PCR-DGGE技術(shù)及其在豬腸道微生物菌群變化的研究進(jìn)展

侯美如 尹珺伊 王 巖 劉 宇 陳楠楠 秦平偉 馮萬宇 張 艷 史同瑞

（黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所，黑龍江齊齊哈爾 161006）

動物腸道菌群是一個非常復(fù)雜多樣的生物群體。以哺乳動物為例，其腸道微生物分屬400多種不同的微生物，每克大腸內(nèi)容物的細(xì)菌含量高達(dá)1010個。這些微生物相互依賴、相互制約，對宿主的健康和物質(zhì)的營養(yǎng)代謝起著重要的作用。因此，動物腸道菌群的組成及相互作用，和腸道功能的健康有著密切的聯(lián)系，但傳統(tǒng)的微生物鑒別方法，是以細(xì)菌分離、培養(yǎng)為基礎(chǔ)，進(jìn)行染色鏡檢，生化鑒定，由于在腸道中90%以上的微生物是嚴(yán)格厭氧菌，培養(yǎng)條件苛刻，僅有少數(shù)可在實(shí)驗(yàn)室條件下被分離純化，往往不能客觀、真實(shí)地反映腸道菌群數(shù)量及多樣性[1-2]。

分子生物學(xué)的發(fā)展及基因庫的不斷完善，為細(xì)菌多樣性分析提供了有效的技術(shù)手段，如rRNA/rDNA序列分析、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性分析（RADP）、限制性內(nèi)切酶酶切片段長度多態(tài)性分析（RFLP）、變性梯度凝膠電泳（DGGE）等。這些技術(shù)的出現(xiàn)彌補(bǔ)了傳統(tǒng)研究方法的不足，同時提供了一種對微生物群落進(jìn)行定性描述和定量分析的方法，為研究微生物的種族發(fā)育關(guān)系提供了科學(xué)的分類依據(jù)。

變性梯度凝膠電泳（Denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE），是由Fisher等人1983年創(chuàng)立并用于檢測DNA突變的技術(shù)。隨后，Muyzer等人在1993年首次將該技術(shù)用于研究土壤的微生物區(qū)系，結(jié)果證實(shí)了該技術(shù)在研究微生物菌群分析和多樣性方面的優(yōu)勢[3]。

1 PCR-DGGE技術(shù)的基本原理

在一般的聚丙烯酰胺凝膠電泳中，雙鏈DNA的分子大小和電荷是影響其遷移行為的主要因素。根據(jù)遷移行為的差異，便可對不同大小的DNA片段進(jìn)行區(qū)分，同樣大小的DNA片段由于遷移行為相同，而無法被區(qū)分。PCR-DGGE技術(shù)在普通聚丙烯酰胺凝膠配方的基礎(chǔ)上，增加了尿素和甲基酰胺，形成變性梯度凝膠。

序列組成不同的雙鏈DNA片段，具有不同的解鏈區(qū)域及其不同解鏈區(qū)域的解鏈濃度。在DGGE電泳過程中，凝膠濃度呈現(xiàn)梯度變化，變性濃度由低至高，濃度最初比較低，無法達(dá)到雙鏈DNA片段最低的解鏈區(qū)域而完成解鏈，DNA片段的這段遷移行為與在一般的聚丙烯酰胺凝膠中是一樣的；隨著變性濃度的變化，當(dāng)DNA片段到達(dá)一個特定的濃度位置，變性濃度滿足雙鏈DNA片段最低的解鏈區(qū)域解鏈時，DNA片段便發(fā)生解鏈。

由于DNA片段發(fā)生部分解鏈，其在凝膠中的遷移速率急劇下降。因此，序列不同而長度相同的DNA片段將在各自特定的凝膠濃度位置上發(fā)生解鏈行為，根據(jù)它們在凝膠的不同位置而被分開。

當(dāng)DNA片段在其最高解鏈區(qū)域的變性濃度時，將完全解鏈成單鏈分子，它們將在凝膠中繼續(xù)遷移。當(dāng)同等長度、不同序列的DNA片段的差異序列存在于最高的解鏈區(qū)域時，便無法將它們區(qū)別開來。GC片段夾子的引入，使最高解鏈區(qū)域轉(zhuǎn)為GC夾子處，而GC夾子的解鏈變性濃度很高，從而避免了DNA分子被完全解鏈為單鏈分子的問題，使存在差異序列的DNA片段基本上都能被區(qū)分開來。

2 DGGE在豬腸道微生物菌群變化的研究應(yīng)用

2.1 不同時間點(diǎn)胃腸道菌群變化

Simpson等[4]首次運(yùn)用PCR-DGGE技術(shù)分析豬腸道微生物菌群，研究隨著豬年齡和日糧的變化，不同個體的腸道及糞樣微生物菌群的結(jié)構(gòu)差異。從圖譜上發(fā)現(xiàn)，在斷奶前后及育肥期，豬腸道微生物菌群存在差異，都具有特殊條帶，且斷奶對豬腸道細(xì)菌種群影響較大。

朱偉云等[5]對12頭仔豬從斷奶第1天開始采集糞樣，采用DGGE技術(shù)對糞樣中的細(xì)菌菌群變化進(jìn)行跟蹤，結(jié)果顯示，仔豬斷奶后糞樣中的細(xì)菌群落迅速發(fā)生了復(fù)雜的變化，相似度分析也證實(shí)了斷奶第1天和斷奶后第13天糞樣細(xì)菌群落發(fā)生很大變化。一些在仔豬斷奶后第1天出現(xiàn)的優(yōu)勢條帶在斷奶后第6天消失，很多條帶于斷奶后第13天消失，與此同時，在斷奶后第6、7或13天一些新的條帶陸續(xù)出現(xiàn)，隨時間延長，條帶的數(shù)量逐漸增多。

Janczyk等運(yùn)用DGGE技術(shù)對仔豬回腸食糜樣品進(jìn)行分析，在斷奶后1～2天出現(xiàn)唾液乳桿菌（Lactobacillus salivarius）條帶，在斷奶后第1天和第11天出現(xiàn)卷曲乳桿菌（Lactobacillu scrispatus）所對應(yīng)的條帶，Lactobacillus sobrius為所有動物的DGGE圖譜中最優(yōu)勢條帶的相似菌。

2.2 不同位置內(nèi)容物菌群的變化

Simpson等[6]采集1頭5月齡仔豬不同腸道位置的內(nèi)容物及其黏膜樣本，經(jīng)DGGE圖譜分析，除盲腸外，其他位于同一腸段的內(nèi)容物及其黏膜處具有相近的圖譜，不同腸道位置的圖譜存在較大差異，位置相距越遠(yuǎn)，之間的相似性指數(shù)就越小，由此可以發(fā)現(xiàn)不同部位腸道菌群分布存在差異，解剖結(jié)構(gòu)相距越遠(yuǎn)，菌群相似度越低。

吳高鋒[7]應(yīng)用PCR-DGGE技術(shù)對兩窩（A、B兩組）共16頭不同時間段的健康仔豬不同腸段（十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸、直腸）位置中的微生物菌群結(jié)構(gòu)多樣性及其動態(tài)變化進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)出生后數(shù)小時的仔豬（未吃初乳）腸道便有少量細(xì)菌定植，隨著日齡的逐漸增長，仔豬不同腸段中的細(xì)菌種類及數(shù)量也隨之增多。3日齡仔豬腸道就已經(jīng)存在了相當(dāng)豐富的細(xì)菌種類及數(shù)量。腸道中細(xì)菌種類及數(shù)量到9日齡、15日齡時變化逐漸變緩，20日齡有所增加，但28日齡又有所下降，35日齡逐漸趨于穩(wěn)定。在各腸段中，十二直腸及空腸的細(xì)菌種類和數(shù)量是相對較少的，以盲腸及結(jié)腸為最多。

2.3 外源添加物對胃腸道內(nèi)容物細(xì)菌群落的影響

Collier等[8]于2003年運(yùn)用PCR-DGGE技術(shù)研究日糧添加抗菌素對豬回腸微生物區(qū)系的影響。抗菌素的添加可有效抑制腸道中部分細(xì)菌的生長，減少了因腸道免疫應(yīng)答而引起的營養(yǎng)物質(zhì)和能量的消耗。從圖譜中亦可以看出，添加抗菌素組的腸道細(xì)菌條帶數(shù)量和總DNA濃度減少。同時，在添加抗菌素的過程中，豬腸道中的細(xì)菌總數(shù)明顯降低，而乳酸菌的數(shù)量明顯增加，進(jìn)一步證明抗菌素可以明顯促進(jìn)豬只生長。

Konstantinov等[9]運(yùn)用DGGE技術(shù)研究甜菜渣和果寡糖等可發(fā)酵碳水化合物對仔豬糞樣菌群多樣性的影響，結(jié)果表明，飼喂組與對照組相比，仔豬糞樣中菌群多樣性增加，并且其細(xì)菌區(qū)系也較快達(dá)到穩(wěn)定。經(jīng)分析DGGE圖譜中的13條優(yōu)勢條帶與Clostridium coccoides和Clostridium leptum的相似度為91%～97%，由此推測，這些細(xì)菌可能在仔豬利用日糧纖維上起了作用。同樣朱偉云等的研究[5]對3窩12頭仔豬分別飼喂3種不同的日糧，以基本日糧配果寡糖及甜菜汁的b組，在斷奶第1周內(nèi)仔豬糞樣中的細(xì)菌群落發(fā)生急劇變化而后緩慢變化，其推測可能與其日糧中果寡糖有關(guān)。

Wang[10]等運(yùn)用DGGE技術(shù)研究飼喂全株水稻后豬結(jié)腸內(nèi)容物和糞樣中菌群的組成，發(fā)現(xiàn)飼喂全株水稻日糧的豬糞樣樣品的DGGE圖譜條帶數(shù)量和Shannon多樣性指數(shù)顯著增加，但隨著日糧中全株水稻比例的增加，其結(jié)腸內(nèi)容物樣品的DGGE條帶數(shù)量和多樣性指數(shù)卻逐漸較少。

針對豬場中采用“早期補(bǔ)飼、早期斷奶”的飼養(yǎng)模式而引起的仔豬腹瀉問題，姚文等[11]利用PCR-DGGE結(jié)合16S rDNA序列技術(shù)，通過研究該飼喂模式下仔豬腸道中微生物種群的動態(tài)變化情況，科學(xué)闡明了微生物變化與仔豬腹瀉的關(guān)系。研究表明，仔豬飼喂開食料前，腸道微生物的優(yōu)勢譜帶為單一的大腸桿菌；飼喂開食料后，仔豬腸道微生物區(qū)系變得復(fù)雜且多樣，但這種變化較為短暫，導(dǎo)致仔豬呈現(xiàn)短期腹瀉的癥狀。斷奶后仔豬腸道微生物圖譜多樣性指數(shù)穩(wěn)定，穩(wěn)定的微生物區(qū)系多樣性可緩解斷奶后仔豬應(yīng)激產(chǎn)生的腹瀉癥狀，隨著仔豬日齡的增長，腸道中微生物區(qū)系組成也逐漸穩(wěn)定。

3 展望

PCR-DGGE技術(shù)在微生物區(qū)系分析中，具有較大的優(yōu)勢，無需進(jìn)行微生物培養(yǎng)，打破了不可培養(yǎng)微生物的限制。在自然界中尚不可培養(yǎng)的微生物占比85%～99%，而一些可培養(yǎng)的微生物對生長環(huán)境要求較為苛刻，給多態(tài)性和動態(tài)分析帶來了限制。DGGE技術(shù)還可以與其他方法結(jié)合，如傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)、克隆測序技術(shù)、雜交技術(shù)、實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)，更加全面系統(tǒng)地展示微生態(tài)菌落的構(gòu)成及優(yōu)勢菌群的分析，更加真實(shí)地反映微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的本質(zhì)。

[1]Zoetendal EG,Collier CT,Koike S,et al.Molecular ecological analysis of the gastrointestinal microbiota:a review[J].Journal of Nutrition,2004,134(2):465-472.

[2]Savage DC.Microbial ecology of the gastrointestinal tract[J].Annual Review of Microbiology,1977,31(31):107-133.

[4]Mccracken VJ,Simpson JM,Mackie RI,et al.Molecular ecological analysis of dietary and antibiotic-induced alterations of the mouse intestinal microbiota[J].Journal of Nutrition,2001,131(6):1862-1870.

[5]朱偉云,姚文,毛勝勇.變性梯度凝膠電泳法研究斷奶仔豬糞樣細(xì)菌區(qū)系變化[J].微生物學(xué)報,2003,43(4):503-508.

[6]Simpson JM,Mccracken VJ,White BA,et al.Application of denaturant gradient gel electrophoresis for the analysis of the porcine gastrointestinal microbiota[J].Journal of Microbiological Methods,1999,36(3):167-179.

[7]吳高鋒.應(yīng)用PCR-DGGE技術(shù)對不同日齡仔豬腸道菌群分布規(guī)律的研究[D].鄭州:河南農(nóng)業(yè)大學(xué),2009.

[8]Cocolin L,Manzano M,Cantoni C,et al.Denaturing gradient gel electrophoresis analysis of the 16S rRNA gene V1 region to monitor dynamic changes in the bacterial popularion during fermentation ofItalian sausages [J].Applied and Environmental Microbiology,2001,67(11):5113-5121.

[9]Konatantinov SR,Zhu WY,Willians B A,et al.Effect of fermentable carbohydrates on piglet fecal bacterial communites as revealed by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of 16S ribosomal DNA[J].FEMS Microbiology Ecology,2003,43:225-235.

[10]Wang HF,Zhu WY,Yao W,et al.DGGE and 16S rDNA sequencing analysis of bacterial communities in colon content and feces of pigs fed whole crop rice[J].Anaerobe,2007,13(3):127-133.

[11]姚文,朱偉云,毛勝勇.16S rDNA技術(shù)研究新生腹瀉仔豬糞樣細(xì)菌區(qū)系的多樣性變化[J].微生物學(xué)報,2006,46(1):150-154.