骨源性外泌體在骨重建中的作用研究進展

黃凱 侯紅燕 宋敏* 周靈通 董萬濤,2 劉小鈺 蔣林博

1. 甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅 蘭州 730000

2. 甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000

引言

骨重建(bone remodeling)是一種由破骨細胞(骨吸收)去除老的或損壞的骨骼隨后由成骨細胞形成新骨(骨形成)的終身性過程。在骨重建中，骨吸收和骨形成始終保持在一動態(tài)平衡的狀態(tài)，使得骨骼可以保持其強度和礦物質(zhì)穩(wěn)態(tài)，但當這種狀態(tài)失衡后，就會導致骨硬化病、骨量減少、骨質(zhì)疏松癥等疾病的發(fā)生[1]。影響骨重建的因素有很多，如甲狀旁腺激素(PTH)、維生素D、生長激素、類固醇、降鈣素、可溶性細胞因子和生長因子(例如M-CSF、RANKL、VEGF、IL-6家族等)等[2]，這些因素最終導致成骨細胞誘導的骨形成和破骨細胞誘導的骨吸收之間的平衡被打破，從而產(chǎn)生相關疾病。近年來由于科學技術的進步以及分子生物學的大力發(fā)展，骨重建的機制研究也越來越向微觀鄰域發(fā)展，而外泌體由于其特殊的膜結構及納米直徑，可通過多種途徑調(diào)控細胞的凋亡、增殖和分化，因此能夠在骨重建的相關細胞中發(fā)揮重要作用。

1 外泌體的生物學特性

外泌體(Exosomes)在現(xiàn)階段通常是指一種直徑為30 nm～100 nm的細胞外囊泡。早在1983年，Harding等[3]在大鼠的網(wǎng)織紅細胞中發(fā)現(xiàn)類似溶酶體樣的囊泡結構，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)鐵蛋白通過內(nèi)陷小窩和囊泡內(nèi)化的方式，使之及其受體在胞吞后被循環(huán)回質(zhì)膜，隨后在1987年，Johnstone等[4]發(fā)現(xiàn)在其體外培養(yǎng)的綿羊紅細胞的培養(yǎng)基中也發(fā)現(xiàn)此類囊泡樣結構，后將該類囊泡被命名為外泌體。外泌體是細胞外囊泡的一種，其形成主要是由于細胞攝入外來物質(zhì)后在細胞內(nèi)經(jīng)過復雜的反應使之內(nèi)陷形成多囊泡小體，后者在選擇性接受細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等物質(zhì)形成多泡內(nèi)核體，其與細胞膜融合后將外泌體釋放到胞外基質(zhì)中[5]。目前研究表明，外泌體可由樹突細胞，肥大細胞，B淋巴細胞，神經(jīng)元，脂肪細胞，內(nèi)皮細胞和上皮細胞分泌釋放[6-8]，并發(fā)現(xiàn)在血液，羊水，尿，惡性腹水，腦脊髓液，乳汁，唾液，淋巴，膽汁等體液環(huán)境中廣泛存在[9-11]。外泌體的組成成分復雜，不同的細胞其分泌的外泌體也不盡相同。根據(jù)Exocarta數(shù)據(jù)庫(http://www.exocarta.org/)所示，目前來自各種生物體和各種細胞類型的外泌體中蛋白質(zhì)9 769個、脂質(zhì)1 116個、mRNA3 408個、miRNA2 838個[12]。盡管外泌體中蛋白質(zhì)的的種類眾多，但也有一些蛋白質(zhì)是所有類型的外泌體所共有的，例如熱休克蛋白(Hsp60、Hsp70、Hsp90、sHSPs等)、細胞骨架蛋白(如肌動蛋白和微管蛋白)、四跨膜超家族(tetraspanin)蛋白(CD9，CD63，CD81和CD82)、參與MVB形成的蛋白質(zhì)(ALIX、TSG101)、膜運輸?shù)鞍?如Rab蛋白)等[7]，而這些蛋白也將作為外泌體特異性的標志物，從而使外泌體從細胞中分離純化以用于鑒定。

在現(xiàn)行的研究中，外泌體主要發(fā)揮兩個作用，一是外泌體可以作為疾病潛在的特異標志物，二是外泌體可以作為潛在的藥物輸送系統(tǒng)或治療靶點[13]，這是因為外泌體特殊的納米級分子直徑、脂質(zhì)雙分子層及其表面特異的膜蛋白或脂質(zhì)配體所造成的。由于外泌體的分子直徑為30～100 nm，因此可以減免體內(nèi)大部分的免疫應答反應，使外泌體的內(nèi)含物可以悄悄地“偷渡”出去而不被發(fā)現(xiàn)，而且由于其被脂質(zhì)雙分子層包裹，因此可以避免外泌體被體內(nèi)各種酶所降解。外泌體的傳輸系統(tǒng)很復雜，到目前為止科學界認為主要有一下兩種方式進行傳輸：一是外泌體可以通過其表面特異的膜蛋白或脂質(zhì)配體與相應細胞表面特異性受體相結合，從而將其內(nèi)含物傳遞給受體細胞；二是外泌體直接與受體細胞通過質(zhì)膜融合的方式將其內(nèi)含物送入細胞[5]。由于外泌體特殊的生物學特性，因此外泌體可以作為骨硬化病、骨量減少、骨質(zhì)疏松癥等臨床疾病潛在的診斷指標及靶向治療方式。

2 外泌體與成骨細胞

骨的生長和發(fā)育與成骨細胞密切相關。成骨細胞是人體骨組織的重要組成部分，也是參與骨形成的主要功能細胞，在骨骼生長發(fā)育及骨量維持方面扮演著關鍵角色。成骨細胞來源于具有多向分化潛能的MSCs，經(jīng)細胞增殖、細胞外基質(zhì)合成、成熟及礦化后最終發(fā)展成為骨細胞，從而促進骨形成及維持骨量的動態(tài)平衡[14]。

成骨細胞的分化受到多種因素、信號通路、miRNA等因素的調(diào)控，因此成骨細胞分泌的外泌體也能促進或抑制成骨細胞的分化。Yong等人總結了Mineralizing MC3T3‐E1細胞系(礦化的小鼠胚胎成骨細胞前體細胞)分泌的外泌體內(nèi)miRNA的作用，其中miR-30 d-5p、miR-133b-3p、miR-140-3p的上調(diào)抑制了成骨細胞的分化能力，Let-7、miR-335-3P、miR-378b的上升增強了成骨細胞的分化，miR-677-3p的上調(diào)促進了間充質(zhì)干細胞成骨分化，miR-503-3p的上調(diào)抑制了RANKL誘導的破骨細胞分化[15]。Deng等人用甲狀旁腺激素(PTH)誘導的UAMS-32P細胞系(一種成骨細胞系)[16]中提取的MVs與小鼠RAW264.7細胞系一起誘導培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)RAW264.7細胞系分化破骨細胞的力增強，這是由于PTH誘導UAMS-32P細胞所形成的微囊泡(Microvesicles，MVs)中富含RANKL蛋白，而RAW264.7細胞系表面又有RANK受體，二者特異性相結合從而增強RAW264.7細胞分化破骨細胞的能力[17]。Cui等人證明了礦化前成骨細胞MC3T3-E1細胞的外泌體可以促進骨髓基質(zhì)細胞(ST2)分化為成骨細胞，并且Cui等人發(fā)現(xiàn)礦化的成骨細胞外泌體內(nèi)上調(diào)的miRNA(miR-667-3p，miR-6769b-5p，miR-7044-5p，miR-7668-3p和miR-874-3p)能夠靶向抑制Axin1的表達，同時ST2細胞中β-連環(huán)蛋白表達增加，激活Wnt信號通路促進ST2細胞成骨分化[18]。Ge等人在小鼠Mc3t3細胞的外泌體中分離了1 069個蛋白質(zhì)，其中有786個與ExoCarta數(shù)據(jù)庫重疊，通過GO分析檢測到Rho GTP酶(RhoA、Rac1、和Cdc42)，而RhoA信號通路在骨重建中起重要作用[19],通過蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)IPA分析發(fā)現(xiàn)成骨細胞衍生的外泌體內(nèi)蛋白質(zhì)與成骨相關的信號通路高度相關，并且成骨細胞分泌的外泌體中的EIF2也可能誘導MSC分化為成骨細胞[20]。

3 外泌體與破骨細胞

骨質(zhì)吸收由破骨細胞介導，破骨細胞是目前唯一明確有降解骨量功能的細胞，過度活動的破骨細胞導致骨丟失和骨質(zhì)疏松[21]。破骨細胞來源于造血干細胞，也可由單核前體細胞通過多種方式融合形成，是一種高度分化的多核巨細胞。破骨細胞具有豐富的溶酶體、線粒體、大量的高爾基體和強大的細胞骨架系統(tǒng)[22]。

破骨細胞的分化受多種細胞及其產(chǎn)物的調(diào)節(jié),其中M-CSF與RANKL的作用尤為關鍵,而Zhao等人通過在M-CSF與RANKL誘導下使骨髓單核細胞(BMMs)向破骨細胞方向增殖，并檢測到其細胞內(nèi)miR-214含量增加，由此發(fā)現(xiàn)miR-214通過PI3k/Akt途徑靶向作用于磷酸酶和張力蛋白同源物(PTEN)促進破骨細胞增殖[23]。Shi等人發(fā)現(xiàn)MiR-214通過靶向作用于成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Osterix從而抑制C2C12成肌細胞的成骨分化[24]。Wang等人的研究發(fā)現(xiàn)了miR-214可以瞄準ATF4(一個重要的成骨轉(zhuǎn)錄因子)，抑制骨形成[25]。Li和Sun等人在體內(nèi)外實驗中均發(fā)現(xiàn)破骨細胞分泌的外泌體內(nèi)含有miR-214/miR-214-3p，其外泌體能夠特異性的與成骨細胞相結合從而抑制成骨細胞的活性。 Sun等人還發(fā)現(xiàn)了破骨細胞分泌ephrinA2蛋白，而且在其外泌體中也大量存在，而成骨細胞表面有EphA2(ephrinA2的受體)，因此破骨細胞衍生的外泌體通過ephrinA2/EphA2特異性的識別成骨細胞，從而將miR-214/miR-214-3p釋放到成骨細胞中從而降低其分化能力。Li等人還發(fā)現(xiàn)老年骨折婦女的血清外胚層miR-214-3p含量與破骨細胞miR-214-3p之間血清外胚層miR-214-3p含量與骨內(nèi)miR-214-3p含量呈正相關[26，27]。這表明miR-214-3p可以作為骨量減少、骨質(zhì)疏松癥等疾病潛在的血清診斷方法。

4 外泌體與間充質(zhì)干細胞

隨著醫(yī)學技術的不斷進步及精準醫(yī)學的提倡，最近十幾年，越來越多的科學家對干細胞療法進行研究，而間充質(zhì)干細胞，一類來源于中胚層的具有高度自我更新能力與多向分化潛能的多能干細胞[28]，也受到學者們的關注。

目前研究表明，間充質(zhì)干細胞具有促進組織修復能力[29]、神經(jīng)保護作用[30]、多向分化潛能[31]、免疫調(diào)節(jié)能力[32]等，但其作用方式卻眾說紛紜，而在近期的研究中發(fā)現(xiàn)外泌體可能是一重要原因。根據(jù)現(xiàn)有研究，MSCs分泌的外泌體具有神經(jīng)再生[33]、促進腫瘤增殖[34]、修復腎臟損傷[35]、抑制血管生成[36]、增加血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移和血管的形成[37]、修復肝臟損傷[38]等作用。

在骨組織相關研究里，Xu等人通過對BMSCs成骨分化時其外泌體內(nèi)miRNA的表達譜進行研究，發(fā)現(xiàn)有9個miR顯著表達(let-7a，miR-199b，miR-218，miR-148a，miR-135b，miR-203，miR-219，miR-299-5p和miR-302b)，并且檢測到7個mRNA(RPS2，DGKA，ACIN1，DKK2，Xsox17，DDX6和Lsm2)在成骨分化的BSMC外泌體中顯著差異表達[39]，這些都與成骨細胞的的增殖分化有密切關系。Yong等人總結了BMSCs分泌的外泌體內(nèi)miRNA的作用，其中Let-7、miR-218、miR-196 a的上調(diào)以及miR-118a的下調(diào)能夠增強BMCs向成骨細胞分化的能力，這可能是由于靶向AXIN2、SOST、DKK2 SFRP2、HOXC8、TGF-BI、TβR-I、RGS4、GATA6等基因所導致的。miR-221、miR-885-5p的下調(diào)抑制了BMCs向成骨細胞分化的能力，這可能是由于這兩種miRNA靶向RUNX2基因所導致的。miR-148 a的上調(diào)能夠靶向MAFB基因，從而促進破骨細胞的分化[15]。Qi等人將人誘導的多能干細胞的間充質(zhì)干細胞分泌的外泌體(hiPSC-MSC-Exos)與去卵巢的骨質(zhì)疏松大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(rBMSCs-OVX)一起培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)hiPSC-MSC-Exos能夠有效地刺激了rBMSCs-OVX的增殖和增強的成骨分化，并且隨著外泌體濃度的增加，成骨分化效應也隨之增加[40]。Qin等人通過細胞實驗檢測到BMSCs分泌的EVs(可能是外泌體)支持成骨細胞的活動和分化，并且發(fā)現(xiàn)細胞外囊泡通過miR-196a調(diào)節(jié)成骨細胞分化和基因表達[41]，這與Kim等人的發(fā)現(xiàn)相同[42]。

單核細胞是血液中最大的血細胞，其內(nèi)含許多的非特異性脂酶，并且具有很強的吞噬作用。在過往的研究中，單核細胞總與破骨細胞的增殖分化相關聯(lián)，而Ekstr?m等人將LPS刺激后單核細胞釋放的外泌體與MSCs相接種，檢測到成骨基因在MSCs中高表達，發(fā)現(xiàn)了單核細胞和間充質(zhì)干細胞信號傳導的新途徑，表明單核細胞分泌的外泌體可以作為信使有選擇性的使MSCs成骨分化能力增強[43]。

5 外泌體與骨細胞

骨細胞是成骨細胞分化的終末細胞，是成熟骨組織中最常見的細胞，約占整個骨組織細胞的95%以上，其平均半衰期為25年[44]。成熟的骨細胞將會嵌入在礦化的骨質(zhì)中，而在嵌入的過程中，骨細胞通過細胞突在骨基質(zhì)中形成一通道(小管)，使骨細胞能夠與骨表面的成骨細胞和破骨細胞之間形成高度連通的通信網(wǎng)絡，并且通過這一網(wǎng)絡，骨細胞可以作為機械感應細胞，在骨重建的起始中起關鍵作用[45]。

已經(jīng)證明，骨細胞能夠釋放各種信號因子，如核因子-κB配體的受體激活劑(RANKL)、胰島素樣生長因子-1(IGF-1)、骨硬化蛋白、NO和ATP，從而影響成骨細胞和破骨細胞的活性[45]。肌肉與骨量之間關系密切，已有大量研究表明肌肉活動在保持骨形成和骨吸收之間的平衡方面起著至關重要的作用[46，47]。Qin等人用肌肉生長抑制素處理的Ocy454細胞(一種骨細胞)產(chǎn)生的外泌體與成骨細胞相接種，發(fā)現(xiàn)肌肉生長抑制素能夠降低外泌體內(nèi)miR-218的含量，使成骨細胞分化的能力降低，這或許可以作為肌肉與骨之間新的通訊機制[48]。

6 小結與展望

自從外泌體的發(fā)現(xiàn)直到2013年諾貝爾醫(yī)學獎授予細胞囊泡運輸調(diào)控系統(tǒng)后，外泌體的研究就從未中斷過。由于外泌體特殊的生物學特性，其在疾病的診斷和治療上提供了許多新的研究靶點。通過對全文的小結，我們可以發(fā)現(xiàn)這種骨源性外泌體調(diào)節(jié)骨代謝的機制十分復雜，例如破骨細胞分泌的外泌體能夠抑制成骨細胞的分化能力，但同樣的破骨細胞分泌的外泌體也能抑制破骨細胞的分化能力[49]，而成骨細胞分泌的外泌體不僅能夠增強或抑制其成骨分化能力，同樣的其還能夠增強或抑制破骨細胞的分化能力。

從以往的研究中可以發(fā)現(xiàn)骨的生長不僅與成骨細胞、破骨細胞、間充質(zhì)骨細胞等細胞有關，而且與細胞因子、內(nèi)皮細胞、血管生成、甲狀旁腺激素(PTH)、甲狀腺激素，類固醇、維生素D、生長因子等因素密切相關[50]，有研究表明MSCSs分泌的外泌體能夠使血管內(nèi)皮細胞增殖及VEGF上升，通過增加血管形成的方式從而刺激骨的生長及再生[51]。

在過去，骨量減少或骨質(zhì)疏松癥等疾病的研究主要集中在刺激相關細胞功能上，但是對于細胞與細胞之間的通訊沒有很好的研究，而外泌體通過囊泡傳輸系統(tǒng)將不同的細胞相互關聯(lián)，進行物質(zhì)及信息的轉(zhuǎn)運及傳輸，從而調(diào)控相關細胞的增殖與分化。因此，能夠使成骨細胞增殖分化的外泌體可以成為治療骨量減少或骨質(zhì)疏松癥的潛在靶點。

到目前為止，物質(zhì)從細胞內(nèi)的選擇性的轉(zhuǎn)運至外泌體內(nèi)的具體機制還是一個未解之謎，并且同種細胞分泌的外泌體其內(nèi)含物也可能由于時間等因素的作用而不盡相同，但是，由于外泌體特殊的納米級生物膜結構，并能夠避免體內(nèi)大部分的免疫排斥反應，因此在未來可能成為臨床上診斷和治療骨硬化病、骨量減少和骨質(zhì)疏松癥等疾病的新方向。