蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在畜禽遺傳育種中的應(yīng)用與展望

徐 哲， 李佳霄， 徐琳娜， 賀 花，楊 鵬， 雷初朝， 陳 宏， 黃永震*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院,陜西 楊凌 712100;2.甘肅省畜牧業(yè)產(chǎn)業(yè)管理局，蘭州 730000；3.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院,陜西 楊凌 712100)

前 言

隨著人類基因組序列的完成，生命科學(xué)研究由基因組時代進(jìn)入了后基因組時代。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)基因組學(xué)存在一定的局限性，于是更加貼近生命活動本質(zhì)的蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)運(yùn)而生。蛋白質(zhì)組學(xué)是后基因組學(xué)的一個重要組成部分，也是當(dāng)前分子生物學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。隨著相關(guān)技術(shù)的日臻成熟，近年來蛋白質(zhì)組學(xué)已在多個領(lǐng)域的分子水平研究中發(fā)揮重要作用。本文就當(dāng)前蛋白質(zhì)組學(xué)在家畜家禽生產(chǎn)、人類疾病等方面的應(yīng)用及現(xiàn)狀進(jìn)行綜述并分析其發(fā)展趨勢，以期對利用蛋白質(zhì)組學(xué)工具的研究者有所啟發(fā)。

1 蛋白質(zhì)組學(xué)概述

“蛋白質(zhì)組學(xué)”一詞最初由澳大利亞Macquaie大學(xué)的Wilkins和Williams于1994年提出[1]，最初定義為“一個基因組所表達(dá)的蛋白質(zhì)”。綜合考慮了蛋白質(zhì)組的動態(tài)性和易受環(huán)境影響性,目前認(rèn)為蛋白質(zhì)組是一個已知的細(xì)胞在某一特定時刻的包括所有亞型和修飾的全部蛋白質(zhì)[2]。蛋白質(zhì)組學(xué)就是從整體的角度分析細(xì)胞內(nèi)動態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成、表達(dá)水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系，提示蛋白質(zhì)的功能與細(xì)胞的活動規(guī)律[3]。蛋白質(zhì)組研究填補(bǔ)了基因組研究的空白，在蛋白質(zhì)水平上定量、動態(tài)、整體性地對生物體進(jìn)行研究。蛋白質(zhì)組研究數(shù)據(jù)與基因組數(shù)據(jù)相結(jié)合，將在以后的研究中發(fā)揮重要作用。

2 蛋白質(zhì)組學(xué)關(guān)鍵技術(shù)

蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展依靠一整套技術(shù)，按其流程可分為以下幾類。

2.1 蛋白質(zhì)分離技術(shù)

蛋白質(zhì)樣品制備是蛋白質(zhì)組研究的第一步，也是后續(xù)研究的基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)樣品制備包括以下步驟：對細(xì)胞、組織等樣品進(jìn)行破碎、溶解、失活和還原，斷開蛋白質(zhì)之間的連接鍵，提取全部蛋白質(zhì)，去除非蛋白質(zhì)部分[4]。樣品制備過程中要注意防止蛋白丟失，減少蛋白降解，降低各種非目標(biāo)性蛋白修飾，保證清除所有雜質(zhì)。目前常用制備方法有：硫酸銨沉淀法、三氯乙酸(TCA)沉淀法、丙酮沉淀法、TCA-丙酮沉淀法等。分離技術(shù)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的核心技術(shù)。目前研究中常用方法有：雙向凝膠電泳、高效液相層析(HPLC)、親和層析、毛細(xì)管電泳等[5]。

2.2 蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)

傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)包括Edman降解法測序和氨基酸組成分析。Edman降解法測序可得到準(zhǔn)確的肽序列，但存在測序速度較慢、費(fèi)用偏高等缺陷。隨著近年來不斷改進(jìn)，Edman降解法在測序速度和靈敏度上都有了很大提高，應(yīng)用范圍也有所拓展[6]。氨基酸組成分析法是利用不同蛋白質(zhì)具有特定的氨基酸組分的特征來鑒定蛋白質(zhì)。該方法耗資低，但速度較慢，所需蛋白質(zhì)或肽的量較大，在超微量分析中受限，且存在酸性水解不徹底或部分降解而產(chǎn)生氨基酸變異的缺點(diǎn)，一般需結(jié)合蛋白質(zhì)的其他屬性進(jìn)行鑒定。

質(zhì)譜分析技術(shù)與傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)鑒定方法相比具有靈敏、準(zhǔn)確、高通量、自動化等優(yōu)點(diǎn)。該方法可達(dá)到對蛋白質(zhì)的快速鑒定和高通量篩選，還能用于翻譯后修飾(糖基化、甲基化)的分析。但質(zhì)譜分析技術(shù)仍具有固有的局限性，比如不能區(qū)分Ile、Lys和Gln，有些肽固有序列不能測定等。

同位素標(biāo)記親和標(biāo)簽技術(shù)(ICAT)是目前蛋白質(zhì)組研究的核心技術(shù)之一，主要是用來研究不同蛋白質(zhì)組間的差異。這種方法具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確性，低表達(dá)的蛋白質(zhì)也可分析,它還可以直接測試混合樣品，并快速定性和定量鑒定低豐度蛋白質(zhì)，同時快速找出重要功能蛋白，在蛋白質(zhì)組研究中有巨大的應(yīng)用價值[4]。

2.3 蛋白質(zhì)相互作用的研究

酵母雙雜交系統(tǒng)是分析蛋白質(zhì)相互作用的一種有效方法，可大規(guī)模用于蛋白質(zhì)間相互作用的研究，且具有易于自動化高通量等特點(diǎn)，但存在假陽性和假陰性的現(xiàn)象。噬菌體展示技術(shù)是在編碼噬菌體外殼蛋白基因上連接一單克隆抗體的基因序列技術(shù)。該技術(shù)有高通量及簡便的特點(diǎn)，彌補(bǔ)了酵母雙雜交技術(shù)的一些限制。

2.4 生物信息學(xué)

隨著2-DE的發(fā)展，蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫自1996年也逐步發(fā)展起來。目前應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究的數(shù)據(jù)庫主要有SMSS-PROT、BLOCKS、SMART、PROSITE、WORLD-2DPAGE、EMBL、GenBank、DDBJ、ProClass、PRINTS、MASCOT、PROTOMAP、DOMO、PDB、NCBI等。

3 蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用

3.1 蛋白質(zhì)組學(xué)在動物遺傳改良方面的研究

3.1.1 蛋白質(zhì)組學(xué)在牛方面的研究 牛肉以其獨(dú)特的風(fēng)味和豐富的營養(yǎng)成分深受人們的歡迎，也推動了牛肉肉質(zhì)在分子水平上的研究，蛋白質(zhì)組學(xué)研究就是其中一種檢測、控制并最終提高肉質(zhì)的手段。其中，Bouley和Chambon等[7]利用2-DE和質(zhì)譜分析法繪制出了?？苿游锇爰‰旒∪獾牡鞍讏D譜，并定位出129個蛋白，其中很大一部分已被證實(shí)與細(xì)胞代謝有關(guān)，這為研究動物死后蛋白質(zhì)對其肉質(zhì)變化的控制機(jī)制打下基礎(chǔ)。Jia等[8]利用2-DE技術(shù)牛胸部最長肌肌漿蛋白，在活體和剛剛屠宰的嫩肉中發(fā)現(xiàn)大量的具有抗氧化作用的Peroxiredoxin-6，并提出可將其作為檢測肉質(zhì)嫩度的指標(biāo)。

牛奶中含有人體所需的所有必需氨基酸，且含有多種礦物元素，鈣磷比例適宜，是人體鈣的最佳來源。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，人們對于乳蛋白的研究也進(jìn)一步深入。Etske等[9]通過對糖基化修飾的研究發(fā)現(xiàn)，奶牛個體奶樣中κ-酪蛋白基因的多樣性及糖基化的κ-酪蛋白在奶樣乳蛋白中所占的比例可影響酪蛋白微團(tuán)的平均大小，且酪蛋白微團(tuán)平均直徑的大小與糖基化的κ-酪蛋白濃度大小成反比關(guān)系。這可能會為揭示出乳腺中經(jīng)糖基化翻譯后修飾的κ-酪蛋白群與酪蛋白微團(tuán)形成的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。Holland等[10]利用2-DE從牛乳中提取并定性出κ-酪蛋白，并檢測出其具有的5個Ο-糖基化的位點(diǎn)。Mollé等[11]通過ESI和MALDI離子化的方法提高了蛋白質(zhì)定性結(jié)果的準(zhǔn)確程度，共高分鑒定了39種牛乳蛋白質(zhì)。Affolter等[12]研究了牛乳中乳脂肪球膜(milk fat globule membrane，MFGM)組分，對牛乳清蛋白的濃縮物(whey protein concentrate，WPC)以及牛乳蛋白的濃縮物(milk protein concentrate，BMP)分別進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析，通過鳥槍法與液質(zhì)聯(lián)用結(jié)合的方式在WPC中鑒定出244種蛋白，在BMP中共鑒定出133種蛋白。Ciavardelli等[13]利用電感耦合等離子體質(zhì)譜法分析了牛乳中α-酪蛋白和β-酪蛋白中的磷酸化位點(diǎn)，使牛乳酪蛋白磷酸化位點(diǎn)的研究逐漸成為乳中酪蛋白組學(xué)研究的核心。

在牛的健康問題上，從經(jīng)濟(jì)和生產(chǎn)的角度而言，對牛健康危害最大的疾病是奶牛的乳房炎和肉牛的布氏桿菌病、結(jié)核病及沙門氏菌病。Timothy等[14]利用同位素相對標(biāo)記與絕對定量技術(shù)(iTRAQ)檢測被金黃色葡萄球菌感染的奶牛所產(chǎn)的奶中蛋白質(zhì)與健康奶牛乳汁蛋白的不同。目前共發(fā)現(xiàn)2 971種乳蛋白，其中有300多種蛋白被證明與宿主的防御系統(tǒng)有關(guān)，其中94種差異表達(dá)的機(jī)體防御蛋白在乳清、乳脂肪球膜和外來體三部分中分別選擇性表達(dá)。楊永新[15]、Reinhardt等[16]學(xué)者們在蛋白質(zhì)組水平上研究亞臨床和臨床乳房炎的奶牛抵御不同病原體的反應(yīng)，并篩選了潛在蛋白質(zhì)為生物標(biāo)記，為進(jìn)一步研究乳房炎的發(fā)病機(jī)理提供了方向。牛布氏桿菌是一類革蘭氏陰性短小桿菌，可引起母畜傳染性流產(chǎn)。在牛布氏桿菌的研究方面，利用免疫蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選布魯菌高免疫原性膜蛋白作為DNA疫苗的免疫抗原候選分子是預(yù)防此病的新途徑。郭振華等[17]對牛種布魯氏菌弱毒疫苗株s19與構(gòu)建株△s19全菌蛋白的比較蛋白質(zhì)組進(jìn)行了研究。趙永坤等[18]對感染牛布魯菌544A的巨噬細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行了分析。

3.1.2 蛋白質(zhì)組學(xué)在羊方面的研究 羊毛在紡織業(yè)中占據(jù)重要的位置，羊絨更是一種珍貴的紡織原料，一直被稱為紡織纖維中的“軟黃金”，曾在交易中以克論價。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在羊毛羊絨的研究中也起到了重要作用。Plowman[19]采用2-DE技術(shù)獲得羊毛蛋白圖譜，研究得出，一些來自于熱休克蛋白(HSPs)的B2A家族的蛋白質(zhì)可能與羊毛的卷曲度有關(guān)。楊潔等[20]應(yīng)用軟件分析不同細(xì)型細(xì)羊毛的2-DE凝膠圖譜，檢測出差異蛋白，對于通過調(diào)控這些差異蛋白來控制羊毛纖維直徑意義重大。楊嬌馥等[21]利用酵母雙雜交技術(shù)和免疫共沉淀技術(shù)鑒定了絨山羊黏附斑激酶(FAK)與TSC2基因之間具有直接作用關(guān)系，且確定了它們相互作用的區(qū)域。Youngmi等[22]利用基質(zhì)輔助激光解析飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)獲得蛋白指紋，定性鑒別羊絨和牦牛毛纖維的不同，發(fā)現(xiàn)有3個離子峰為羊絨纖維所特有，質(zhì)荷比分別為2 036、2 634和3 266，而質(zhì)荷比為2 530和2 519的2個離子峰可用作牦牛毛的指紋離子。這為區(qū)分羊絨纖維和牦牛毛纖維提供了方法。

蛋白質(zhì)組學(xué)在羊疾病中的應(yīng)用較為有限。Yang等[23]應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，利用患急性布魯氏菌病患者血清，鑒定了羊種布魯氏菌16M株的可溶性免疫反應(yīng)性蛋白?？诐h金[24]首次應(yīng)用了同位素標(biāo)記相對和絕對定量聯(lián)合二維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)體外分析被羊口瘡病毒感染后的山羊皮膚成纖維細(xì)胞中蛋白質(zhì)組學(xué)變化，發(fā)現(xiàn)了差異表達(dá)的蛋白與新陳代謝等反應(yīng)過程有關(guān)。

3.1.3 蛋白質(zhì)組學(xué)在豬方面的研究 肌肉中的纖維類型與肉質(zhì)之間存在密切的關(guān)系，而肌纖維類型又與其蛋白組成的多樣性和特異性有關(guān)。Bouley等[25]在研究蛋白質(zhì)組模型時，在骨骼肌纖維中發(fā)現(xiàn)了肌生成抑制素蛋白基因(MSTN)中11個堿基對的缺失突變，這個突變導(dǎo)致正常水平的無活性肌生成抑制蛋白的表達(dá)，該基因的表達(dá)可加快肌肉細(xì)胞的增長。Hatam和Sandra等[26]則利用iTRAQ同位素標(biāo)記蛋白定量技術(shù)，完成了豬骨骼肌中542個蛋白質(zhì)耳朵鑒定，其錯誤率低于5%，該實(shí)驗(yàn)的成功標(biāo)志著蛋白質(zhì)組學(xué)在肉質(zhì)檢測應(yīng)用中已日臻成熟。

在豬的疾病研究方面，劉永杰等[27]首次利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究BHK-21細(xì)胞被AsiaⅠ型口蹄疫病毒(FMDV)感染后蛋白質(zhì)組的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)病毒與細(xì)胞相互作用引起了細(xì)胞蛋白質(zhì)組表達(dá)模式的改變，這為揭示該病毒的致病機(jī)理提供了線索。陳煥春等[28]利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究了曾引起人發(fā)病死亡的2型豬鏈球菌(SS2)在37 ℃(對照條件)和42 ℃(豬發(fā)病條件)培養(yǎng)條件下的分泌蛋白圖譜差異，并鑒定了5個差異蛋白，為揭示SS2的致病機(jī)理、篩選藥物靶標(biāo)以及新型疫苗的研究提供了部分依據(jù)。王娜等[29]利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析了豬繁殖與呼吸綜合癥病毒071030株和福州株接種Marc-145細(xì)胞后蛋白質(zhì)組學(xué)差異，為進(jìn)一步研究PRRSV毒株間的致病力差異提供了分子基礎(chǔ)。

3.1.4 蛋白質(zhì)組學(xué)在雞生產(chǎn)方面的應(yīng)用 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展對于闡明雞蛋中蛋白質(zhì)的起源、改進(jìn)雞蛋生產(chǎn)環(huán)節(jié)、提高其營養(yǎng)價值和工業(yè)價值都有重大的意義和作用。Megan等[30]通過研究發(fā)現(xiàn)在禽類蛋殼最外層的角質(zhì)層上有大量未被發(fā)現(xiàn)的抗菌的蛋白質(zhì)成分，可防止外界微生物對蛋內(nèi)環(huán)境的干擾。Sun等[31]利用無標(biāo)記的蛋白定量質(zhì)譜分析法對在同一子宮流體中作用下形成的高強(qiáng)度蛋殼和低強(qiáng)度蛋殼中的基質(zhì)蛋白質(zhì)豐度進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)決定蛋殼強(qiáng)度的因素有可能會是蛋白豐度。Wang等[32]通過對原雞雞蛋、正常白殼蛋、正常褐殼蛋等6種雞蛋中的蛋白成分做了對比分析，發(fā)現(xiàn)有19種高豐度蛋白在6個蛋品種中具有顯著差異。該研究進(jìn)一步說明了蛋白的含量才是區(qū)分不同蛋品種的決定因素。Larbi等[33]通過對處于無菌環(huán)境、無特定病原體環(huán)境和正常環(huán)境的母雞所產(chǎn)蛋中蛋清蛋白抗性進(jìn)行對比研究，得出在排卵孵化期輔以適度的外界細(xì)菌刺激會使雞蛋的免疫能力加強(qiáng)的結(jié)論。Sophie等[34]對孵化12 d后的受精蛋和非受精蛋的卵黃蛋白成分含量的變化進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)69種蛋白在2種情況下都出現(xiàn)含量差異，這對孵化過程中胚胎蛋白的變化和食用蛋儲存過程中蛋白質(zhì)變化的研究都有一定的借鑒作用。

3.2 蛋白質(zhì)組學(xué)在人類疾病中的應(yīng)用

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)又名震顫麻痹，是一種與年齡相關(guān)的發(fā)生于錐體外系的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，臨床癥狀為靜止性震顫、運(yùn)動遲緩、肌僵直和姿勢步態(tài)異常等。PD被認(rèn)為是一種腦蛋白處理障礙性疾病，要全面深入疾病現(xiàn)象及防護(hù)作用機(jī)制，必然要在整體蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)水平上對參與的蛋白質(zhì)進(jìn)行研究。Basso等[35]對PD患者黑質(zhì)致密部進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)線粒體中錳超氧化物歧化酶和二氫化喋啶還原酶增加。在進(jìn)一步研究中，鑒定了44個蛋白質(zhì)，其中9個在PD患者中發(fā)生了差異性表達(dá)。Wemer等[36]在PD患者黑質(zhì)致密部鑒定了16個差異表達(dá)蛋白，表明氧化應(yīng)激參與PD的病理學(xué)改變。Yingjun等[37]通過同位素標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)在PD患者黑質(zhì)中鑒定出11個差異表達(dá)蛋白，其中α-B晶狀體蛋白(Cryab)明顯上調(diào)，提示Cryab可能與在PD患者多巴胺能神經(jīng)元退變過程中神經(jīng)膠質(zhì)的病理學(xué)改變有關(guān)。

炎癥性腸炎(inflammatory bowel disease，IBD)是一種自身免疫性疾病，由諸多原因共同作用而致病。利用蛋白質(zhì)組學(xué)及其相關(guān)技術(shù)來研究IBD，有利于IBD特異性標(biāo)志物的篩選、IBD治療靶點(diǎn)的確定以及判斷其病情發(fā)展情況，進(jìn)一步了解IBD的發(fā)病機(jī)制，為其診斷、治療、預(yù)后帶來新的思路。Hatsugai等[38]選入17例潰瘍性結(jié)腸炎(UC)患者，13例克羅恩病(CD)患者和17名健康對照者，對其外周血細(xì)胞中的蛋白質(zhì)進(jìn)行對比分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)276個蛋白點(diǎn)能明顯區(qū)分UC和CD患者，更進(jìn)一步選擇58個蛋白點(diǎn)對于鑒別疾病具有較高的優(yōu)越性。Chen等[39]使用大腸桿菌蛋白質(zhì)組芯片作為篩選和鑒定IBD血清標(biāo)志物的蛋白質(zhì)組學(xué)方法，最終確定了2套血清抗體，分別為區(qū)分CD患者與健康對照組的新型生物標(biāo)記物，CD患者與UC患者的新型生物標(biāo)記物?？盗恋萚40]選入4例CD患者和4名正常成年人，將其血清樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)CD患者血清樣品中膠號為973的蛋白點(diǎn)過表達(dá)，用質(zhì)譜鑒定為CD45，提示CD患者血清樣品中CD45的過表達(dá)可能在免疫系統(tǒng)失衡中發(fā)揮一定作用。

作為世界五大絕癥(運(yùn)動神經(jīng)元癥、癌癥、艾滋病、白血病、類風(fēng)濕)之一，癌癥已成為全世界人類最大的致死原因，其日益增長的發(fā)病率和高死亡率也推動著蛋白質(zhì)組學(xué)在癌癥方面的研究。Kageyama等[41]對獲得的癌變和非癌變膀胱上皮組織樣品用定量Western blotting技術(shù)進(jìn)行比較，分析顯示CRT在膀胱癌組織中增加，說明CRT可能作為檢測膀胱癌的標(biāo)志物。Ye等[42]通過2-DE聯(lián)合基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)分析人原發(fā)性肝癌組織與正常人體肝臟組織之間的蛋白差異，發(fā)現(xiàn)了如磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白1等差異蛋白，有助于對肝癌發(fā)生機(jī)制的研究及預(yù)測治療。Chan等[43]采用2-DE和質(zhì)譜分析比較了96例胃癌患者根治性胃切除手術(shù)前后以及32例胃潰瘍患者和52例健康體檢者的血清淀粉樣蛋白A(SAA)水平，發(fā)現(xiàn)胃癌患者SAA水平顯著高于健康體檢者和胃潰瘍患者，且與腫瘤分期和部位有關(guān)。

4 前景與展望

近年來，蛋白質(zhì)組學(xué)作為一門新興學(xué)科，雖然剛剛起步，卻為大規(guī)模直接研究基因功能提供了強(qiáng)有力的工具。目前，蛋白質(zhì)組學(xué)在農(nóng)業(yè)科學(xué)研究的多個領(lǐng)域得到初步應(yīng)用，但低豐度蛋白的獲得和植物蛋白的定量仍然是一個巨大的挑戰(zhàn)。蛋白質(zhì)組學(xué)不僅為闡明生命活動規(guī)律提供物質(zhì)基礎(chǔ)，也能為探討重大疾病的機(jī)理、疾病診斷、疾病防治和新藥開發(fā)提供重要的理論依據(jù)和實(shí)際解決途徑，解決了在蛋白質(zhì)水平上大規(guī)模直接研究基因功能的問題。因此，要不斷加強(qiáng)國際間的學(xué)術(shù)合作及資源交流，建立全球共享的數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)，最終揭示基因組的結(jié)構(gòu)與功能。隨著蛋白質(zhì)組研究的深入發(fā)展，相信蛋白質(zhì)組學(xué)必將在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥開發(fā)等領(lǐng)域有重大突破。