大口黑鱸主要病害研究進(jìn)展

夏焱春，曹 錚，藺凌云，潘曉藝，姚嘉赟，劉憶瀚，尹文林，沈錦玉

（浙江省淡水水產(chǎn)研究所，浙江省魚類營養(yǎng)與健康重點實驗室，浙江湖州 313001）

大 口 黑 鱸（Largemouth bass，Micropterus salmoides），俗稱加州鱸，屬廣溫性魚類，原產(chǎn)北美洲密西西比河流域。1983年引入廣東省，現(xiàn)主要分布在廣東、江蘇、浙江、江西、四川和福建等省份。因其生長快、病害少、耐低溫、肉質(zhì)鮮美且易捕撈，大口黑鱸已成為我國重要的淡水養(yǎng)殖品種，近年來產(chǎn)量逐年上升，2016年產(chǎn)量達(dá)37.4萬噸，同比增長5.94%[1-2]。近年來，由于養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，養(yǎng)殖密度大幅提升，大口黑鱸生長過程中出現(xiàn)的病害情況日趨嚴(yán)重，給養(yǎng)殖戶帶來重大經(jīng)濟(jì)損失。因病害頻發(fā)，藥物濫用現(xiàn)象越來越普遍，導(dǎo)致大口黑鱸的質(zhì)量安全得不到保障，嚴(yán)重影響其養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。本文將大口黑鱸的病害總體分為細(xì)菌性疾病、病毒性疾病和寄生蟲病，描述了疫病的病原特征、發(fā)病時間和主要癥狀，并總結(jié)歸納了國內(nèi)外大口黑鱸免疫相關(guān)因子、疫苗研究和防控方法研究的最新進(jìn)展。

1 細(xì)菌性疾病

1.1 柱狀黃桿菌

柱 狀 黃 桿 菌（Flavobacterium columnare）屬于嗜纖維菌屬、黃桿菌屬、擬桿菌屬類群（Cytophaga flavobacterium bacteroides，CFB）。菌體形態(tài)大多呈直桿狀，直徑0.5 μm，體長6～12 μm，革蘭氏陰性，無鞭毛；25 ℃培養(yǎng)1 d，菌落邊緣不整齊，呈淡黃色。柱狀黃桿菌主要危害魚種和成魚，導(dǎo)致爛鰓病[3]。爛鰓病發(fā)病期為4—6月份和9—10月份，死亡率較高。該病主要癥狀為病魚體色黑暗，離群，反應(yīng)遲緩，鰓瓣通常有腐爛，鰓小片壞死，病魚口腔表皮發(fā)炎充血，嚴(yán)重的會有糜爛 ；主要防治方法為全池消毒和內(nèi)服抗菌藥物，此外還要保持水質(zhì)清潔，小心操作避免魚體受傷等[2]。目前，已經(jīng)成功建立了柱狀黃桿菌的常規(guī)PCR檢測方法、間接ELISA快速檢驗方法、雙抗體夾心ELISA檢測方法等[4]。據(jù)Bebak[5]研究，美國已經(jīng)研制出柱狀黃桿菌疫苗，并且給自然條件下飼料喂養(yǎng)的大口黑鱸魚苗接種后發(fā)現(xiàn)，能顯著降低其感染后的死亡風(fēng)險。之后Shoemaker等[6]又利用利福平削弱柱狀黃桿菌毒力，將改良的柱狀黃桿菌活疫苗接種大口黑鱸魚苗，發(fā)現(xiàn)能達(dá)到很好的保護(hù)效果。

1.2 諾卡氏菌

諾卡氏菌（Nocardia）是魚類諾卡氏菌病的致病菌，其中鰤魚諾卡氏菌主要感染大口黑鱸。該菌體呈短桿狀，有細(xì)長分支，一般直徑為0.2～1.0 μm，長2～5 μm，革蘭氏陽性，適宜生長溫度為25～28 ℃。大口黑鱸諾卡氏菌病發(fā)病期主要集中在6—9月份。由于諾卡氏菌病為慢性疾病，潛伏期長，因此不易被發(fā)現(xiàn)。病魚一般表現(xiàn)不吃食，在環(huán)境變化后，如雨后會出現(xiàn)大量死亡。該病主要防治方法為及時有效消毒、科學(xué)投喂和內(nèi)服抗生素[7-8]。蔣依依等[9]分離到一株鰤魚諾卡氏菌，認(rèn)為它是導(dǎo)致大口黑鱸結(jié)節(jié)病的病原菌，對其進(jìn)行藥敏試驗發(fā)現(xiàn)，該菌株對氯霉素、鏈霉素、卡那霉素、四環(huán)素等抗菌藥物敏感，但對磺胺類和氨芐青霉素有耐藥性。目前，大口黑鱸的諾卡氏菌免疫相關(guān)因子研究取得了一定進(jìn)展：Omkar等[10]通過超高通量測序平臺，發(fā)現(xiàn)了大口黑鱸感染諾卡氏菌后，Toll樣受體、趨化因子等各個免疫相關(guān)基因的上調(diào)表達(dá)模式。Ho等[11]成功克隆了大口黑鱸白介素1β（IL-1β），并在感染諾卡氏菌后進(jìn)行了表達(dá)量測定，發(fā)現(xiàn)8 h后，頭腎的IL-1β表達(dá)量增加，在第三天達(dá)到高峰，而脾臟的表達(dá)量在5 h后就顯著提高，且持續(xù)3 d。這有利于解釋細(xì)菌感染大口黑鱸后各個基因在免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮的作用，從而為未來研發(fā)諾卡氏菌病疫苗提供理論基礎(chǔ)。

2 病毒性疾病

2.1 虹彩病毒

虹彩病毒科（Iridoviridae）病毒都是正二十面體病毒，直徑120～300 nm，包括5個屬，其中蛙病毒屬（Ranavirus）、細(xì)胞腫大病毒屬（Megalocytivirus）、淋巴囊腫病毒屬（Lymphocystivirus）可以感染脊椎動物，而虹彩病毒屬（Iridovirus）、綠虹彩病毒屬（Chloriridovirus）感染無脊椎動物。虹彩病毒科病毒多是單分子線性雙鏈DNA病毒，基因組大小為l70～200 kb，其中主要感染大口黑鱸的為蛙病毒屬和細(xì)胞腫大病毒屬。

2.1.1 蛙病毒 目前研究較多的蛙病毒為大口黑鱸蛙 病 毒（Largemouth bass ranavirus，LMBV），最早于1991年在美國佛羅里達(dá)州被發(fā)現(xiàn)，1996年先被歸類到虹彩病毒科，后又被歸類到蛙病毒屬。大口黑鱸感染該病毒后，通常不表現(xiàn)任何癥狀，呈隱性帶毒。但Deng等2008年從廣東省佛山地區(qū)分得一株與LMBV同源性較高的病毒，肌肉注射后導(dǎo)致大口黑鱸100%死亡[12]。蛙病毒病夏季高發(fā)，發(fā)病時水溫為25～30 ℃，危害成魚，致死率高。LMBV在兩棲類、禽類等天然宿主體內(nèi)，甚至魚餌中均可以存活，存在多種傳播途徑，目前沒有有效的治療藥物，只能靠科學(xué)飼養(yǎng)和及時消毒來預(yù)防[13]。實驗室人工感染條件下，腹腔注射和浸泡都可以使大口黑鱸患病，且鰾、鰓和后腎是最容易受LMBV侵襲的器官。而自然環(huán)境下，大口黑鱸普遍呈隱性帶毒。Inendino等[14]研究表明，環(huán)境對LMBV感染存在影響，水體環(huán)境的劇烈變化、飼養(yǎng)密度過大等因素都會導(dǎo)致感染LMBV的大口黑鱸病死率上升。這就要求科學(xué)控制大口黑鱸養(yǎng)殖環(huán)境，防止出現(xiàn)大規(guī)模的LMBV感染。根據(jù)Huang等[15]研究，LMBV感染鯉魚上皮瘤細(xì)胞（EPC）后，可以誘導(dǎo)典型的細(xì)胞凋亡；凋亡啟動因子和終止因子的激活與感染時間顯著相關(guān)，PI3K抑制劑可增強(qiáng)LMBV感染誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，而ERK抑制劑可降低LMBV的感染。這為研究LMBV感染的分子機(jī)制提供了新思路，為研制LMBV疫苗提供了依據(jù)。

2.1.2 細(xì)胞腫大病毒 細(xì)胞腫大病毒會導(dǎo)致大口黑鱸的脾、腎等病毒靶器官內(nèi)出現(xiàn)大量細(xì)胞質(zhì)勻質(zhì)化且嗜堿性的腫大細(xì)胞，從而導(dǎo)致肝臟、脾臟、腎臟腫大，體色變黑。部分嚴(yán)重的病魚還會出現(xiàn)眼睛突出，腎臟失血而呈灰白色。該病主要危害成魚，導(dǎo)致其脾腎壞死，一旦暴發(fā)，死亡率高達(dá)80%。目前對于該病，尚無有效的治療手段，只能依靠科學(xué)消毒來進(jìn)行防治。根據(jù)Zhang等[17]研究，將細(xì)胞腫大病毒的ORF75基因制成DNA疫苗，免疫細(xì)胞后會導(dǎo)致多種免疫基因的上調(diào)表達(dá)，且經(jīng)病毒全基因組轉(zhuǎn)錄分析，發(fā)現(xiàn)敲除ORF75后可導(dǎo)致病毒43種基因的轉(zhuǎn)錄改變，證明ORF75編碼高度保護(hù)性免疫原。這為研發(fā)細(xì)胞腫大病毒疫苗提供了新思路。

2.1.3 其他研究 研究人員還以魚類虹彩病毒主要衣殼蛋白（Majorcapsid protein，MCP）作為保護(hù)性抗原，研制基因工程疫苗，來解決虹彩病毒病問題。MCP蛋白分子量約為50 kD，占病毒總蛋白的40%～45%，具有一定免疫原性，可以保護(hù)病毒核酸并介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞的結(jié)合。馬冬梅等[16]構(gòu)建重組表達(dá)MCP蛋白的工程菌，制備基因工程疫苗，發(fā)現(xiàn)該疫苗對LMBV感染后20 d的大口黑鱸保護(hù)率最高達(dá)67.7%。

2.2 彈狀病毒

大口黑鱸感染的彈狀病毒（Rhabdovirus）屬于水泡性病毒屬（Vesiculovirus），為線性負(fù)鏈單鏈RNA病毒，病毒粒子大小約為53 nm×140 nm，形態(tài)呈子彈狀，具有5 種主要結(jié)構(gòu)蛋白（RNA依賴性RNA聚合酶蛋白L、糖蛋白G、核衣殼蛋白N、磷蛋白P、基質(zhì)蛋白M）。彈狀病毒主要導(dǎo)致肝、脾、腎腫大或充血，體色發(fā)黑，使病魚表現(xiàn)彎曲身體，螺旋狀不規(guī)則游動。彈狀病毒主要危害魚苗，發(fā)病時間通常為3—4月份。該病在水溫突然升高或降低時易發(fā)，而且傳播快、致死率高。本研究小組曾對浙江省主要養(yǎng)殖地區(qū)大口黑鱸苗的發(fā)病情況進(jìn)行過調(diào)查，發(fā)現(xiàn)每年死亡率平均在40%～50%之間。針對該病毒引發(fā)的疾病，目前還沒有有效的治療藥物。但Chen等[18]構(gòu)建了抗彈狀病毒的G蛋白質(zhì)粒，免疫魚體后，發(fā)現(xiàn)I型IFN抗病毒免疫應(yīng)答被迅速觸發(fā)，并且可降低組織器官損害程度并抑制病毒復(fù)制。這為開發(fā)彈狀病毒疫苗提供了新思路。

Gao等[19]將大口黑鱸彈狀病毒（MSRV）感染大口黑鱸皮膚細(xì)胞，利用深度RNA測序技術(shù)，揭示MSRV感染過程中的轉(zhuǎn)錄譜，并用定量PCR驗證幾種差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)其可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，激活干擾素信號通路。這為病毒感染其他免疫相關(guān)基因的后續(xù)研究提供了有用資源。

3 寄生蟲病

3.1 車輪蟲

車輪蟲（Trichodina）是車輪蟲科（Trichodinidae claus）寄生性纖毛蟲原生動物的統(tǒng)稱。車輪蟲科隸屬寡膜綱（Oligohymenophora de puytorac）。在我國已見報道的車輪蟲有5個屬近80種，其中直鉤車輪蟲主要感染大口黑鱸而導(dǎo)致大口黑鱸車輪蟲病。病魚體色黑暗且消瘦，體表有較多粘液，鰓絲發(fā)白腐爛，群游于池邊。此病于培苗期間流行，通常為3—5月份，對魚苗、魚種危害較大，致死率較高，且易發(fā)生繼發(fā)感染。主要防治方法為全池消毒。Meira-filho等[20]發(fā)現(xiàn)，直接用476 mg/L的冰醋酸浸泡魚體1 h可以有效防治車輪蟲。李鷥鷥等[21]認(rèn)為，目前標(biāo)準(zhǔn)用藥效果欠佳，導(dǎo)致一些限制或禁止使用藥物被濫用。為達(dá)到安全防治的目的，可著力研發(fā)藥效好、低殘留、無抗藥性、污染小的中草藥。Yao等[22]發(fā)現(xiàn)利用白屈菜中的白屈菜紅堿浸泡可以100%去除車輪蟲（濃度為0.8 mg/L）。這都為開發(fā)新的抗車輪蟲藥提供了依據(jù)。

3.2 杯體蟲

魚杯體蟲（Apiosoma piscicola blanchard）屬于杯體蟲屬（Apiosoma blanchard），是一種附著于多種水生生物體表及鰓部的緣毛類纖毛蟲。該蟲體口圍唇具有極強(qiáng)的伸縮性，可將口圍纖毛完全縮進(jìn)體內(nèi)，身后端有一條吸盤狀茸毛器，可借此粘附魚體。大口黑鱸感染杯體蟲后，主要癥狀為病魚群游于池邊或水面，體表、鰭條有類似水霉的灰白絮狀物。該病在3—5月份的培苗期流行，主要危害魚苗，且容易產(chǎn)生繼發(fā)感染。防治方法與車輪蟲病相似，主要做好水體消毒[23]。

3.3 斜管蟲

斜管蟲（Chilodonella）屬斜管科、管口目，主要寄生在淡水魚的鰓和體表，少量寄生時對魚體危害不大。大口黑鱸感染斜管蟲的主要癥狀為體色發(fā)黑，體表和鰓有較多粘液，消瘦，側(cè)臥池邊或漂于水面。該病流行于培苗期，主要危害魚苗。預(yù)防措施主要是用硫酸銅-硫酸亞鐵合劑（5：2）全池潑灑消毒或用高錳酸鉀消毒魚苗。顧中華等[24]研究認(rèn)為，可以用硫酸銅制劑、高錳酸鉀等多種藥物進(jìn)行治療，但治療過程中一定要注意配合使用抗菌藥物，以預(yù)防其他細(xì)菌病發(fā)生。

3.4 小瓜蟲

多子小瓜蟲（Ichthyophthirius multifiliis）屬小瓜蟲屬（Ichthyophthirius）、凹口科（Ophryoglenidae）、膜口目（Hymenostomatida）。成蟲一般呈卵圓形或球形，乳白色，是目前魚體上發(fā)現(xiàn)的最大寄生原蟲。研究表明，小瓜蟲成長過程分為幼蟲、成蟲和滋養(yǎng)體3個時期，最終成蟲發(fā)育成的滋養(yǎng)體會脫離魚體，在水中固著。大口黑鱸感染小瓜蟲的主要癥狀為病魚反應(yīng)遲緩，消瘦，浮于水面或集群繞池，肉眼可見病魚體表和鰓上布滿白色點狀胞囊。感染嚴(yán)重的病魚病灶組織增生，分泌大量粘液，會在體表形成一層白色薄膜。該病主要發(fā)生在3—5月份，發(fā)病水溫20～25 ℃，直接危害種苗。成魚也可發(fā)病，若治療不及時死亡率較高。近年篩選了一些中草藥，如辣椒和生姜等，以及有一定療效的藥物，如硫酸銅、高錳酸鉀等。這些藥物大多只對幼蟲有一定效果，對成蟲和滋養(yǎng)體效果不明顯。有學(xué)者提出開發(fā)抗小瓜蟲疫苗來防治小瓜蟲，但目前還在研究中[25]。

4 討論

大口黑鱸從上世紀(jì)引進(jìn)我國，經(jīng)過近30年的發(fā)展，其養(yǎng)殖已形成產(chǎn)業(yè)規(guī)模，產(chǎn)業(yè)分工劃分明確，養(yǎng)殖技術(shù)方面也已達(dá)到較高水準(zhǔn)。白俊杰等[26]報道，大口黑鱸本身有較強(qiáng)的抗病力，在全國大多數(shù)省份養(yǎng)殖，年總產(chǎn)量在16萬～20萬噸之間。該魚的養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)一直穩(wěn)步發(fā)展，已成為我國池塘養(yǎng)殖的重要優(yōu)質(zhì)魚類。但是養(yǎng)殖者為了追求產(chǎn)量和效益，不斷提高養(yǎng)殖密度，加上種質(zhì)、飼料、水質(zhì)和環(huán)境等因素影響，致使其病害頻發(fā)，從而帶來了重大經(jīng)濟(jì)損失。為保障大口黑鱸養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，政府需加大對大口黑鱸病害研究相關(guān)項目的扶持力度，如：建立有效的病害快速檢測技術(shù)，加快研發(fā)病毒性疾病疫苗；加大宣傳力度，鼓勵養(yǎng)殖農(nóng)戶合理規(guī)劃養(yǎng)殖密度；多使用生態(tài)防治技術(shù)，減少化學(xué)藥物使用；科學(xué)投喂配合飼料，減少冰鮮魚的使用。

疫苗免疫、使用中草藥是預(yù)防和控制傳染性疫病的重要措施，也是解決目前大口黑鱸養(yǎng)殖中存在的抗菌藥物過度使用、藥物殘留超標(biāo)、耐藥性增加等食品安全以及環(huán)境污染系列問題的關(guān)鍵手段，這符合國家對水產(chǎn)藥物研發(fā)的發(fā)展方向。農(nóng)業(yè)部在《“十三五”農(nóng)業(yè)科技發(fā)展規(guī)劃》（農(nóng)科教發(fā)〔2017〕4號）文件中，將加強(qiáng)水產(chǎn)養(yǎng)殖用疫苗、禁用藥物替代品研發(fā)及標(biāo)準(zhǔn)化應(yīng)用列為重點研究內(nèi)容之一。但目前水產(chǎn)疫苗仍存在規(guī)?；后w免疫實施困難、有效無抗性抗原提呈系統(tǒng)不完善、免疫效果差、免疫機(jī)理研究不透徹等難點亟待解決，而且目前中草藥的開發(fā)和應(yīng)用也不夠深入，缺乏藥理和藥效方面的研究。未來可以結(jié)合現(xiàn)代分子生物學(xué)和免疫醫(yī)學(xué)知識，創(chuàng)制綠色、安全、廉價、高效、操作簡單的新型漁藥，為實現(xiàn)漁業(yè)綠色發(fā)展，提供技術(shù)支撐。