Runx2基因參與骨代謝相關(guān)通路的研究進(jìn)展

陳偉健 晉大祥 謝煒星 溫龍飛 李鉞 任東成 丁金勇 詹曉歡 許偉鵬 黃永青

1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510405 2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405

1 Runx2的介紹

Runx2稱為核心結(jié)合因子 a1或多瘤病毒增強(qiáng)子結(jié)合蛋白及急性骨髓性白血病因子 3，屬于 runt 結(jié)構(gòu)域基因家族成員之一。目前人類發(fā)現(xiàn)該家族有三個(gè)成員，即Runx1、Runx2、Runx3。其中與骨代謝密切相關(guān)的是Runx2。Runx2 基因根據(jù)起始氨基酸序列的不同分為 3 種蛋白異構(gòu)體，分別是 Cbfal/P56(I 型 Runx2)， Cbfal/P57(Ⅱ型 Runx2) 和Osf2/Cbfa1(Ⅲ型Runx2)。雖然它們的 3’端與 runt 結(jié)構(gòu)域一樣，但 5’端即 N 端序列則不同，介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控也不同。Runx2 作為一種成骨分化特異性轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào)控眾多基因的轉(zhuǎn)錄。Runx2 表達(dá)是間質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞譜系分化的必要和充分條件，成骨細(xì)胞早期分化主要受Runx2的轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控，成骨細(xì)胞(osteoblast,OB) Runx2缺失，其分化完全被抑制，不發(fā)生骨膜成骨和軟骨內(nèi)成骨。研究[1,2]認(rèn)為，在成骨細(xì)胞分化的初期，Runx2基因觸發(fā)骨基質(zhì)蛋白的形成，如I型膠原、骨橋蛋白、骨鈣素和骨涎蛋白等，但同時(shí)又使成骨細(xì)胞維持在較早期階段而阻止其進(jìn)一步分化，Runx2的作用是提供大量的未成熟OB。

2 Runx2在骨代謝相關(guān)作用信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程。第一，骨祖細(xì)胞分化為成骨前體細(xì)胞，形成成熟OB。成熟OB可以分泌各種細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)和礦化ECM。在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過(guò)程中，存在多種信號(hào)通路調(diào)控成骨分化過(guò)程[3]，其中Runx2是重要的成骨轉(zhuǎn)錄因素，在早期成骨分化起決定性作用并已成為其分化標(biāo)志物。一些信號(hào)通路和細(xì)胞因子參與細(xì)胞分化，而成骨微環(huán)境也影響成骨分化。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)Runx2參與這些通路，與之密切相關(guān)的信號(hào)通路有TGF-β/BMP信號(hào)通路、Notch信號(hào)通路及Wnt信號(hào)通路，Runx2在這些通路中充當(dāng)一個(gè)連接點(diǎn)[4]。

2.1 Runx2與TGF-β/BMP信號(hào)通路

BMP是TGF-β家族的成員之一。這種從骨提取的細(xì)胞外因子是骨形態(tài)發(fā)生最早期的信號(hào)分子，其中與骨形成最密切相關(guān)的是BMP-2。BMP可通過(guò)增加OB分化標(biāo)志酶-堿性磷酸酶的活化和骨鈣蛋白等基因的表達(dá)，誘導(dǎo)未分化的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化成骨，并可促進(jìn)OB成熟TGF-β/BMP信號(hào)通路包括I型和II型絲氨酸蘇氨酸激酶受體激活，從而磷酸化細(xì)胞內(nèi)Smad蛋白[5]。BMP可通過(guò)內(nèi)分泌和旁分泌方式誘導(dǎo)成骨。細(xì)胞外BMP可能與磷酸化受體(如BMPR-IA和BMPR-IB)來(lái)激活骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞下游細(xì)胞因子包括Smad1/5 /8，絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)，使信號(hào)通路激活。

這些途徑中，Smad1/5/8信號(hào)通路是一個(gè)典型的成骨相關(guān)通路。Smad1、Smad 5通過(guò)與I型和II型絲氨酸蘇氨酸激酶受體結(jié)合后直接磷酸化，接著與2個(gè)或1個(gè)R-Smad 和 1 個(gè)Smad 4 以異源三聚體或異源二聚體的形式形成Smads復(fù)合物，然后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)。這種復(fù)合物可能與核內(nèi)Runx2協(xié)作或單獨(dú)作用誘導(dǎo)成骨相關(guān)基因表達(dá)，調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化[6]。Smads復(fù)合物可以識(shí)別并結(jié)合到Runx2在C端的Smad結(jié)合區(qū)域(Smad interacting domain，SMID)和核基質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)結(jié)合位點(diǎn)(nuclear matrix targeting signal，NMTS)起作用，顯著增加Runx2的轉(zhuǎn)錄特異性，增加Runx2的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[7]。Dai等[8]研究證實(shí)金雀異黃素可通BMP2/SMAD5/RUNX2通路促進(jìn)成骨分化。Smad復(fù)合物也能激活JunB(Runx2上游因子)間接地激活Runx2的表達(dá)。該通路被Smad6、7負(fù)反饋調(diào)控，Smad6、7 從細(xì)胞核進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，與Ⅰ型受體結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性干擾Smad1/5/8募集和磷酸化，并同時(shí)抑制Smad復(fù)合物形成和活性。Smad6、7可與泛素化連接酶Smurf E3 相作用，使其結(jié)合到Ⅰ型受體，導(dǎo)致受體降解，終止信號(hào)傳導(dǎo)[9]。這些途徑都間接抑制Runx2表達(dá)。

MAPK是一組絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，MAPK信號(hào)通路則是一個(gè)非典型的BMP信號(hào)通路，MAPK通路主要包括 MAPK激酶激酶(MAP kinase ki-nase kinase,MKKK)、MAPK 激酶(MAP kinase kinase，MKK)和 MAPK，這三種激酶能依次激活，其中MAPK 由胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1 (extracellular signal-related kinase 1，ERK1)、ERK 2、p38 MAPK、JNK和 ERK5 等組成。 ERK和 p38 MAPK可促進(jìn)Runx2磷酸化，誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化。在近年人和大鼠骨髓間充質(zhì)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)力學(xué)信號(hào)傳導(dǎo)可通過(guò)MAPK信號(hào)通路轉(zhuǎn)變成生物學(xué)信號(hào)，使Runx2磷酸化，促進(jìn)成骨，進(jìn)一步解釋力學(xué)刺激如何在增加骨密度和強(qiáng)度方面起重要的作用，Runx2 基因表達(dá)的增強(qiáng)更被認(rèn)為是力學(xué)刺激在成骨細(xì)胞內(nèi)作用的“終點(diǎn)”[1]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-C(vascular endothelial growth factor-c，VEGF-C)對(duì)骨缺損修復(fù)具有潛在的治療價(jià)值。研究發(fā)現(xiàn)VEGF-C干預(yù)能顯著增加Runx2的表達(dá)，促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞礦化的。進(jìn)一步研究知道，VEGF-C誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的VEGFR2和VEGFR3的磷酸化。此外，抑制ERK信號(hào)通路有效地抑制VEGF-C誘導(dǎo)Runx2表達(dá)。這些結(jié)果表明，VEGF-C是通過(guò)VEGFR2和VEGFR3介導(dǎo)，以及激活ERK信號(hào)通路促進(jìn)Runx2表達(dá)，誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨的[10]。胰島素樣生長(zhǎng)因子又稱生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素，能激活ERK1/2，進(jìn)而激活MAPK通路，使Runx2 的活性增加，Runx2 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，對(duì)骨形成有很強(qiáng)的促進(jìn)作用，但阻斷MAPK通路后，可完全阻斷對(duì)Runx2 的作用。越來(lái)越多的證據(jù)發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞分泌大量的生長(zhǎng)因子如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2、類胰島素生長(zhǎng)因子-1等可通過(guò)MAPK通路來(lái)調(diào)節(jié)Runx2的表達(dá)[11]。而腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)抑制成骨的機(jī)制也正是通過(guò)該通路。TNF-α/IL-1β在MAPK信號(hào)通路上可能結(jié)合并激活p38, ERK1/2和JNK1/2，抑制Runx2的表達(dá)，從而抑制成骨。Huang等[2]研究證實(shí)TNF-α/IL-1β可激活MAPK通路減少BMP-2誘導(dǎo)Runx2的表達(dá)，導(dǎo)致成骨分化抑制。

2.2 Runx2與Notch信號(hào)通路

Notch信號(hào)通路包括Notch配體(DSL 蛋白)，Notch受體，CSL-DNA 結(jié)合蛋白和Notch效應(yīng)分子。Notch信號(hào)通路是一種保守的信號(hào)傳導(dǎo)通路，參與多種細(xì)胞過(guò)程。當(dāng)Notch配體結(jié)合其受體，Notch信號(hào)通路被激活，Notch受體被酶切于細(xì)胞膜外，然后釋放出與Notch配體連接的胞外部分，隨后在γ-分泌酶作用下胞內(nèi)段被酶切，形成可溶性的NICD(notch intracellular domain，NICD)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子CSL，形成NICD/CSL轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合物，然后激活下游靶基因主要以-HES家族成員為主，包括HES1，HES5，HEY1等，發(fā)揮相應(yīng)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)[12]。Notch信號(hào)通路既能促進(jìn)成骨分化也能抑制成骨分化。目前許多學(xué)者認(rèn)為，Notch的成骨潛能可能會(huì)隨時(shí)間變化的，Notch信號(hào)通路在早期成骨分化階段可能起促進(jìn)作用，而在后期成骨分化階段卻抑制成骨分化，以此來(lái)維持骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞未分化狀態(tài)，促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖，增加干細(xì)胞池的細(xì)胞，提高其成骨潛能[13-14]。在Notch信號(hào)通路中，受體Notch-1和配體Jagged-1蛋白的表達(dá)增加，Notch信號(hào)通路被激活，進(jìn)而促進(jìn)Runx2表達(dá)增高，促進(jìn)成骨分化。內(nèi)源性甲狀旁腺素(parathyroid hormone，PTH)是一種由甲狀旁腺分泌的多肽類激素， PTH 在骨形成中有重要作用。研究[15]發(fā)現(xiàn)PTH可提高骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中Notch信號(hào)通路表達(dá)，通過(guò)Jagged1/Notch1通路，使Runx2表達(dá)增高，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，增強(qiáng)成骨細(xì)胞功能。Notch信號(hào)通路介導(dǎo)抑制成骨分化時(shí)，HEY與HES的效應(yīng)分子可結(jié)合到Runx2，并抑制其轉(zhuǎn)錄活性，抑制成骨分化。相反，Runx2 的N-末端結(jié)構(gòu)域能與Notch1的N-末端結(jié)構(gòu)域結(jié)合并使Notch1-IC-RBP-Jk復(fù)合物分離，抑制Notch1的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，在成骨分化過(guò)程中作為Notch信號(hào)通路的一個(gè)抑制因子[16]。

2.3 Runx2和Wnt信號(hào)通路

Wnt家族屬于原癌基因，由至少19個(gè)保守的分泌糖蛋白組成。根據(jù) Wnt 蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)的方式， Wnt 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可分為經(jīng)典 Wnt 信號(hào)通路和非經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路。在經(jīng)典Wnt信號(hào)通路中，Wnt與Frizzled受體結(jié)合并募集LRP5/ 6受體，形成復(fù)合體促進(jìn) GSK-3β磷酸化，抑制細(xì)胞內(nèi)糖原合成酶激酶β的活性，阻斷β-連環(huán)蛋白(β-catenin)降解，導(dǎo)致β-catenin積累。積累的β-catenin轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，激活TCF/LEF轉(zhuǎn)錄。非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路則是獨(dú)立的β-catenin，磷脂酶C(phospholipase C, PLC)和蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)可能釋鈣進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)發(fā)揮作用。Wnt信號(hào)通路具有強(qiáng)大的誘導(dǎo)成骨功能。Wnt3a和Wnt 10 a可激活經(jīng)典Wnt信號(hào)通路，而Wnt4a和Wnt 5 a可激活非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路。這兩種途徑均可促進(jìn)Runx2表達(dá)，促進(jìn)成骨分化，抑制Wnt信號(hào)通路能抑制骨形成[17,18]。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 -2(Fibroblast growth factor-2，F(xiàn)GF-2)除了ERK信號(hào)通路，還能通過(guò) PKC信號(hào)通路來(lái)激活Runx2和誘導(dǎo)其表達(dá)，因此被認(rèn)為是Runx2的靶基因[19]。Cai等[20]研究發(fā)現(xiàn)Wnt /β-catenin信號(hào)通路能直接調(diào)節(jié)Runx2基因在高磷環(huán)境下表達(dá)促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞成骨分化。Wnt信號(hào)通路對(duì)Runx2的不同影響可能與不同的細(xì)胞類型和不同分化階段相關(guān)。如OB在FGF-2長(zhǎng)期作用下，其礦化被明顯抑制[21]。

綜上所述，Runx2能通過(guò)參與TGF-β/BMP信號(hào)通路、Notch信號(hào)通路及Wnt信號(hào)通路調(diào)節(jié)骨代謝，對(duì)骨代謝及骨重塑研究具有十分重要的意義。但Runx2的研究仍處于初級(jí)階段，對(duì)其精確的調(diào)節(jié)機(jī)制也未完全清楚，并且在多種骨代謝通路下發(fā)現(xiàn)參與調(diào)節(jié)骨代謝的Runx2在骨形成有促進(jìn)作用也有抑制作用，具體機(jī)理也未完全清楚。探究Runx2在骨形成方面雙向調(diào)節(jié)的具體機(jī)理和影響因素，如何提高促進(jìn)OB分化及避免抑制OB分化，是今后防治骨質(zhì)疏松癥的藥物研究的一個(gè)方向和熱點(diǎn)。