有性雜交結(jié)合胚挽救在無核葡萄育種上的應(yīng)用

梁樹樂，李林，劉少杰，遲曉紅，閻立江

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)煙臺研究院，山東煙臺264670）

目前無核葡萄深受消費(fèi)者喜愛，可以鮮食，也可加工成葡萄干，大粒、無核是國內(nèi)外葡萄育種的重要目標(biāo)。由于無核品種的合子胚在發(fā)育進(jìn)程中容易發(fā)生敗育，傳統(tǒng)的無核葡萄育種方法，只能以有核品種做母本，無核品種作父本，獲得有發(fā)芽力的雜交種子，但這種雜交方式，無核后代較少，育種效率很低。為防止育種效率的降低，通過對植物胚離體培養(yǎng)進(jìn)行胚挽救，使得植物胚在適宜的離體培養(yǎng)條件下獲得再生植株。利用胚培養(yǎng)技術(shù)，可以用無核葡萄作母本進(jìn)行雜交，獲得的合子胚在其敗育前進(jìn)行人工離體培養(yǎng)，促使胚萌發(fā)成苗，不僅獲得的胚挽救苗無核性狀比率高（45%～82%），而且試驗(yàn)去除了中間母本和第二代回交，比常規(guī)培育無核葡萄品種的方法節(jié)省了至少5年時(shí)間，極大地推動(dòng)了無核葡萄育種的進(jìn)程，在植物育種中具有十分重要的意義[1]。

我國自20世紀(jì)80年代末開展無核葡萄胚培養(yǎng)的研究，亓桂梅[2]、王勁松[3]、劉小寧[4]、郝燕[5]、蔣愛麗[6]、張劍霞[7]等先后對無核葡萄的胚培養(yǎng)技術(shù)和應(yīng)用做了大量研究，也培育出部分無核胚培養(yǎng)的新種質(zhì)。因此通過多組合雜交，胚培養(yǎng)結(jié)合分子輔助育種，培育大粒無核葡萄新品種，不僅可以改善葡萄種植品種單一的局面，而且大粒、無核、優(yōu)質(zhì)葡萄品種的大面積推廣應(yīng)用，所產(chǎn)生的生態(tài)效益、社會效益和經(jīng)濟(jì)效益極其顯著，生產(chǎn)前景廣闊。

1 雜交技術(shù)

1.1 雜交親本的選擇與選配

由于葡萄無核性狀遺傳的機(jī)制復(fù)雜，無核葡萄的育種難度很大，目前利用種子敗育型無核葡萄作母本，與無核白、奧蘭多無核、萊克蒙特等雜交以后易形成合子胚；以抗病性強(qiáng)的優(yōu)質(zhì)、大粒歐美種及歐亞種作父本，一般來講，不同的父本對胚的發(fā)育影響也不同，在田間進(jìn)行有性雜交，在受精胚敗育前采集田間幼果，無菌條件下進(jìn)行離體胚培養(yǎng)、以獲得雜種后代植株。

1.2 雜交前的準(zhǔn)備

根據(jù)育種目標(biāo)，確定雜交組合的數(shù)量。組合數(shù)和雜交花序的多少取決于育種目標(biāo)的綜合程度及性狀的遺傳性質(zhì)。葡萄種間雜交時(shí)，如果親本間花期相差過大，可以采用人工花期調(diào)整，將花期晚的用塑料棚覆蓋升溫，可以提高花期10 d以上，也可使用化學(xué)試劑提前打破葡萄休眠，使不同親本的花期一致。

1.3 雜交授粉

在父本開花前的1d，采下發(fā)育正常的整個(gè)花序，除去頂部，帶回室內(nèi)，摘下花蕾，平鋪于光滑的紙上，在室內(nèi)陰干，收集的花粉裝于小玻璃瓶中，用棉花塞緊瓶口，掛上標(biāo)簽，備用。因葡萄的花器小，且普遍存在“閉花受精”現(xiàn)象，一般最佳的去雄日期是開花前3～4 d，去雄先從花序的基部開始，去雄過程中適當(dāng)疏除部分過小和發(fā)育不完全的花或花序，然后套上硫酸紙袋；去雄后的2～3 d，當(dāng)部分花的柱頭上出現(xiàn)水滴狀粘液時(shí)是授粉的最佳時(shí)期，可利用橡皮蘸柱頭進(jìn)行授粉，重新套上紙袋。

2 胚挽救技術(shù)

2.1 胚挽救技術(shù)操作

進(jìn)行胚挽救的時(shí)間選擇很重要，一般受精時(shí)間短，胚珠小，在無菌臺操作相對困難，所以胚在胚珠發(fā)育的時(shí)間越長越好，但是無核葡萄育種的雜種胚，發(fā)育到一定時(shí)期會很快敗育，所以要在胚敗育前取出來進(jìn)行人工培養(yǎng)，通常在授粉后30～55 d左右，取雜交幼果的胚珠進(jìn)行培養(yǎng)，一般每隔5 d取一次幼果，首先用自來水沖洗果穗數(shù)次，然后用毛筆或軟刷蘸洗衣粉充分洗刷每個(gè)果粒，用自來水沖洗2 h，置于超凈工作臺上用75%的酒精處理30 s，用無菌水沖洗3次，再將果穗放入0.1%的升汞消毒液中浸泡7～8 min，用無菌水漂洗3～5次。將消毒后的葡萄果粒放在無菌載玻片上，用解剖刀切開，取出胚珠，每個(gè)三角瓶中放5～10枚，在Nitsch胚發(fā)育培養(yǎng)基培養(yǎng)60 d左右，然后在顯微鏡下剝?nèi)∨呓臃N到胚萌發(fā)和成苗培養(yǎng)基中，一般選用1/2MS培養(yǎng)基的較多，在胚挽救過程中，注意隨著胚的發(fā)育成長及時(shí)更換培養(yǎng)基。

2.2 胚挽救的影響因素

2.2.1 外源激素

外源激素在胚挽救中起決定性作用。不同種類、不同濃度的激素，不同的葡萄品種，激素的作用差異很大[8-12]，在胚珠內(nèi)胚初期培養(yǎng)階段，所需的激素簡單，一般不需在培養(yǎng)基中加外源激素，激素濃度如果較高，會引起幼胚形成愈傷組織，導(dǎo)致胚培養(yǎng)失敗[13]。胚經(jīng)胚珠內(nèi)培養(yǎng)后剝離出來再培養(yǎng)，是提高無核葡萄胚萌發(fā)率的一項(xiàng)重要措施。通常采用先胚珠內(nèi)培養(yǎng)，再剝?nèi)÷闩吲囵B(yǎng)的措施，來提高無核葡萄胚挽救的成功率。

2.2.2 組培環(huán)境

無核葡萄胚挽救受組培環(huán)境的影響較大，如溫度、光照、pH值等。胚發(fā)育階段應(yīng)給予充足的光照，胚萌發(fā)成苗階段初期則給予弱光，以利于胚芽生長發(fā)育，而后期則進(jìn)行強(qiáng)光培養(yǎng)以提高成苗質(zhì)量。培養(yǎng)室內(nèi)一般保持恒溫25℃下進(jìn)行培養(yǎng)，以滿足胚的生長需求。

2.3 胚挽救苗的移栽管理

試管苗的移栽是否成功是整個(gè)育種環(huán)節(jié)的關(guān)鍵。在胚挽救苗移出瓶之前，培育壯苗。選擇皮層生根5～6條，根長4 cm以上，有4～5片葉子的，苗高5 cm以上，葉色濃綠，無污染的壯苗，在生根30 d以后進(jìn)行移栽，將胚培養(yǎng)瓶苗拿到帶有遮陰網(wǎng)的大棚中進(jìn)行煉苗，前2 d不打開蓋子，2 d后將瓶蓋擰松，讓組培苗逐步適應(yīng)外界的環(huán)境條件，3 d后，用鑷子從試管中取出發(fā)根的小苗洗掉根部粘著的培養(yǎng)基，沖洗干凈，用800倍的多菌靈浸泡試管苗1～2 min，然后將小苗移入50孔的穴盤中，栽培基質(zhì)為進(jìn)口草炭土:珍珠巖（2:1），栽后用噴壺輕澆水。一周內(nèi)維持環(huán)境溫度在25℃左右，栽植后定期對幼苗噴灑殺菌劑，如多菌靈、甲基托布津等，每7 d噴一次。在移栽前，必須進(jìn)行光照和溫度的鍛煉，避免日燒。移入田間株行距保持0.3 m×0.8 m，前2周注意遮陰，保持土壤濕潤，使幼苗逐漸過渡到田間環(huán)境。隨著小苗的生長，一個(gè)月后進(jìn)行常規(guī)的肥水管理，后期注重多施磷鉀肥，使葡萄枝條充實(shí)。秋季落葉以后，將苗木起出進(jìn)行假植覆土，利于苗木安全越冬。

2.4 大田栽植及胚挽救苗的結(jié)果觀察

準(zhǔn)備用來栽植胚挽救雜交苗的大田，進(jìn)行深翻改土，充分施入腐熟好的有機(jī)肥，苗木按照0.5 m×2 m的株行距進(jìn)行定植，做好標(biāo)記，注重常規(guī)的田間管理。一般雜交苗2～3年就可結(jié)果，對于優(yōu)良的單株，可以采取種條進(jìn)行苗木繁育，分區(qū)域進(jìn)行選擇鑒定，測試比較不同生長條件、生態(tài)條件下不同株系高產(chǎn)性狀、果實(shí)性狀的表達(dá)，篩選出優(yōu)質(zhì)大粒無核的葡萄株系。