大黃和水蛭含藥血清藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)研究

高旭光， 翟文生， 楊濛， 馬靜， 宋純東， 李廣

大黃、水蛭的經(jīng)典配伍應(yīng)用見抵當(dāng)湯和抵當(dāng)丸，出自東漢張仲景《傷寒雜病論》，主治太陽蓄血、陽明蓄血證，具有活血通絡(luò)逐瘀之效。本科常用大黃和水蛭配伍治療IgA腎病和紫癜性腎炎可明顯減輕血尿和蛋白尿，改善腎病患兒的預(yù)后[1-2]。用藥后大黃和水蛭有效成分能否入血，目前尚缺乏相關(guān)的血清藥物實(shí)驗(yàn)研究，2015年版《中國藥典》以大黃素、大黃酚為指標(biāo)對(duì)大黃進(jìn)行質(zhì)量控制[3]，次黃嘌呤為水蛭中所含的有效成分之一[4-5]。故我們采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatographic，HPLC)檢測(cè)大黃組和水蛭組大鼠血清的有效成分大黃酸和大黃素、次黃嘌呤，為臨床用藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠36只，1.5～2月齡，體質(zhì)量(200±20)g，由鄭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供[合格證編號(hào)：SCXK(豫)2010-0002]。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品 水蛭顆粒、大黃顆粒(江陰天江藥業(yè)有限公司)；生理鹽水(四平巨能藥業(yè)有限公司)；10%水合氯醛。以上藥物均購于河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥房。

1.3 主要試劑 大黃酸(110757-201009，純度>98%)，大黃素(110756-201010，純度>98%)，次黃嘌呤(140661-201006，純度>99.6%)，均購自中國藥品生物制品檢定所；色譜純：甲醇、乙腈；實(shí)驗(yàn)用水：純凈水，由河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.4 主要儀器 超高效液相色譜儀：Waters Acquity H-class；TGL-16B離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；QL-901混勻儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；BF-2000氮?dú)獯蹈蓛x(北京八方世紀(jì)科技有限公司)；電子天平：Sartorius-CP225D(1/10萬)(德國賽多利斯)。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 含藥血清的制備 36只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、大黃組和水蛭組各12只。參照臨床成人用藥劑量估算為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用藥劑量，給藥劑量=臨床常用量×動(dòng)物等效面積系數(shù)×培養(yǎng)基內(nèi)血清稀釋度[6]。查表得70 kg人與200 g大鼠的等效面積系數(shù)為0.018，選用水蛭3 g，大黃10 g。根據(jù)大鼠灌胃常用量10～20 mL/kg及藥物的最大可溶解度，在本實(shí)驗(yàn)中選用的等容灌胃量為20 mL/kg。將水蛭、大黃顆粒劑制成混懸液：大黃顆粒制成0.25 g生藥/mL，水蛭顆粒劑制成濃度0.08 g生藥/mL。對(duì)照組同法灌胃等容積生理鹽水。

在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，連續(xù)灌胃10 d，在灌服最后1劑后2 h，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，靜置2 h，3 000 r/min離心10 min后取上層血清，0.22 μm過濾除菌，分裝，-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 對(duì)照組血清供試品的制備 取對(duì)照組血清0.3 mL，加甲醇乙腈(3∶1)1.1 mL，渦旋1 min，15 000 rpm離心15 min，吸上清液，用0.22 μm濾膜過濾，取0.7 mL濾液，于40 ℃氮?dú)饬飨麓蹈桑瑲埩粑镉?00 μL流動(dòng)相溶解，渦旋1 min，15 000 rpm離心10 min，吸上清液，按上述方法測(cè)定。

1.5.3 大黃顆粒血清中大黃酸、大黃素的檢測(cè)

1.5.3.1 血清樣品的處理取 大黃顆粒血清樣品0.3 mL，加乙腈1.1 mL，余下制備步驟同對(duì)照組血清供試品的制備。

1.5.3.2 色譜條件 ACQUITY UPLC BEH-C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸溶液(85∶15)；流速：0.6 mL/min；檢測(cè)波長：254 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

1.5.3.3 大黃素、大黃酸對(duì)照品的制備 取大黃素、大黃酸適量，精密稱定，分別為0.51 mg、0.74 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得。

1.5.4 水蛭顆粒血清中次黃嘌呤的檢測(cè)

1.5.4.1 血清樣品的處理 取水蛭顆粒血清樣品0.3 mL，加乙腈1.1 mL，余下制備步驟同對(duì)照組血清供試品的制備。

1.5.4.2 色譜條件 ACQUITY UPLC BEH-C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相：甲醇-水(10∶90)；流速：0.3 mL/min；檢測(cè)波長：254 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：0.5 μL。

1.5.4.3 次黃嘌呤對(duì)照品的制備 取次黃嘌呤適量，精密稱定為1.91 mg，置50 mL容量瓶中，加稀乙醇(50%)定容至刻度，即得。

2 結(jié)果

2.1 大黃顆粒血清中大黃酸、大黃素的檢測(cè)結(jié)果 血清對(duì)大黃酸的檢出有一定的干擾，大黃顆粒血清供試品未檢出大黃酸；但對(duì)大黃素檢出無干擾，血清中可以檢測(cè)到大黃素。分別見圖1～4(見封三)。

2.2 水蛭顆粒血清中次黃嘌呤的檢測(cè)結(jié)果 血清對(duì)次黃嘌呤的檢出無干擾，大鼠血清中次黃嘌呤色譜峰較高，可能是水蛭的入血成分，也可能是水蛭顆粒給藥后大鼠自身產(chǎn)生的成分。分別見圖5～7(見封三)。

3 討論

腎臟疾病發(fā)病率不斷升高，已經(jīng)成為一種公共衛(wèi)生問題[7]。IgA腎病和紫癜性腎炎是小兒腎臟病中常見的類型，都需要長期治療，兩者均為腎小球系膜區(qū)或伴有毛細(xì)血管襻以IgA為主的免疫球蛋白沉積或僅有IgA沉積，腎小球系膜細(xì)胞增生及細(xì)胞外基質(zhì)積聚，導(dǎo)致腎小球腎炎，是腎臟病進(jìn)展的主要病理過程[8-10]，有效阻止系膜細(xì)胞增生及細(xì)胞外基質(zhì)積聚，防止腎小球腎炎發(fā)展，目前尚無理想治療方法。

從臨床表現(xiàn)和疾病進(jìn)程分析，IgA腎病和紫癜性腎炎應(yīng)歸屬祖國醫(yī)學(xué)中“尿血”“腰痛”“水腫”“虛勞”“關(guān)格”等范疇。腎病患兒病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)，血瘀證是最重要的標(biāo)實(shí)證，瘀血為疾病本身的病理產(chǎn)物，也是貫穿腎病始終的病理因素，瘀血不散，血不歸經(jīng)，進(jìn)一步損傷脈絡(luò)，而造成腎病蛋白尿、血尿反復(fù)不愈，故瘀血阻滯是導(dǎo)致本病反復(fù)發(fā)作或久治不愈的關(guān)鍵因素之一?！端貑枴ふ{(diào)經(jīng)論》云:“瘀血不去，其水乃成”，“孫絡(luò)水溢則經(jīng)有留血”。《金匱要略》提及“血不利則為水，名曰血分”提示脈道血液運(yùn)行障礙發(fā)為水證，易致水腫。唐宗海在《血證論》指出“血與水素本不相離，病血者未嘗不病水，病水者未嘗不病血”，“瘀血化水，亦發(fā)水腫，血積即久，亦能化為痰水”，明確提出腎病與瘀血存在密切聯(lián)系，血凝則水停，水泛致血瘀?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，近代醫(yī)家更加重視對(duì)腎病血瘀證的研究，豐富了中醫(yī)腎病血瘀證的理論。腎臟病瘀血形成機(jī)制很多，就IgA腎病和紫癜性腎炎而言其瘀血的來源主要有四：其一，來源于出血。大部分該病患者均表現(xiàn)為不同部位的出血，出血必留瘀，瘀血阻絡(luò)，妨礙氣血運(yùn)行，新血不能歸經(jīng)而外溢肌膚，形成紫斑，即所謂離經(jīng)之血便為瘀血。其二，來源于熱邪。熱邪為腎炎的啟動(dòng)病因，熱邪熾盛迫血妄行，血不循經(jīng)而為瘀。其三，來源于濕邪。濕邪有形，阻礙氣機(jī)，氣滯血瘀。其四，來源于臟腑氣機(jī)紊亂。病程日久，或氣虛或氣滯或有形之邪阻滯，血運(yùn)失常而成瘀。大黃和水蛭配伍應(yīng)用是我們20余年的臨床經(jīng)驗(yàn)，臨床中發(fā)現(xiàn)大黃和水蛭配伍可以改善IgA腎病和紫癜性腎炎的血瘀狀態(tài)，減少血尿和蛋白尿，灌藥后血清中是否含有大黃和水蛭的主要成分。我們采用HPLC檢測(cè)大黃、水蛭灌胃的大鼠血清中的大黃酸、大黃素和次黃嘌呤，為臨床用藥提供理論依據(jù)。

檢測(cè)結(jié)果顯示，大黃組大鼠血清含有大黃素，雖然血清對(duì)大黃酸的檢出有一定的干擾，未在血清樣品中檢出大黃酸，其原因可能有兩個(gè)：一是血清本身對(duì)大黃酸有一定的影響，二是大黃酸可能入血后含量太低以至于低于檢測(cè)限而未能檢出。但血清供試品中大黃素檢測(cè)存在，亦能說明大黃主要成分可以進(jìn)入大鼠血清；水蛭組在大鼠血清中次黃嘌呤色譜峰較高，可能是水蛭的入血成分，也可能是水蛭顆粒給藥后大鼠自身產(chǎn)生的成分，說明大鼠給藥后血清中含有水蛭主要成分次黃嘌呤，可以產(chǎn)生藥效作用。經(jīng)高效液相色譜法測(cè)定，證實(shí)了實(shí)驗(yàn)中的大鼠含藥血清含有大黃和水蛭的主要成分。