation.

Key words：Finite dilution method；Human periodontal ligament stem cells；Clonal formation；Induction differentiation

牙周病是一種慢性炎癥骨吸收疾病，是造成成年人牙齒喪失最主要的原因 [1-2]。牙周病治療的關(guān)鍵是控制感染和誘導(dǎo)牙周支持組織修復(fù)和再生。組織工程學(xué)利用牙周膜干細(xì)胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）修復(fù)和再生病變牙周組織已成為牙周病治療的新手段[3]，使PDLSCs需求逐步增大。本研究在酶消化法培養(yǎng)原代牙周膜細(xì)胞的基礎(chǔ)上進(jìn)行了探索和改良，利用單細(xì)胞接種的有限稀釋法克隆化分離純化PDLSCs，并對(duì)所得干細(xì)胞進(jìn)行了相應(yīng)的鑒定，為PDLSCs的深入研究和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1主要試劑和儀器

α-MEM培養(yǎng)基（Gibco，美國(guó)）、胎牛血清（杭州四季青公司）、Ⅰ型膠原酶、甲苯胺藍(lán)、2.5 g/L胰蛋白酶、抗壞血酸、地塞米松、β-甘油磷酸鈉、茜素紅、油紅O（Sigma，美國(guó)）、倒置相差顯微鏡以及照相系統(tǒng)（Olympus，日本）。

1.2取材和細(xì)胞原代培養(yǎng)

1.2.1取材和原代培養(yǎng) 收集因正畸需要拔除的牙體牙周健康的前磨牙，年齡29～38歲。拔牙后用銳利刀片剝離牙根表面的牙周膜組織，接種至六孔培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)1～2 w，直至有細(xì)胞從組織塊邊緣爬出。細(xì)胞達(dá)80%時(shí)消化傳代。

1.2.2有限稀釋法分離純化人牙周膜干細(xì)胞 取第1代細(xì)胞懸液，吹打均勻接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)過(guò)夜標(biāo)記單個(gè)細(xì)胞孔，待克隆達(dá)孔底面積的 1/3～1/2時(shí)，消化混合，形成多克隆PDLSCs，體外擴(kuò)大繼續(xù)培養(yǎng)。第3～5代多克隆來(lái)源的PDLSCs用于本實(shí)驗(yàn)研究。

1.3牙周膜干細(xì)胞的鑒定

1.3.1細(xì)胞克隆形成能力 取第3代PDLSCs接種于9 cm培養(yǎng)皿中常規(guī)培養(yǎng)。顯微鏡下觀察細(xì)胞的克隆形成情況。14 d終止培養(yǎng)，棄培養(yǎng)液，多聚甲醛固定15 min，觀察計(jì)數(shù)，>50個(gè)細(xì)胞的集落記為1個(gè)克隆。

1.3.2成骨分化能力分析 取第3代細(xì)胞接種6孔培養(yǎng)板，待60%以上融合時(shí)，更換礦化培養(yǎng)液誘導(dǎo)21 d。多聚甲醛固定，茜素紅染色鏡下觀察。使用圖像分析軟件Image-Pro Plus 5.0（Media Cybernetics，美國(guó)）計(jì)算礦化結(jié)節(jié)面積。

1.3.3成脂分化能力分析 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期第3代細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，90%以上融合時(shí)，更換成脂誘導(dǎo)液培養(yǎng)14 d。多聚甲醛固定，油紅O染色，圖像分析。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩獨(dú)立樣本均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PDLSCs分離純化

3～7 d組織塊周?chē)性?xì)胞爬出。有限稀釋單克隆挑選培養(yǎng)的PDLSCs呈典型的紡錘形，成簇螺旋生長(zhǎng)，培養(yǎng)3 d后細(xì)胞可達(dá)到90%匯合，14 d后克隆形成，見(jiàn)圖1。

2.2成骨分化能力分析endprint

經(jīng)成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)7 d后，復(fù)層生長(zhǎng)的 PDLSCs 基質(zhì)中可見(jiàn)褐色結(jié)節(jié)，并隨時(shí)間逐漸增多。培養(yǎng)14 d，茜素紅染色，顯示PDLSCs礦化結(jié)節(jié)，見(jiàn)圖2。

2.3成脂分化能力分析

經(jīng)成脂誘導(dǎo)液培養(yǎng)7 d后，即可見(jiàn)細(xì)胞中有黃色小脂滴出現(xiàn)，主要集中于細(xì)胞核周?chē)ＵT導(dǎo)14 d時(shí)，油紅O染色可見(jiàn)脂滴呈橘紅色，見(jiàn)圖3。

3 討論

牙周膜干細(xì)胞具有成體干細(xì)胞自我更新和多向分化的特點(diǎn)，是牙周組織工程的重要種子細(xì)胞。研究者從正常[4]、老年人[5]、糖尿病[6]和慢性牙周炎[7-8]的牙周膜組織中分離出了PDLSCs。學(xué)者們利用各種不同的方法分離和培養(yǎng)PDLSCs。常用的方法有免疫磁珠分選法、流式細(xì)胞分選方法、有限克隆稀釋法。

免疫磁珠法是Seo等學(xué)者使用的PDLSCs分離方法，其分離細(xì)胞的原理是通過(guò)免疫學(xué)抗原抗體結(jié)合作用達(dá)到分離的目的，此方法的缺點(diǎn)是價(jià)格昂貴，分選效率低等[9]。流式細(xì)胞儀分離法其原理是利用不同大小的細(xì)胞帶有不同電荷，進(jìn)入電場(chǎng)中的偏離角度不同達(dá)到分離目的[10]。該方法分離速度快，但缺點(diǎn)是需特殊的儀器，且價(jià)格昂貴，要求細(xì)胞數(shù)量多。

考慮到細(xì)胞量、費(fèi)用和細(xì)胞純度等多方面的因素，本研究使用有限稀釋法。分離純化所得到的PDLSCs均為間充質(zhì)干細(xì)胞的長(zhǎng)梭形或者不規(guī)則形，能形成呈放射狀或者為旋渦狀集落生長(zhǎng)單細(xì)胞克隆，克隆形成率高的細(xì)胞也具有高增殖能力。分化實(shí)驗(yàn)顯示，PDLSCs可以向成骨和脂肪細(xì)胞分化，說(shuō)明分離純化所得的細(xì)胞具有干細(xì)胞多向分化的能力，與其它的研究結(jié)果相一致。與其它方法相比，有限稀釋法是一種相對(duì)簡(jiǎn)單的干細(xì)胞分離方法。此方法不需要特殊設(shè)備，實(shí)驗(yàn)耗費(fèi)小，適合大批量的克隆純化培養(yǎng)。

因此，有限稀釋法操作簡(jiǎn)單，所得的PDLSCs來(lái)源可靠，細(xì)胞的生物學(xué)特性均一，保證了實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞的穩(wěn)定性，是對(duì)PDLSCs的深入研究和應(yīng)用提供細(xì)胞來(lái)源的有效干細(xì)胞分離純化方法。

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