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    一測(cè)多評(píng)法測(cè)定大鼠腸溫孵液中意大利牛舌草4種成分的含量

    2018-01-19 08:47:12稅國(guó)蓮張文文馬桂芝
    關(guān)鍵詞:牛舌山奈蕓香

    稅國(guó)蓮, 滕 亮, 張文文, 馬桂芝

    (新疆醫(yī)科大學(xué)1藥學(xué)院, 烏魯木齊 830011; 2第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部, 烏魯木齊 830054)

    意大利牛舌草(AnchusaitalicaRetz.)是紫草科(Boraginaceae)牛舌草屬(AnchusaL.)多年生草木植物,具有調(diào)節(jié)異常黑膽質(zhì)[1]、抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、抗菌、抗炎、心血管保護(hù)等藥理作用[2]。本課題組前期對(duì)意大利牛舌草進(jìn)行了化學(xué)成分的研究,從其乙醇提取物中分離得到蘆丁、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、水仙苷、迷迭香酸、苦莓苷、咖啡酸、胡蘿卜苷、β-谷甾醇乙酸酯、β-谷甾醇等成分[3-4],對(duì)其乙醇提取物抗缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的作用及機(jī)制進(jìn)行了研究,結(jié)果表明意大利牛舌草乙醇提取物可能通過干預(yù)平衡氧化應(yīng)激產(chǎn)物的生成和抗氧化應(yīng)激的酶系統(tǒng)來減少缺氧/復(fù)氧所致原代心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷[5]。本研究建立大鼠腸溫孵液中意大利牛舌草主要成分(蘆丁、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、水仙苷、迷迭香酸)的高效液相色譜定量分析方法,并以蘆丁作為內(nèi)參物,測(cè)定蘆丁與山奈酚-3-O-蕓香糖苷、水仙苷、迷迭香酸的RCF,利用RCF進(jìn)行含量計(jì)算,并與外標(biāo)法的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較,對(duì)QAMS法進(jìn)行可行性驗(yàn)證,現(xiàn)報(bào)道如下。

    1 材料

    1.1儀器LC-20AB型高效液相色譜儀(日本島津公司),New Classic MF型電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司),Milli-Q型艾柯超純水儀(美國(guó)密理博公司),SK2510HP型超聲波清洗器(上??茖?dǎo)超聲儀器有限公司)。

    1.2試藥蘆丁(成都曼思特生物科技有限公司,批號(hào)MUST-16031813,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.00%),山奈酚-3-O-蕓香糖苷(成都曼思特生物科技有限公司,批號(hào)MUST-16041507,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.16%),水仙苷(成都曼思特生物科技有限公司,批號(hào)MUST-16070407,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.99%),迷迭香酸(成都曼思特生物科技有限公司,批號(hào)MUST-16040512,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.40%),乙腈、甲醇(美國(guó)Fisher公司,色譜純),水為超純水,其他試劑均為分析純。8個(gè)批次的意大利牛舌草提取物為新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物分析實(shí)驗(yàn)室自制。

    1.3動(dòng)物雄性SD大鼠,體質(zhì)量(200±20)g,SPF級(jí),新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,生產(chǎn)許可證:SCXK(新)2016-0001,動(dòng)物使用許可證:SYXK(新)2016-0002,飼養(yǎng)環(huán)境:光照12 h/d,溫度(21±2)℃,濕度40%~45%,大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w。

    1.4藥材意大利牛舌草2015年1月購自新疆伊鼎輝煌生科技有限公司,經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院帕麗達(dá)·阿布力孜教授鑒定為紫草科意大利牛舌草(AnchusaitalicaRetz.)的干燥地上部分。

    2 方法與結(jié)果

    2.1提取物的制備取意大利牛舌草干燥地上部分,去除沙石等雜質(zhì),粉碎粉末過20目篩,用75%乙醇,料液比1∶20回流提取2次,每次2 h。取預(yù)處理好的聚酰胺濕法裝柱,將1 BV的20 mg/mL意大利牛舌草粗提物溶液,以2 BV/h的速度上樣,進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附,上樣后靜態(tài)吸附30 min,先用1 BV的蒸餾水除雜后,再用20 BV的70%乙醇分別以5 BV/h的速度洗脫,收集70%乙醇過柱液,減壓濃縮,冷凍干燥,即為意大利牛舌草提取物。

    2.2溶液的制備方法

    2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 分別取蘆丁對(duì)照品、山奈酚-3-O-蕓香糖苷對(duì)照品、水仙苷對(duì)照品、迷迭香酸對(duì)照品適量,精密稱定,置10 mL容量瓶中,甲醇溶解定容,制得蘆丁濃度為106 μg/mL、山奈酚-3-O-蕓香糖苷濃度為101 μg/mL、水仙苷濃度為108 μg/mL、迷迭香酸濃度為389 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

    2.2.2 K-R液的制備 分別稱取NaCl 6.66 g、KCl 0.37 g、MgCl20.22 g、Na2HPO40.59 g、NaH2PO40.047 g、葡萄糖1.98 g、NaHCO32.1 g、CaCl20.14 g用超純水定容至1 000mL,用1 mol/mL鹽酸調(diào)pH值至7.40,備用。

    2.2.3 空白腸溫孵液的制備 分別取大鼠十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸腸段固定在尤斯灌流室兩室中間,在兩室中各加入5 mL已預(yù)熱的K-R緩沖液,溫孵1 h,于黏膜側(cè)取出溫孵好的空白腸溫孵液,同時(shí)補(bǔ)充5 mL已預(yù)熱的K-R緩沖液,維持漏槽條件,溫孵1 h后,于黏膜側(cè)取出孵好的空白腸溫孵液,合并2次液體即得空白腸溫孵液。

    2.2.4 供試品溶液的制備 稱取意大利牛舌草提取物5 mg至5 mL容量瓶,用甲醇溶解并定容,得到濃度為1 mg/mL供試品儲(chǔ)備液。腸粘膜孵育5 min后,分別在粘膜側(cè)(供給池)加入5 mL 100 mg/mL的意大利牛舌草提取物溶液,漿膜側(cè)(接受池)加入5 mL已預(yù)熱的K-R緩沖液,分別于不同時(shí)間點(diǎn)于漿膜側(cè)取樣200 μL,4℃儲(chǔ)存,備用。

    2.3樣品前處理精密量取腸溫孵液200 μL,加200 μL甲醇,渦旋混勻2 min,4℃下12 000 r/min離心10 min,取上清液過濾,備用。

    2.4外標(biāo)法方法學(xué)考察

    2.4.1 色譜條件 Cromasil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);以乙腈(A)-0.2%磷酸溶液(B)為流動(dòng)相,梯度洗脫(0~9 min,83%B→80%B;9~20 min,80%B→68%B;20~40 min,68%B→40%B;40~45 min,40%B→83%B);流速1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)354 nm;柱溫30℃;進(jìn)樣量20 μL。在該色譜條件下,各目標(biāo)物質(zhì)與相鄰色譜峰分離度良好,見圖1-4。

    圖14種目標(biāo)物質(zhì)混合對(duì)照HPLC色譜圖

    圖2空白腸溫孵液HPLC色譜圖

    ( a蘆?。籦山奈酚-3-O-蕓香糖苷;c水仙苷;d迷迭香酸)

    圖3空白腸溫孵液加混合對(duì)照品溶液HPLC色譜圖

    圖4給藥120min后的腸液HPLC色譜圖

    (a蘆?。籦山奈酚-3-O-蕓香糖苷;c水仙苷;d迷迭香酸) (a蘆??;b山奈酚-3-O-蕓香糖苷;c水仙苷;d迷迭香酸)

    2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液5 mL至10 mL容量瓶,以甲醇為溶劑倍量稀釋,得到系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液;分別量取1 mL系列濃度溶液至5 mL容量瓶中,用空白腸溫孵液稀釋得到蘆丁(0.08、0.16、0.33、0.66、1.32、2.65、5.30、10.60、21.20 μg/mL),山奈酚-3-O-蕓香糖苷(0.08、0.16、0.32、0.63、1.26、2.52、5.05、10.10、21.10 μg/mL),水仙苷(0.08、0.17、0.33、0.67、1.34、2.68、5.35、10.70、21.40 μg/mL),迷迭香酸(0.30、0.61、1.22、2.43、4.86、9.73、19.45、38.90、77.80 μg/mL)的腸液樣品。按“2.3”項(xiàng)下操作,按照“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析,分別以腸溫孵液中4種成分的濃度(X)對(duì)峰面積(Y)進(jìn)行線性回歸,得4種成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線,見表1。

    2.4.3 準(zhǔn)確度與精密度試驗(yàn) 分別精密量取高、中、低濃度混合對(duì)照品溶液,按“2.4.2”項(xiàng)下方法配成低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品,進(jìn)行5樣本分析,連續(xù)測(cè)定5 d,記錄峰面積,測(cè)定質(zhì)控樣品濃度,計(jì)算回收率、日內(nèi)精密度及日間精密度,見表2。

    2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別量取高、中、低濃度混合對(duì)照品溶液適量,按“2.4.2”項(xiàng)下方法配成低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品,按“2.3”項(xiàng)下方法處理,分別于處理后的0、2、4、6、8、10、12、14 h,按“2.4.1” 項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣分析。14 h內(nèi)測(cè)得各目標(biāo)成分濃度RSD均<20%,表明樣品溶液進(jìn)行前處理后在14 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

    2.4.5提取回收率試驗(yàn) 分別量取高、中、低濃度混合對(duì)照品溶液適量,按“2.4.2”項(xiàng)下方法配成低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品,進(jìn)行5樣本分析,記錄各目標(biāo)成分峰面積(A);取空白腸溫孵液,按”2.3”項(xiàng)下方法處理,分別量取高、中、低濃度混合對(duì)照品溶液,用已處理好的空白腸溫孵液稀釋定容至刻度,使其質(zhì)量濃度與A組相同。按“2.4.1” 項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)行5樣本分析,得到各成分峰面積(B),以A/B計(jì)算提取回收率并求出RSD值。試驗(yàn)結(jié)果表明4種成分的提取回收率在80%~120%,RSD值均<20%,符合分析方法學(xué)的要求,見表3。

    表1 4種成分線性范圍及檢測(cè)限(n=5)

    表2 精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果(n=5)

    表3 提取回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=5)

    2.5一測(cè)多評(píng)法量取“2.2.1” 項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1 mL置5 mL容量瓶,用空白腸溫孵液稀釋定容至刻度,按“2.3” 項(xiàng)下方法處理,按“2.4.1” 項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣2、4、8、12、16、20 μL,測(cè)定各成分峰面積和保留時(shí)間。以蘆丁為內(nèi)參物,根據(jù)相對(duì)校正因子計(jì)算公式fi/s=fi/fs=(Ai/Ci)/(As/Cs)(其中Ai為待測(cè)成分i的峰面積,Ci為待測(cè)成分i的濃度,As為內(nèi)參物的峰面積,Cs為內(nèi)參物s的濃度),相對(duì)保留值計(jì)算公式RRT=Ti/Ts(其中Ti為某待測(cè)成分保留時(shí)間,Ts為內(nèi)參物保留時(shí)間)分別計(jì)算山奈酚-3-O-蕓香糖苷、水仙苷、迷迭香酸與內(nèi)參物蘆丁之間的相對(duì)校正因子和相對(duì)保留值,見表4。

    表4 相對(duì)校正因子(RCFs)、相對(duì)保留值(RRT)測(cè)定結(jié)果

    注:a 蘆?。籦 山奈酚-3-O-蕓香糖苷;c 水仙苷;d 迷迭香酸

    2.6一測(cè)多評(píng)法與外標(biāo)法含量測(cè)定結(jié)果比較稱定意大利牛舌草提取物5 mg至5 mL容量瓶,用甲醇溶解并定容,得到濃度為1 mg/mL供試品儲(chǔ)備液。分別精密量取各批次供試品溶液1 mL至5 mL容量瓶,用空白腸溫孵液稀釋定容至刻度,按“2.3” 項(xiàng)下方法處理,按“2.4.1” 項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣。采用ESM法測(cè)定8個(gè)批次的大鼠腸溫孵液中意大利牛舌草提取物主要成分蘆丁、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、水仙苷、迷迭香酸的平均含量分別為14.20、15.88、9.80、66.90 mg/g。在線性范圍內(nèi),蘆丁與山奈酚-3-O-蕓香糖苷、水仙苷、迷迭香酸的RCF分別為0.983、1.101、0.843。利用RCF計(jì)算得山奈酚-3-O-蕓香糖苷、水仙苷、迷迭香酸的平均含量分別為15.67、9.87、67.44 mg/g,見表5。

    表5 QAMS法與ESM法測(cè)定大鼠腸溫孵液中意大利牛舌草4種成分含量(mg/g)

    3 討論

    一測(cè)多評(píng)法是利用中藥化學(xué)成分間內(nèi)在的函數(shù)關(guān)系和比例關(guān)系,在只采用1個(gè)對(duì)照品(價(jià)廉、易得者)的基礎(chǔ)上,實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)成分(昂貴、難得者)同步測(cè)定的方法。是一種適合中藥特點(diǎn)的多成分定量方法,特別適用于對(duì)照品難得或不穩(wěn)定的情況[6]。從2006年對(duì)單味藥中同一類化學(xué)成分的研究開始,該方法已成功運(yùn)用于梔子[7]等藥材以及杜麻顆粒[8]等復(fù)方制劑的含量測(cè)定。在2010年版《中國(guó)藥典》一部[9]中,已經(jīng)收錄運(yùn)用QAMS法測(cè)定黃連中生物堿的含量。在2015年版《中國(guó)藥典》一部[10]中,新增了運(yùn)用QAMS法測(cè)定丹參以及生姜中目標(biāo)成分的含量。

    蘆丁是意大利牛舌草中的含量較高的成分之一,化學(xué)性質(zhì)較穩(wěn)定,對(duì)照品來源有保障且價(jià)廉易得,故選作內(nèi)參物,能更好地體現(xiàn)一測(cè)多評(píng)法低成本、易操作的特點(diǎn)。迷迭香酸在測(cè)定過程中易降解,其含量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而明顯下降,其含量下降可能是因光照而發(fā)生分解[11],因此試驗(yàn)過程中應(yīng)避光處理,且樣品前處理后應(yīng)立即測(cè)定。色譜峰定性時(shí),可采用相對(duì)保留值法和保留時(shí)間差法對(duì)待測(cè)組分的色譜峰進(jìn)行定位,試驗(yàn)中2種方法均能準(zhǔn)確定位色譜峰,但相對(duì)保留值法是目前綜合效果最好,應(yīng)用最廣泛的定性方法。故本試驗(yàn)采用相對(duì)保留值法定位色譜峰。

    [1] 木拉提·克扎衣別克,BRIGITTE K,SONJA P,等.異常黑膽質(zhì)成熟劑中各單味藥對(duì)HL-60細(xì)胞增殖的抑制作用[J].科技導(dǎo)報(bào),2009,27(19):94-98.

    [2] 何媛媛,王金鳳,郭麗娜,等.意大利牛舌草化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].環(huán)球中醫(yī)藥,2017,10(1):114-120.

    [3] 常文,代己果,馬桂芝.意大利牛舌草化學(xué)成分的初步研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,43(10):85-86.

    [4] 路文杰,程雪梅,滕亮,等.多指標(biāo)綜合評(píng)分法優(yōu)選意大利牛舌草總黃酮的提取工藝[J]. 上海中醫(yī)藥雜志,2016,50(12):89-93.

    [5] 代己果,萬琪臻,馬桂芝,等.意大利牛舌草乙醇提取物抗缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的研究[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2017,40(3):356-360.

    [6] 王智民,錢中直,張啟偉,等.一測(cè)多評(píng)法建立的技術(shù)指南[J].中國(guó)中藥雜志,2011,36(6):657-658.

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    [9] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部)[S].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010:285.

    [10] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部)[S].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2015:76,101.

    [11] 侯建春,呂曉玲,周平,等.迷迭香酸的穩(wěn)定性研究[J].食品研究與開發(fā),2009,30(3):44-48.

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