基于Wnt/β-catenin信號通路的中醫(yī)藥干預(yù)骨關(guān)節(jié)炎的研究進展

謝晚晴 鄭洪新

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，沈陽 遼寧 110847

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是由于增齡、肥胖、勞損、創(chuàng)傷等諸多因素引起的退行性骨關(guān)節(jié)病，是由于關(guān)節(jié)退行性改變導(dǎo)致軟骨、滑膜、關(guān)節(jié)囊等結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的慢性無菌性炎癥。本病發(fā)病機制尚未明確，患者病變嚴(yán)重階段活動受限，生存質(zhì)量降低，除關(guān)節(jié)置換無其他有效的治療手段。Wnt/β-catenin信號通路可以調(diào)節(jié)胚胎期軟骨發(fā)育,以及出生后關(guān)節(jié)軟骨的成熟、分化以及凋亡,對軟骨外基質(zhì)分解代謝亦有著重要的作用[1,2]。因此,目前的研究認(rèn)為Wnt/β-catenin信號通路可能是導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎的重要信號通路之一[3]。

1 Wnt/β-catenin信號通路

Wnt家族由許多富含半胱氨酸的小型分泌蛋白組成,主要參與調(diào)控多種重要的細胞活動，包括胚胎發(fā)育、細胞遷移及細胞分化等[4-6]。Wnt通路激活了4個細胞內(nèi)途徑，本文關(guān)注的是經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路。Wnt/β-catenin 信號通路激活起始于Wnt蛋白與其受體復(fù)合物結(jié)合，受體復(fù)合物包括低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LRP)5,6 以及卷曲蛋白(Fz)家族。二者結(jié)合后，細胞內(nèi)散亂蛋白(Dvl)活化，軸蛋白(Axin)與 LPR 5 或 LRP 6 的胞質(zhì)尾區(qū)結(jié)合。 Axin的關(guān)鍵組成是糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)，因此信號通過 Dvl 抑制 GSK-3β 活性， 抑制 β-catenin 的分解并在細胞內(nèi)聚集，促使β-catenin入核，進而與轉(zhuǎn)錄因子(TCF)/淋巴增強因子(LEF)結(jié)合，調(diào)節(jié) cyclin D1、cmyc 等數(shù)個靶基因的表達[7,8]。而當(dāng)缺少Wnt蛋白啟動因子刺激時，β-catenin與Axin，APC，GSK3等形成復(fù)合體，β-catenin被CK1 和GSK-3β磷酸化，細胞質(zhì)中游離狀態(tài)的β- catenin減少，導(dǎo)致細胞核中的 Wnt 靶基因轉(zhuǎn)錄被抑制[9]。除正向啟動子，Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路中還有一些重要的負(fù)向調(diào)節(jié)因子[10]。最常見的三個為抑制因子 Dickkopf 1(DKK 1)，硬化蛋白(sclerostin，SOST)和分泌型 Fz相關(guān)蛋白(sFRP)。DKK 1可結(jié)合 LRP 5 和DKK 1 受體 Kremen，進而抑制和降解三元絡(luò)合物；SOST可結(jié)合 LRP 5從而阻止其與 Wnt 結(jié)合；sFRP可結(jié)合 Wnt，阻止其與受體復(fù)合物結(jié)合。

2 中醫(yī)藥通過調(diào)控Wnt/β- catenin信號通路干預(yù)骨關(guān)節(jié)炎的研究

2.1 中醫(yī)藥通過調(diào)控Wnt/β- catenin信號通路干預(yù)軟骨細胞的研究

軟骨細胞在關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)合成軟骨基質(zhì)，是關(guān)節(jié)軟骨中分泌II型膠原蛋(Collagen II)與聚集蛋白聚糖(Aggrecan)的唯一細胞,所以軟骨細胞的退變程度決定OA的病理變化[11]。近期研究發(fā)現(xiàn), Wnt/β- catenin信號通路失調(diào)可以導(dǎo)致軟骨細胞增殖、分化及凋亡的異常，從而出現(xiàn)軟骨的破壞，導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。而這種失調(diào)分為兩種，一種是指軟骨細胞中β-catenin的過表達導(dǎo)致未成熟軟骨分化、成熟和軟骨基質(zhì)降解。研究發(fā)現(xiàn)建立軟骨細胞過表達β- catenin基因的小鼠模型,發(fā)現(xiàn)該小鼠會出現(xiàn)下頜關(guān)節(jié)炎、腰椎間盤關(guān)節(jié)炎及膝骨關(guān)節(jié)炎等表現(xiàn)，模型鼠的關(guān)節(jié)軟骨全層缺失、軟骨下骨區(qū)有新的編織骨形成，軟骨組織表面纖維化、出現(xiàn)垂直的裂隙、軟骨贅和骨贅的形成[12-14]。同時，亦有研究[15]指出OA患者血清中的β-catenin是上調(diào)的，退變的軟骨細胞內(nèi)β-catenin增多。另一種失調(diào)是指軟骨細胞β- catenin信號被抑制，導(dǎo)致軟骨細胞凋亡，關(guān)節(jié)軟骨破壞。Zhu等[16]研究發(fā)現(xiàn)抑制軟骨細胞中β-catenin能導(dǎo)致軟骨細胞凋亡和關(guān)節(jié)軟骨破壞,而且軟骨的破壞與年齡相關(guān)。由此可見，Wnt/β-catenin信號通路可能參與軟骨細胞的增殖、分化，而在骨關(guān)節(jié)炎患者及動物模型中Wnt/β-catenin信號通路是被激活的。

1)單味中藥提取物

中藥以補腎、活血藥為主，包括姜黃素、牛膝多肽、淫羊藿素、補骨脂素、龍須藤多肽等，這些中藥的提取物通過激活Wnt/β-catenin通路促進軟骨細胞增殖。如盛旭飏[17]和馬勇[18]等研究證明姜黃素通過上調(diào)Wnt2，β-catenin并下調(diào)GSK-3β，激活Wnt通路促進軟骨細胞的增殖。然而陳瓊[19]等對姜黃素的研究結(jié)果與上述研究結(jié)果相反，認(rèn)為姜黃素對人關(guān)節(jié)炎軟骨細胞和正常人軟骨細胞增殖具有明顯抑制作用，并且對關(guān)節(jié)炎軟骨細胞中的MMP-13、IL-6具有抑制作用。還有研究顯示牛膝多肽[20]、補骨脂素[21]、龍須藤多肽[22]能夠上調(diào)Wnt4、Frizzled-2、β-catenin 和cyclin D1, 并下調(diào)GSK-3β，從而激活Wnt通路促進軟骨細胞的增殖，同時能夠增加軟骨細胞中二型膠原蛋白表達。這些研究者可能考慮，當(dāng)關(guān)節(jié)炎出現(xiàn)軟骨受損的情況，促進軟骨細胞增殖可以緩解部分癥狀。然而Church等[23]研究發(fā)現(xiàn)在軟骨細胞成熟分化階段，Wnt 4過表達會持續(xù)激活Wnt/β-catenin 信號通路并導(dǎo)致生長板軟骨細胞肥大，加速軟骨細胞的終末分化[24]，因此成年小鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞Wnt/β-catenin 信號通路的激活可能會因軟骨細胞過早分化而導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎的加重[25]。

2)中藥成方

中藥成方多為補腎或補腎活血方，如骨痹通方[26]可能通過抑制 Wnt5a與β-catenin 的表達，延緩白介素1β誘導(dǎo)的軟骨細胞凋亡。透骨消痛膠囊[27]含藥血清可能通過下調(diào)Wnt4，上調(diào)GSK-3β協(xié)同降低大鼠軟骨細胞的β-catenin表達，抑制TNF-α誘導(dǎo)的軟骨細胞凋亡。另有研究證明透骨消痛膠囊[28]及其拆方可下調(diào)Wnt 4、β-catenin、MMP13的表達，對白細胞介素 1β誘導(dǎo)的軟骨細胞具有協(xié)同保護作用。陳秀明[29]等證明壯骨健膝方含藥血清對IL-1β誘導(dǎo)的退變軟骨細胞有保護作用,可能與促進GSK-3、DKK-1, sFRP-3的表達,使進入核內(nèi)的β-catenin減少,從而抑制Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)。

這些研究均證實與正常軟骨細胞相比，經(jīng)炎性因子誘導(dǎo)的軟骨細胞中的β-catenin表達增多，這些中藥成方可能通過下調(diào)WNT4、WNT5蛋白或β-catenin從而下調(diào)Wnt/β-catenin信號通路或其下游靶基因起到保護軟骨細胞的作用。

2.2 中醫(yī)藥通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路干預(yù)滑膜細胞的研究

大部分對骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機制的研究主要針對關(guān)節(jié)軟骨和軟骨細胞的病理改變，對關(guān)節(jié)滑膜的炎性改變并未重視，甚至認(rèn)為它只是骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中的繼發(fā)性改變[30]。然而近年來隨著研究的深入，有學(xué)者認(rèn)為滑膜炎癥在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展過程中起重要作用，并且其嚴(yán)重程度與OA進展程度存在相關(guān)性[31]。因此，滑膜有望成為治療骨關(guān)節(jié)炎的新靶點[32]。

作者檢索到的研究均采用中藥成方作為干預(yù)手段，其中針對補腎活血方有三個研究，宋鵬飛[33]等采用 GSK-3β選擇性抑制劑作用于正常人滑膜細胞以激活Wnt/β-catenin 信號通路，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MMP-2、MMP-7 和 MMP-9、β-catenin和Cyclin D1都顯著升高，證明補腎活血方能明顯下調(diào)滑膜細胞核蛋白β-catenin、MMP-7和Cyclin D1的表達。袁琴[34]等研究證明補腎活血方能明顯下調(diào)大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎滑膜細胞中MMP-7、胞核β-catenin 的表達。肖志鋒[35]等研究證明補腎活血方可以抑制滑膜細胞Wnt/β-catenin信號通路，下調(diào)共培養(yǎng)體系中MMP-7,CTX-Ⅱ,COMP的表達，減輕異?；ぜ毎麑浌羌毎膿p害，減緩軟骨基質(zhì)的降解，有利于骨關(guān)節(jié)炎的緩解和恢復(fù)。另外，趙婧[36]等研究表明祛痰化瘀利濕方能夠明顯下調(diào)人滑膜細胞 β-catenin、Cyclin D1、MMP-7的表達，提示從單一信號通路方面可闡釋祛痰化瘀利濕方治療骨性關(guān)節(jié)炎的分子作用機制。

由上述研究中可見，關(guān)節(jié)滑膜炎癥產(chǎn)生的炎性遞質(zhì)既可以直接作用于關(guān)節(jié)軟骨，還可以作用于調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨代謝的一些細胞因子和蛋白酶，一方面直接導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，破壞和降解軟骨基質(zhì)，另一方面，使一些細胞因子和蛋白酶發(fā)生理化作用，加速關(guān)節(jié)退變的過程[37-39]。

2.3 中醫(yī)藥通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路干預(yù)骨關(guān)節(jié)炎動物模型的研究

除體外實驗外，還有部分研究者運用不同手段制備骨關(guān)節(jié)炎動物模型，運用中醫(yī)藥療法對其進行干預(yù)，研究其對Wnt信號通路的作用，使得研究更加貼近臨床。

1)中藥單體

曾麗[40]等采用Hulth 法建立大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎(KOA)動物模型，給予中藥單體淫羊藿苷干預(yù)，發(fā)現(xiàn)其能下調(diào)大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎模型軟骨組織 MMP-1、MMP-3、MMP-13、P-p38、P-ERK1/2、P-JNK 及β-catenin的蛋白表達水平，改善大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎(KOA)動物模型軟骨組織，并且對軟骨細胞有一定保護作用。高堪達等[41]用前交叉韌帶切除法(ACLT)建立小鼠骨關(guān)節(jié)炎模型，亦給予淫羊藿苷干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷能顯著降低軟骨MMP-1、MMP-3、MMP-8和MMP-13及Adamte5,IL-1b和TNF-α的mRNA表達。

有研究認(rèn)為，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)、聚蛋白多糖酶(aggrecanases)，這兩種蛋白酶對關(guān)節(jié)軟骨主要基質(zhì)成分Ⅱ型膠原以及蛋白多糖的降解是導(dǎo)致OA 產(chǎn)生的主要原因[42]這兩種基因可被Wnt信號通路調(diào)節(jié)，屬于Wnt信號通路下游靶基因。其中基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-9、MMP-13 均可發(fā)揮降解軟骨基質(zhì)所有成分的作用；研究發(fā)現(xiàn)，MMP-1、MMP-8、MMP-13 能夠高效降解膠原纖維Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，其中 MMP-13 是促進基質(zhì)降解的關(guān)鍵酶，尤其對Ⅱ型膠原有優(yōu)先消化作用。而聚蛋白多糖酶ADAMTS-4和 ADAMTS-5可促進蛋白聚糖的分解代謝。上述研究也有通過下調(diào)這兩種蛋白酶，抑制其對Ⅱ型膠原以及蛋白多糖的降解，起到治療OA的作用。

2)中藥成方

中藥成方主要通過下調(diào)Wnt信號正向調(diào)節(jié)因子Wnt蛋白或β-catenin，從而抑制Wnt信號下游通路靶基因基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)、聚蛋白多糖酶(aggrecanases)?；蛲ㄟ^上調(diào)負(fù)調(diào)節(jié)因子DKK1和SOST，從而抑制Wnt/β-catenin信號通路。

調(diào)控正向調(diào)節(jié)因子的中藥成方有骨靈膏[43]及其拆方，該方可對冷固法誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎大鼠模型有保護作用，可以明顯下調(diào) Wnt2、β-catenin、LRP-5 蛋白表達，進而抑制MMP-13對軟骨ECM的降解。吳追樂[44]等采用木瓜蛋白酶雙膝關(guān)節(jié)腔注射準(zhǔn)備OA大鼠模型，結(jié)果顯示透骨消痛膠囊能降低軟骨中 Wnt-4、β-catenin以及MMP-13及ADAMTS-5的含量的表達。鄭文偉[45]等采用改良Hulth法建立OA動物模型，結(jié)果顯示跳骨片能降低滑膜中 Wnt-4、β-catenin 以及 MMP-13含量。梁祖建[46]等通過切除雙側(cè)卵巢并切斷右側(cè)膝交叉韌帶建立骨關(guān)節(jié)炎動物模型，結(jié)果顯示W(wǎng)nt2、β-catenin、GSK-3β在模型組中表達明顯增強，補腎活血中藥能下調(diào)Wnt2、β-catenin、GSK3β的表達。闞衛(wèi)兵[47]等采用Hulth法建立家兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型，采用 Affymetrix Rat 230 2．0 Array 芯片檢測滑膜組織的基因表達變化，結(jié)果顯示模型組滑膜組織 MMP2、MMP3、MMP7、MMP9、MMP12 表達明顯高于正常組滑膜組織，補腎活血方及自擬補腎活血方[48]對其有明顯下調(diào)作用。李翠葳[49]等采用改良 Hulth 法構(gòu)建大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎模型，結(jié)果顯示模型組Wnt4 水平升高，WIF1水平下降，而益氣養(yǎng)血方能逆轉(zhuǎn)這兩個Wnt蛋白的含量。豐哲[50]等采用石膏伸直位固定8周法制作兔膝骨關(guān)節(jié)炎(0A)模型，獨活寄生湯通過下調(diào)wnt3a、β-catenin，抑制MMP13對軟骨基質(zhì)的降解，從而發(fā)揮軟骨保護作用。

調(diào)控負(fù)向調(diào)節(jié)因子的研究有吳海華[51]等采用改良膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射木瓜蛋白酶法制作大鼠OA模型，發(fā)現(xiàn)DKK-1在OA中的表達顯著高于正常組，并且DKK-1含量隨病程的進展逐漸增加。消骨痛湯通過抑制IL-1β及DKK-1的表達，緩解OA病情進展。

3)電針、針刀、超聲波及針刺療法

目前的干預(yù)手段除了中藥療法還有電針、針刀、超聲波及針灸療法，直接作用于Wnt/β-catenin信號通路的研究有，李洪濤[52]等證明電針可能是通過下調(diào) Wnt3a、β-catenin 蛋白表達、抑制 Wnt 信號通路，進而保護受損的關(guān)節(jié)軟骨，改善膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎大鼠的關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)和功能狀態(tài)。艾海波[53]等證明電針治療能減輕關(guān)節(jié)軟骨的受損程度，其機制可能與降低軟骨細胞中β-catenin 的表達，進而間接抑制其下游炎性基因轉(zhuǎn)錄有關(guān)。

其他研究均是對Wnt信號通路下游靶基因基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)有調(diào)節(jié)作用，如李衛(wèi)平[54]等證明超聲波和電針治療均能降低KOA兔軟骨中MMP-1的表達。鄭秀存[55]等亦發(fā)現(xiàn)針刺、電針和溫針能不同程度降低MMP-1表達。劉苗苗[56]等證明電針下調(diào)對膝骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠滑膜組織中MMP-3。蹇睿[57]等發(fā)現(xiàn)電針能減少兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型的MMP-13表達, 可促使兔骨關(guān)節(jié)炎模型軟骨細胞重新排列，對OA治療有一定作用。

2.4 中醫(yī)藥通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路干預(yù)骨關(guān)節(jié)炎臨床研究

有少量研究者觀察了中醫(yī)藥對膝骨關(guān)節(jié)炎患者的作用，進一步從臨床角度證明中醫(yī)藥調(diào)控Wnt/β-catenin通路可能是防治骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵。臨床研究干預(yù)手段有中藥成方、電針或中藥配合針灸療法，但是由于倫理的限制等原因，所以臨床研究數(shù)量較少。中藥干預(yù)研究有唐萌芽[58]等納入膝骨關(guān)節(jié)炎患者30 例，采用補腎活血中藥治療膝骨關(guān)節(jié)炎，能改善膝關(guān)節(jié)功能，緩解患者疼痛，降低患者靜脈血中Wnt-5a、β-catenin、BMP-2 mRNA表達量。詹宏鋼[59]等納入42例膝骨關(guān)節(jié)炎患者,予獨活寄生湯治療12周，同樣證明發(fā)現(xiàn)獨活寄生湯能通過降低患者靜脈血中Wnt-5a、β-catenin、BMP-2 mRNA表達量,發(fā)揮保護關(guān)節(jié)軟骨、緩解疼痛的治療效果。電針研究有諸劍芳[60]等入組60例老年膝關(guān)節(jié)炎患者，將其隨機分為電針組和西藥組，治療四周后，電針組與治療前自身相比，血清 MMP-3值下降。中藥配合針灸治療有潘明柱[61]等選取風(fēng)寒濕痹型關(guān)節(jié)炎患者112例，其中56例給予溫經(jīng)通絡(luò)湯聯(lián)合針灸治療，對照組給予塞來昔布聯(lián)合來氟米特治療，結(jié)果顯示溫經(jīng)通絡(luò)湯結(jié)合針灸治療風(fēng)寒濕痹型關(guān)節(jié)炎療效顯著，其可下調(diào)Wnt-3a，β-catenin，BMP-2 表達，緩解關(guān)節(jié)疼痛及改善關(guān)節(jié)功能。還有分不同證型進行基礎(chǔ)研究的喬斌[62]等選取膝骨關(guān)節(jié)炎患者20例，其中非陽虛質(zhì)膝骨關(guān)節(jié)炎患者10例，陽虛質(zhì)膝骨關(guān)節(jié)炎患者10例，正常非膝骨關(guān)節(jié)炎健康志愿者對照組10例，膝骨關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)組織中β-catenin、MMP13表達均上調(diào)。

3 展望

近十年來中醫(yī)藥通過基礎(chǔ)研究和臨床研究對骨關(guān)節(jié)炎分子機制的闡明做了很大貢獻，并且中醫(yī)藥對骨關(guān)節(jié)炎的療效確切、治法多樣。本文總結(jié)了基于Wnt/β-catenin信號通路的中醫(yī)藥干預(yù)骨關(guān)節(jié)炎的研究進展，結(jié)論如下：1)目前有效的中醫(yī)藥治療手段包括中藥內(nèi)服和中醫(yī)外治，內(nèi)服中藥包括單味中藥提取物、經(jīng)典成方、臨床效方。中醫(yī)外治法包括針刺、電針、溫針、小針刀和超聲波療法。2)中醫(yī)藥調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin通路的途徑包括：上調(diào)Wnt蛋白及Wnt通路關(guān)鍵因子β-catenin促進軟骨細胞增殖；下調(diào)Wnt蛋白及Wnt通路關(guān)鍵因子β-catenin，抑制在骨關(guān)節(jié)炎模型組過表達的Wnt/β-catenin通路，從而下調(diào)其下游靶基因基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)和聚蛋白多糖酶(aggrecanases)，抑制其對Ⅱ型膠原以及蛋白多糖的降解，起到治療OA的作用。

相關(guān)研究越來越多，但是仍存在一些問題：1)針對不同疾病，相同的中醫(yī)藥療法可激活亦可抑制Wnt/β-catenin 信號通路，這有可能說明中醫(yī)藥對該通路可能有雙向調(diào)節(jié)作用，但這個理論還有待進一步研究。2)有些文獻中評價Wnt/β-catenin信號通路是否被激活或抑制的證據(jù)不足，不能充分證明β-catenin是否入核，該信號通路是否真正被激活或者抑制。3)關(guān)于中醫(yī)藥調(diào)控 Wnt/β-catenin信號通路在骨代謝中的詳細作用機制還有待深入探討，如Wnt家族中其他蛋白或非經(jīng)典Wnt信號通路是否參與此過程，以及該通路與 BMP、Notch、FGF、MAPK 等其他信號通路之間是否有交互作用。4)現(xiàn)階段的干預(yù)手段多局限于單味中藥或含藥血清，因為中藥復(fù)方的成分復(fù)雜，有效成分難以分離、提取，這些問題阻礙了中醫(yī)藥基礎(chǔ)研究的進展。

相信隨著實驗手段的發(fā)展和對Wnt/β-catenin信號通路調(diào)控骨關(guān)節(jié)炎作用機制的逐漸闡明，針對 Wnt/β-catenin 信號通路的靶點治療可能成為骨關(guān)節(jié)炎治療的突破點，并推動中醫(yī)藥防治骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展。